Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
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Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Inversión Estratégica en Ciencias de la Salud Faculty Development Grant de la Universidad de Creighton. La cepa RpoC-His10X de B. burgdorferi fue amablemente proporcionada por el Dr. D. Scott Samuels de la Universidad de Montana. La cepa de E. coli que alberga el plásmido pMAL-C5X que codifica un alelo rpoD marcado con proteína de unión a maltosa fue amablemente proporcionada por el Dr. Frank Gherardini de Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

1. Purificación de la ARN polimerasa y preparación del stock de ARN polimerasa
<ol><li>Recoger el pellet celular de 2-4 L de B. burgdorferi RpoC-His10X cultivado en medio BSKII en un ambiente microaerofílico (34 °C, 5% CO 2, 3%O2) a una densidad de2-4 x 107 células/mL utilizando los protocolos de recolección celular descritos previamente28,29. Realizar la centrifugación a 10.000 g a 4 °...

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	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

Los ensayos de transcripción in vitro construidos utilizando el protocolo presentado se utilizaron recientemente para estudiar el papel de un factor de transcripción en B. burgdorferi y se pueden aplicar para construir experimentos similares utilizando otros factores de transcripción, factores sigma y moléculas23. Una vez obtenida la ARN polimerasa activa de B. burgdorferi y detectada su actividad, se pueden modificar los componentes y las condiciones dentro de los e...

La enfermedad de Lyme y la fiebre recurrente son causadas por patógenos espiroquetas en los géneros Borrelia y Borreliella 1,2,3. La enfermedad de Lyme es una enfermedad transmitida por vectores prominente en América del Norte y, en consecuencia, Borreliella burgdorferi es un organismo modelo prominente para estudiar la biología de las espiroquetas 4,5. Las investigaciones sobre los mecanismos de regulación transcripcional de B. burgdorferi tienen como objetivo comprender mejor sus adaptaciones a los cambios en el medio ambiente a medida que circula entre su vector garrapata y los huéspedes mamíferos 6,7. Los cambios en el pH, la temperatura, la osmolaridad, la disponibilidad de nutrientes, los ácidos grasos de cadena corta, los ácidos orgánicos y los niveles de oxígeno disuelto y dióxido de carbono modulan la expresión de genes que son importantes para que B. burgdorferi sobreviva en su artrópodo vector e infecte a los animales 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vincular estas respuestas a estímulos con mecanismos reguladores ha sido un aspecto importante de la investigación de B. burgdorferi 19.
Los factores de transcripción y los factores sigma controlan la transcripción de genes que llevan a cabo procesos celulares. Las espiroquetas de Lyme y fiebre recidivante albergan un conjunto relativamente escaso de factores de transcripción y factores sigma alternativos. A pesar de esto, existen cambios transcripcionales complejos que dirigen las respuestas de B. burgdorferi al medio ambiente20,21,22. Los mecanismos específicos que impulsan los cambios transcripcionales en B. burgdorferi en respuesta a los cambios ambientales siguen sin estar claros. Los ensayos de transcripción in vitro son herramientas poderosas para emplear un enfoque bioquímico para evaluar la función y los mecanismos reguladores de los factores de transcripción y los factores sigma23,24,25,26.
Recientemente se estableció un sistema de ensayo de transcripción in vitro utilizando la ARN polimerasa de B. burgdorferi 24. Como las bacterias a menudo tienen fisiologías celulares únicas, las ARN polimerasas de diferentes especies y géneros responden de manera diferente a la purificación enzimática, el almacenamiento de enzimas y las condiciones de amortiguación de reacción27. B. burgdorferi también está genéticamente distante de las muchas especies bacterianas en las que se han estudiado las ARN polimerasas20. Los aspectos de la preparación enzimática como la lisis, el lavado y las condiciones del tampón de elución, el tampón de almacenamiento, el tampón de reacción de transcripción in vitro y el método de construcción del ensayo pueden alterar la actividad de la ARN polimerasa. En este documento, proporcionamos un protocolo para la purificación de la ARN polimerasa y el factor sigma RpoD, la producción de plantillas lineales de ADN bicatenario y la construcción de ensayos de transcripción in vitro para facilitar la reproducibilidad entre laboratorios que utilizan este sistema. Detallamos un ejemplo de reacción para demostrar el rango lineal para la transcripción dependiente de RpoD y discutimos las limitaciones y alternativas a este enfoque.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

Borreliella burgdorferi es un patógeno bacteriano con repertorios metabólicos y genómicos limitados. B. burgdorferi transita extracelularmente entre vertebrados y garrapatas y remodela dramáticamente su perfil transcripcional para sobrevivir en ambientes dispares durante la infección. Un enfoque de los estudios de B. burgdorferi es comprender claramente cómo la bacteria responde a su entorno a través de cambios transcripcionales. Los ensayos de transcripción in vitro permiten diseccionar bioquímicamente los mecanismos básicos de regulación transcripcional. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe la purificación y almacenamiento de la polimerasa de ARN de B. burgdorferi , la purificación del factor sigma, la generación de plantillas de ADN y los ensayos de transcripción in vitro . El protocolo describe el uso de ARN polimerasa purificada de B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC es una cepa previamente publicada que alberga una etiqueta 10XHis en el gen rpoC que codifica la subunidad más grande de la ARN polimerasa. Los ensayos de transcripción in vitro consisten en la ARN polimerasa purificada de la cepa 5A4-RpoC, una versión recombinante del factor sigma de mantenimiento RpoD y una plantilla de ADN bicatenario generada por PCR. Si bien las técnicas de purificación de proteínas y los enfoques para ensamblar ensayos de transcripción in vitro son conceptualmente bien entendidos y relativamente comunes, las consideraciones de manejo para las ARN polimerasas a menudo difieren de un organismo a otro. El protocolo presentado aquí está diseñado para estudios enzimáticos sobre la ARN polimerasa de B. burgdorferi. El método se puede adaptar para probar el papel de los factores de transcripción, promotores y modificaciones postraduccionales en la actividad de la ARN polimerasa.

En una reacción de transcripción in vitro en la que el paso limitante de la reacción es el inicio de la transcripción mediada por el factor sigma, la actividad de transcripción debe aumentar linealmente con la cantidad de factor sigma. Presentamos la preparación de experimentos de transcripción in vitro que prueban un rango de concentraciones de RpoD junto con dos concentraciones de ARN polimerasa para observar la señal variable resultante de la incorporación de nucleótidos radiomarcados en pr...

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Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Los ensayos de transcripción in vitro pueden descifrar los mecanismos de regulación transcripcional en Borreliella burgdorferi. Este protocolo describe los pasos para purificar la ARN polimerasa de B. burgdorferi y realizar reacciones de transcripción in vitro. Los enfoques experimentales que utilizan ensayos de transcripción in vitro requieren una purificación y almacenamiento confiables de ARN polimerasa activa.

Componentes esenciales de los ensayos de transcripción in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

El sistema de ensayo de transcripción in vitro para Borreliella burgdorferi proporciona una herramienta bioquímica para que los investigadores estudien los mecanismos reguladores de genes y los factores que gobiernan la actividad enzimática de la ARN polimerasa. El sistema nos permite probar cómo los factores de transcripción, los cofactores, las concentraciones de sal y el pH afectan la función de la ARN polimerasa de Borreliella burgdorferi, lo que contribuye a nuestra comprensión general de los mecanismos reguladores de genes. Esta poderosa técnica también puede permitirnos detectar medicamentos que inhiben selectivamente la ARN polimerasa, abriendo la puerta al desarrollo de nuevos medicamentos para tratar la borreliosis de Lyme.Para comenzar, recoja el pellet celular de dos a cuatro litros de Borreliella burgdorferi RpoC-His10X cultivado en medio BSKII en un ambiente microaerofílico a una densidad de dos a cuatro veces 10 constantes por mililitros. Granular las células a 10, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en botellas centrífugas de 500 mililitros y desechar el sobrenadante. Luego, resuspenda las celdas en 30 mililitros de tampón HN helado, repita el paso de centrifugación y decanta el sobrenadante.Mientras trabaja, mantenga las células, el lisado y las proteínas purificadas a cuatro grados centígrados o en hielo a menos que se congelen. Mantenga la ARN polimerasa en un ambiente reductor agregando ditiothreitol recién preparado a una concentración de dos milimolares a cada tampón utilizado y mantenga un pH 8.0. Prepare lisado a partir del pellet de células de Borreliella burgdorferi utilizando un kit de lisis bacteriana comercial.Resuspender el pellet en 10 a 15 mililitros de solución de B-PER sin inhibidor de la proteasa y dejar que la lisis proceda durante cinco minutos en hielo. Agregue un cóctel inhibidor de proteasa a la solución de lisis y proceda con tres rondas de sonicación. Ahora aclare el lisado celular por centrifugación y filtración utilizando un tubo de centrífuga de 50 mililitros.Agregue un tampón de carga de columna de cobalto a la solución, lo que hace que el volumen total sea de hasta 30 mililitros. Granular los restos celulares por centrifugación a 20, 000 veces G durante 30 minutos. Posteriormente, filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y diluya el tampón de carga de la columna de lisado y cobalto hasta una relación de dilución final de 1:10.Realice cromatografía de afinidad en el sobrenadante de lisado celular clarificado utilizando una columna de resina de cobalto o níquel siguiendo las instrucciones del fabricante. Guarde las muestras de flujo, lavado y eluido para su análisis. Cambie inmediatamente la solución tampón de solución de ARN polimerasa con la solución tampón de almacenamiento utilizando una columna de intercambio de tampón siguiendo las instrucciones del fabricante.Luego, concentre la ARN polimerasa a una concentración de 0.2 a 0.4 miligramos por mililitro utilizando unidades de filtro centrífugas de corte de 10 kilodaltons. Determinar la concentración mediante espectrofotómetro y preparar las existencias de congelación. Alícuota 20 a 50 microlitros de volúmenes de ARN polimerasa congelación en tubos de PCR y almacenar la ARN polimerasa a menos 80 grados centígrados.Prepare las superficies de trabajo, incluido el banco de radiación, para reducir la contaminación por radiación. Descongele las existencias frescas de ARN polimerasa y RpoD en hielo y mezcle completamente todas las existencias congeladas descongeladas antes del pipeteo Prepare una mezcla de reacción maestra en una mezcla de NTP separada para nucleótidos radiomarcados de acuerdo con los requisitos experimentales. Dispensar las reacciones de control en series experimentales en tubos de PCR.Después de dispensar agua, mezcla de reacción, ARN polimerasa y RpoD en tubos de PCR designados, mezcle los reactivos por pipeteo. Transfiera los materiales preparados a un banco de radiación, agregue ATP marcado con alfa-32P a NTP y mezcle con un pipeteo suave. Agregue NTP a los tubos que contienen las mezclas de reacción de transcripción in vitro e inicie la reacción de transcripción in vitro agregando una plantilla de ADN.Mezcle el volumen de reacción pipeteando suavemente e incube los tubos a 37 grados centígrados durante cinco minutos en un termociclador o bloque de calor. Elimine las reacciones del termociclador o bloque de calor y detenga las reacciones de transcripción in vitro agregando un volumen igual de colorante de carga de ARN 2X que contenga 50% de formamida a la mezcla de reacción. Desnaturalizar las enzimas incubando reacciones a 65 grados centígrados durante cinco minutos en un termociclador o bloque de calor.Usando electroforesis en gel, separe el ARN transcrito in vitro en geles de poliacrilamida de urea 10% a 15% TBE a 180 voltios durante 30 a 45 minutos. Después de eliminar cualquier porción del gel que contenga ATP radiomarcado no incorporado, exponga el gel a la pantalla de fosfo durante la noche y obtenga una imagen del ARN radiomarcado utilizando un generador de imágenes de fosfopantalla. El SDS-PAGE mostró tres bandas correspondientes a tres péptidos, RpoC, RpoB y RpoA del complejo ARN polimerasa.También se observó un péptido de 115 kilodaltons que coincidía con el tamaño de la Borreliella burgdorferi RpoD recombinante marcada con MBP. La escisión de la mezcla de proteínas con la proteasa del factor XA condujo a la generación de dos productos significativos, RpoD y MBP. El sitio promotor de Borreliella burgdorferi FLGB fue generado por PCR.Una dilución doble de la concentración de RpoD da lugar a un nivel más bajo del producto de ARN acumulado. Una baja concentración de ARN polimerasa proporciona menos productos de ARN en todo el rango de concentraciones de RpoD. La señal de densitometría indicó una relación lineal entre la cantidad de RpoD presente en la reacción en ambos experimentos.La actividad enzimática de la ARN polimerasa es sensible a una variedad de factores durante el proceso de purificación, almacenamiento y experimentación. Las enzimas y reactivos frescos, junto con una buena planificación, brindan la mejor oportunidad posible de éxito en este protocolo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Métodos in vitro para comparar la unión de diana y la inducción de CDC entre anticuerpos terapéuticos: Aplicaciones en análisis de biosimilitud

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...