Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Investimento Estratégico em Ciências da Saúde Faculty Development Grant da Creighton University. A cepa B. burgdorferi RpoC-His10X foi gentilmente cedida pelo Dr. D. Scott Samuels da Universidade de Montana. A cepa de E. coli que abriga o plasmídeo pMAL-C5X que codifica um alelo rpoD marcado com proteína ligadora de maltose foi gentilmente cedida pelo Dr. Frank Gherardini do Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

1. Purificação da RNA polimerase e preparação do estoque de RNA polimerase
<ol><li>Coletar o pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) a uma densidade de2-4 x 107 células/mL utilizando protocolos de coleta celular previamente descritos28,29. Realizar centrifugação a 10.000 x g a 4 °C por 30 min em...

<ol>
	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsing+fever+Borreliae:+A+global+review.">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li><li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Borrelia+species.">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li><li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi.">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector.">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li><li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH,+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression.">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).</li><li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks.">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).</li><li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+(p)ppGpp.">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).</li><li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi.">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Borrelia+burgdorferi+RelA/SpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation.">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).</li><li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi.">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li><li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li><li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi.">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi.">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li><li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+and+transcriptomics.">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li><li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete,+Borrelia+burgdorferi.">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li><li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi.">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9 (2016).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation.">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+and+complementation.">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li><li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li><li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

Ensaios de transcrição in vitro construídos usando o protocolo apresentado foram recentemente utilizados para estudar o papel de um fator de transcrição em B. burgdorferi e podem ser aplicados para construir experimentos semelhantes usando outros fatores de transcrição, fatores sigma e moléculas23. Uma vez que a RNA polimerase ativa de B. burgdorferi tenha sido obtida e sua atividade detectada, componentes e condições dentro dos ensaios de transcrição in ...

A doença de Lyme e a febre recidivante são causadas por patógenos espiroquetas dos gêneros Borrelia e Borreliella 1,2,3. A doença de Lyme é uma proeminente doença transmitida por vetores na América do Norte e, consequentemente, a Borreliella burgdorferi é um organismo modelo proeminente para estudar a biologia das espiroquetas 4,5. Investigações sobre os mecanismos de regulação transcricional de B. burgdorferi visam compreender melhor suas adaptações às mudanças no ambiente à medida que circula entre seu carrapato vetor e hospedeiros mamíferos 6,7. Alterações no pH, temperatura, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes, ácidos graxos de cadeia curta, ácidos orgânicos e níveis de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono modulam a expressão de genes importantes para a sobrevivência de B. burgdorferi em seu artrópodes vetor e infectar animais 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. A ligação dessas respostas a estímulos com mecanismos regulatórios tem sido um aspecto importante na pesquisa com B. burgdorferi19.
Fatores de transcrição e fatores sigma controlam a transcrição de genes que realizam processos celulares. As espiroquetas de Lyme e febre recidivante abrigam um conjunto relativamente escasso de fatores de transcrição e fatores sigma alternativos. Apesar disso, existem complexas alterações transcricionais direcionando as respostas de B. burgdorferi ao ambiente20,21,22. Os mecanismos específicos que conduzem as mudanças transcricionais em B. burgdorferi em resposta a mudanças ambientais permanecem obscuros. Ensaios de transcrição in vitro são ferramentas poderosas para o emprego de uma abordagem bioquímica para testar a função e os mecanismos regulatórios dos fatores de transcrição e fatores sigma23,24,25,26.
Um sistema de ensaio de transcrição in vitro utilizando a RNA polimerase de B. burgdorferi foi recentemente estabelecido24. Como as bactérias frequentemente têm fisiologias celulares únicas, RNA polimerases de diferentes espécies e gêneros respondem diferentemente às condições de purificação enzimática, armazenamento enzimático e tampão de reação27. B. burgdorferi também está geneticamente distante das muitas espécies bacterianas nas quais RNA polimerases têm sidoestudadas20. Aspectos da preparação enzimática, tais como condições de lise, lavagem e tampão de eluição, tampão de armazenamento, tampão de reação de transcrição in vitro e o método de construção do ensaio podem alterar a atividade da RNA polimerase. Neste trabalho, fornecemos um protocolo para a purificação da RNA polimerase e do fator sigma RpoD, a produção de molde linear de DNA de fita dupla e a construção de ensaios de transcrição in vitro para facilitar a reprodutibilidade entre laboratórios que utilizam este sistema. Detalhamos um exemplo de reação para demonstrar a faixa linear para transcrição dependente de RpoD e discutimos limitações e alternativas para essa abordagem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

Borreliella burgdorferi é um patógeno bacteriano com repertórios metabólicos e genômicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados e carrapatos e remodela dramaticamente seu perfil transcricional para sobreviver em ambientes díspares durante a infecção. Um foco dos estudos de B. burgdorferi é entender claramente como a bactéria responde ao seu ambiente através de mudanças transcricionais. Ensaios de transcrição in vitro permitem dissecar bioquimicamente os mecanismos básicos de regulação transcricional. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo purificação e armazenamento da polimerase de RNA de B. burgdorferi , purificação do fator sigma, geração de molde de DNA e ensaios de transcrição in vitro . O protocolo descreve o uso da RNA polimerase purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC é uma cepa publicada anteriormente que abriga um 10XHis-tag no gene rpoC que codifica a maior subunidade da RNA polimerase. Os ensaios de transcrição in vitro consistem na RNA polimerase purificada da cepa 5A4-RpoC, uma versão recombinante do fator sigma housekeeping RpoD e um molde de DNA de fita dupla gerado por PCR. Enquanto as técnicas de purificação de proteínas e as abordagens para montagem de ensaios de transcrição in vitro são conceitualmente bem compreendidas e relativamente comuns, as considerações de manuseio para RNA polimerases frequentemente diferem de organismo para organismo. O protocolo aqui apresentado destina-se a estudos enzimáticos da RNA polimerase de B. burgdorferi. O método pode ser adaptado para testar o papel de fatores de transcrição, promotores e modificações pós-traducionais na atividade da RNA polimerase.

Em uma reação de transcrição in vitro em que a etapa limitante da reação é o início da transcrição mediada pelo fator sigma, a atividade de transcrição deve aumentar linearmente com a quantidade de fator sigma. Apresentamos a preparação de experimentos de transcrição in vitro testando uma faixa de concentrações de RpoD juntamente com duas concentrações de RNA polimerase para observar o sinal variável resultante da incorporação de nucleotídeos radiomarcados em produtos de RNA. Res...

Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.

Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

O sistema de ensaio de transcrição in vitro para Borreliella burgdorferi fornece uma ferramenta bioquímica para investigadores estudarem mecanismos e fatores regulatórios gênicos que governam a atividade enzimática da RNA polimerase. O sistema nos permite testar como fatores de transcrição, cofatores, concentrações de sal e pH afetam a função da RNA polimerase da Borreliella burgdorferi, o que contribui para nossa compreensão geral dos mecanismos de regulação gênica. Esta técnica poderosa também pode nos permitir rastrear drogas que inibem seletivamente a RNA polimerase, abrindo as portas para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a borreliose de Lyme.Para começar, colete o pellet celular de dois a quatro litros de Borreliella burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico a uma densidade de duas a quatro vezes 10 constantes por mililitros. Pastilha as células a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius em frascos centrífugos de 500 mililitros e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 30 mililitros de tampão HN gelado, repita a etapa de centrifugação e decante o sobrenadante.Enquanto trabalha, mantenha as células, lisadas e proteínas purificadas a quatro graus Celsius ou no gelo, a menos que congelem. Manter a RNA polimerase em um ambiente redutor adicionando ditiotreitol recém-preparado em uma concentração de dois milimolares a cada tampão usado e manter o pH 8,0. Preparar lisado a partir do pellet de células de Borreliella burgdorferi usando um kit comercial de lise bacteriana.Ressuspender o pellet em 10 a 15 mililitros de solução de B-PER sem inibidor de protease e deixar a lise prosseguir por cinco minutos em gelo. Adicione um coquetel de inibidor de protease à solução de lise e prossiga com três rodadas de sonicação. Agora esclareça o lisado celular por centrifugação e filtração usando um tubo centrífugo de 50 mililitros.Adicione o tampão de carregamento da coluna de cobalto à solução, tornando o volume total de até 30 mililitros. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 vezes G por 30 minutos. Em seguida, filtrar o sobrenadante usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro e diluir o tampão de carregamento de lisado e coluna de cobalto até uma proporção de diluição final de 1:10.Realizar cromatografia de afinidade no sobrenadante de lisado celular clarificado usando uma coluna de resina de cobalto ou níquel seguindo as instruções do fabricante. Guarde as amostras de fluxo, lavagem e eluídas para análise. Troque imediatamente a solução tampão de solução de RNA polimerase pela solução tampão de armazenamento usando uma coluna de troca de buffer seguindo as instruções do fabricante.Em seguida, concentre a RNA polimerase em uma concentração de 0,2 a 0,4 miligrama por mililitro usando unidades de filtro centrífugo de corte de 10 quilodaltons. Determinar a concentração por espectrofotômetro e preparar os estoques de congelamento. Alíquota 20 a 50 microlitros de estoques de congelamento de RNA polimerase em tubos de PCR e armazene a RNA polimerase a menos 80 graus Celsius.Preparar as superfícies de trabalho, incluindo a bancada de radiação, para reduzir a contaminação por radiação. Descongelar os estoques frescos de RNA polimerase e RpoD no gelo e misturar todos os estoques congelados descongelados completamente antes da pipetagem Prepare uma mistura mestre de reação em uma mistura NTP separada para nucleotídeos radiomarcados de acordo com os requisitos experimentais. Dispensar as reações de controle em conjuntos experimentais em tubos de PCR.Depois de dispensar água, mistura de reação, RNA polimerase e RpoD em tubos de PCR designados, misture os reagentes por pipetagem. Transfira os materiais preparados para uma bancada de radiação, adicione ATP marcado com alfa-32P ao NTP e misture por pipetagem suave. Adicionar NTP aos tubos contendo as misturas de reação de transcrição in vitro e iniciar a reação de transcrição in vitro adicionando um molde de DNA.Misture o volume de reação pipetando suavemente e incube os tubos a 37 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador ou bloco de calor. Remova as reações do termociclador ou bloco de calor e interrompa as reações de transcrição in vitro adicionando um volume igual de corante de carregamento de RNA 2X contendo 50% de formamida à mistura de reação. Desnaturação das enzimas incubando reações a 65 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador ou bloco de calor.Por eletroforese em gel, separar o RNA transcrito in vitro em géis de ureia de poliacrilamida de 10% a 15% TBE a 180 volts por 30 a 45 minutos. Depois de remover qualquer porção do gel contendo ATP radiomarcado não incorporado, exponha o gel à tela fosfogênica durante a noite e obtenha imagens do RNA radiomarcado usando um imageador fosfoscreen. O SDS-PAGE apresentou três bandas correspondentes a três peptídeos, RpoC, RpoB e RpoA do complexo RNA polimerase.Um peptídeo de 115 quilodaltons correspondente ao tamanho da RpoD recombinante de Borreliella burgdorferi marcada com MBP também foi observado. A clivagem da mistura proteica com protease do fator XA levou à geração de dois produtos significativos, RpoD e MBP. O sítio promotor de Borreliella burgdorferi FLGB foi gerado por PCR.Uma diluição dupla da concentração de RpoD dá origem a um nível mais baixo do produto de RNA acumulado. Uma baixa concentração de RNA polimerase fornece menos produtos de RNA em toda a faixa de concentrações de RpoD. O sinal densitométrico indicou uma relação linear entre a quantidade de RpoD presente na reação em ambos os experimentos.A atividade enzimática da RNA polimerase é sensível a uma variedade de fatores durante a purificação, armazenamento e processo experimental. Enzimas e reagentes frescos, juntamente com um bom planejamento, dão a melhor chance possível de sucesso neste protocolo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Imunologia e Infecção

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Os métodos in vitro para Comparando meta vinculativa e CDC indução Entre anticorpos terapêuticos: Aplicações em Análise Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...