Name: essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Bu çalışma Creighton Üniversitesi Sağlık Bilimleri Stratejik Yatırım Fonu Fakülte Geliştirme Hibesi ile desteklenmiştir. B. burgdorferi RpoC-His10X suşu Montana Üniversitesi'nden Dr. D. Scott Samuels tarafından nazikçe sağlanmıştır. Maltoz bağlayıcı protein etiketli rpoD alelini kodlayan pMAL-C5X plazmidini barındıran E. coli suşu, Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH'den Dr. Frank Gherardini tarafından nazikçe sağlanmıştır.

1. RNA polimerazın saflaştırılması ve RNA polimeraz stoğunun hazırlanması
<ol><li>Hücre peletini mikroaerofilik bir ortamda (34 °C, %5 CO 2, %3 O 2) BSKII ortamında kültürlenmiş 2-4 L B. burgdorferi RpoC-His10X'ten, daha önce tarif edilen hücre toplama protokolleri28,29'u kullanarak2-4 x 107 hücre/mL yoğunluğa kadar toplayın. 500 mL santrifüjlü şişelerde 30 dakika boyunca 4 ° C'...

<ol>
	<li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li><li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness.">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li><li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsing+fever+Borreliae:+A+global+review.">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li><li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Borrelia+species.">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li><li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi.">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector.">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li><li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH,+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression.">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).</li><li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks.">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).</li><li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+(p)ppGpp.">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).</li><li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi.">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Borrelia+burgdorferi+RelA/SpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation.">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).</li><li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels.">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li><li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi.">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li><li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi.">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li><li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li><li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi.">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi.">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li><li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+and+transcriptomics.">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li><li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete,+Borrelia+burgdorferi.">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li><li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi.">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9 (2016).</li><li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation.">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity.">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).</li><li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system:+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi.">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).</li><li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors.">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li><li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase:+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements.">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRENDA,+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021:+New+developments+and+updates.">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li><li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+and+complementation.">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li><li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi.">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li><li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter.">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li><li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli.">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li><li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation.">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li><li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection.">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li><li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus.">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li><li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacteria.">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).</li><li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+bacterial+RNA+polymerase:+Tools+and+protocols.">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li><li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli.">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).</li><li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling-circle+RNA+synthesis:+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase.">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li><li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription.">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).</li><li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases.">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li></ol>

Sunulan protokol kullanılarak oluşturulan in vitro transkripsiyon testleri yakın zamanda B. burgdorferi'de bir transkripsiyon faktörünün rolünü incelemek için kullanılmıştır ve diğer transkripsiyon faktörlerini, sigma faktörlerini ve molekülleri kullanarak benzer deneyler yapmak için uygulanabilir23. B. burgdorferi'den aktif RNA polimeraz elde edildikten ve aktivitesi tespit edildikten sonra, in vitro transkripsiyon tahlillerindeki bileşenler ...

Lyme hastalığı ve tekrarlayan ateş, Borrelia ve Borreliella 1,2,3 cinslerindeki spiroket patojenlerinden kaynaklanır. Lyme hastalığı, Kuzey Amerika'da belirgin bir vektör kaynaklı hastalıktır ve sonuç olarak, Borreliella burgdorferi, spiroket biyolojisini incelemek için önde gelen bir model organizmadır 4,5. Transkripsiyonel düzenlemenin B. burgdorferi mekanizmalarına yönelik araştırmalar, kene vektörü ile memeli konakçıları arasında dönerken çevredeki değişikliklere adaptasyonlarını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır 6,7. pH, sıcaklık, ozmolarite, besin mevcudiyeti, kısa zincirli yağ asitleri, organik asitler ve çözünmüş oksijen ve karbondioksit seviyelerindeki değişiklikler, B. burgdorferi'nin eklembacaklı vektöründe hayatta kalması ve hayvanları enfekte etmesi için önemli olan genlerin ekspresyonunu modüle eder 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Bu tepkileri uyaranlara düzenleyici mekanizmalarla ilişkilendirmek, B. burgdorferi araştırmasının önemli bir yönü olmuştur19.
Transkripsiyon faktörleri ve sigma faktörleri, hücresel süreçleri gerçekleştiren genlerin transkripsiyonunu kontrol eder. Lyme ve tekrarlayan ateş spiroketleri, nispeten seyrek bir transkripsiyon faktörleri seti ve alternatif sigma faktörleri barındırır. Buna rağmen, B. burgdorferi'nin çevreye verdiği tepkileri yönlendiren karmaşık transkripsiyonel değişiklikler vardır20,21,22. Çevresel değişikliklere yanıt olarak B. burgdorferi'deki transkripsiyonel değişiklikleri yönlendiren spesifik mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyon faktörlerinin ve sigma faktörlerinin işlevini ve düzenleyici mekanizmalarını test etmek için biyokimyasal bir yaklaşım kullanmak için güçlü araçlardır23,24,25,26.
B. burgdorferi RNA polimerazı kullanan bir in vitro transkripsiyon tahlil sistemi yakın zamanda kurulmuştur24. Bakteriler genellikle benzersiz hücresel fizyolojilere sahip olduklarından, farklı türlerin ve cinslerin RNA polimerazları enzim saflaştırma, enzim depolama ve reaksiyon tamponu koşullarına farklı tepki verir27. B. burgdorferi ayrıca RNA polimerazlarının incelendiği birçok bakteri türünden genetik olarak uzaktır20. Lizis, yıkama ve elüsyon tamponu koşulları, depolama tamponu, in vitro transkripsiyon reaksiyon tamponu ve tahlil yapım yöntemi gibi enzim preparatının yönleri, RNA polimeraz aktivitesini değiştirebilir. Burada, RNA polimeraz ve sigma faktörü RpoD'nin saflaştırılması, doğrusal çift sarmallı DNA şablonunun üretimi ve bu sistemi kullanan laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için in vitro transkripsiyon testlerinin inşası için bir protokol sunuyoruz. RpoD'ye bağımlı transkripsiyon için doğrusal aralığı göstermek ve bu yaklaşımın sınırlamalarını ve alternatiflerini tartışmak için örnek bir reaksiyonu detaylandırıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 micron syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2545</td>
			<td>Step 1.7 and 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C50B</td>
			<td>Step 1.3, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL high-speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3120-9500PK</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78248</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filters 10 Kd cutoff</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC8010</td>
			<td>Step 1.11 and 2.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt resin and instruction manual</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89969</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>426380500</td>
			<td>Step 1.4 and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase (Nuclease)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70746</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Factor Xa Protease&#160;</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCXA-0060</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>Multiple</td>
			<td>Step 4.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O for in vitro transcription</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>Step 3.2 and 3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>Step 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1, and subsequent steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Step 2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-100G</td>
			<td>Step 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90082</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25401</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25418</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85124</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mixture</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0481</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td>Step 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-PCR28ACF</td>
			<td>Step 1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMAL Protein Fusion 
			and Purification System Instruction manual</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8200S</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gels AnyKD</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-8125</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78425</td>
			<td>Step 1.4 and 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU503H</td>
			<td>Step 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Loading Dye, (2x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>Step 4.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Mutiple</td>
			<td>Step 1.13 and subsequent protien quality check steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE-Urea gels 10 percent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4566033</td>
			<td>Step 4.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential components of borreliella (borrelia) burgdorferi in vitro transcription assays

Borreliella burgdorferi , sınırlı metabolik ve genomik repertuarlara sahip bakteriyel bir patojendir. B. burgdorferi , omurgalılar ve keneler arasında hücre dışı geçiş yapar ve enfeksiyon sırasında farklı ortamlarda hayatta kalmak için transkripsiyonel profilini çarpıcı bir şekilde yeniden şekillendirir. B. burgdorferi çalışmalarının odak noktası, bakterilerin transkripsiyonel değişiklikler yoluyla çevresine nasıl tepki verdiğini açıkça anlamaktır. İn vitro transkripsiyon testleri, transkripsiyonel regülasyonun temel mekanizmalarının biyokimyasal olarak diseke edilmesine izin verir. Burada, B. burgdorferi RNA polimeraz saflaştırma ve depolama, sigma faktör saflaştırma, DNA şablon oluşturma ve in vitro transkripsiyon tahlillerini açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC) 'den saflaştırılmış RNA polimerazın kullanımını açıklar. 5A4-RpoC, RNA polimerazın en büyük alt birimini kodlayan rpoC geni üzerinde 10XHis etiketi barındıran daha önce yayınlanmış bir suştur. İn vitro transkripsiyon testleri, 5A4-RpoC suşundan saflaştırılmış RNA polimerazdan, temizlik sigma faktörü RpoD'nin rekombinant bir versiyonundan ve PCR tarafından üretilen çift sarmallı bir DNA şablonundan oluşur. Protein saflaştırma teknikleri ve in vitro transkripsiyon tahlillerinin birleştirilmesine yönelik yaklaşımlar kavramsal olarak iyi anlaşılmış ve nispeten yaygın olsa da, RNA polimerazları için ele alma hususları genellikle organizmadan organizmaya farklılık gösterir. Burada sunulan protokol, B. burgdorferi RNA polimeraz üzerindeki enzimatik çalışmalar için tasarlanmıştır. Yöntem, transkripsiyon faktörlerinin, promotörlerin ve translasyonel sonrası modifikasyonların RNA polimerazın aktivitesi üzerindeki rolünü test etmek için uyarlanabilir.

Reaksiyonun sınırlayıcı adımının sigma faktörü aracılı transkripsiyon başlangıcı olduğu bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda, transkripsiyon aktivitesi sigma faktörü miktarı ile doğrusal olarak artmalıdır. Radyoaktif işaretli nükleotidin RNA ürünlerine dahil edilmesinden kaynaklanan değişen sinyali gözlemlemek için iki RNA polimeraz konsantrasyonu ile birlikte bir dizi RpoD konsantrasyonunu test eden in vitro transkripsiyon deneylerinin hazırlanmasını sunuyoruz. RNA ...

Watch this Scientific Journal Video about Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays at JoVE.com

Essential Components of Borreliella Borrelia burgdorferi In Vitro Transcription Assays

İn vitro transkripsiyon testleri, Borreliella burgdorferi'deki transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını deşifre edebilir. Bu protokol, B. burgdorferi RNA polimerazını saflaştırma ve in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını gerçekleştirme adımlarını açıklar. İn vitro transkripsiyon testlerini kullanan deneysel yaklaşımlar, aktif RNA polimerazın güvenilir saflaştırılmasını ve depolanmasını gerektirir.

Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transkripsiyon Tahlillerinin Temel Bileşenleri

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

Borreliella burgdorferi için in vitro transkripsiyon tahlil sistemi, araştırmacıların gen düzenleyici mekanizmaları ve RNA polimerazın enzimatik aktivitesini yöneten faktörleri incelemeleri için biyokimyasal bir araç sağlar. Sistem, transkripsiyon faktörlerinin, ko-faktörlerin, tuz konsantrasyonlarının ve pH'ın Borreliella burgdorferi RNA polimeraz fonksiyonunu nasıl etkilediğini test etmemizi sağlar ve bu da gen düzenleyici mekanizmalar hakkındaki genel anlayışımıza katkıda bulunur. Bu güçlü teknik, RNA polimerazı seçici olarak inhibe eden ilaçları taramamıza izin verebilir ve Lyme borreliosis'i tedavi etmek için yeni ilaçlar geliştirmenin kapısını açabilir.Başlamak için, hücre peletini mikroaerofilik bir ortamda BSKII ortamında kültürlenmiş iki ila dört litre Borreliella burgdorferi RpoC-His10X'ten, mililitre başına iki ila dört kat 10 sabit yoğunluğa kadar toplayın. Hücreleri 500 mililitre santrifüjlü şişelerde dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de pelet yapın ve süpernatanı atın. Ardından, hücreleri 30 mililitre buz gibi soğuk HN tamponunda yeniden askıya alın, santrifüjleme adımını tekrarlayın ve süpernatanı boşaltın.Çalışırken, donmadıkça hücreleri, lizatı ve saflaştırılmış proteinleri dört santigrat derecede veya buz üzerinde tutun. Kullanılan her tampona iki milimolar konsantrasyonda taze hazırlanmış ditiyotreitol ekleyerek RNA polimerazı indirgeyici bir ortamda tutun ve pH 8.0'ı koruyun. Ticari bir bakteriyel lizis kiti kullanarak Borreliella burgdorferi hücre peletinden lizat hazırlayın.Pelet, proteaz inhibitörü olmadan 10 ila 15 mililitre B-PER çözeltisinde tekrar askıya alın ve lizisin buz üzerinde beş dakika ilerlemesine izin verin. Lizis çözeltisine bir proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin ve üç tur sonikasyon ile devam edin. Şimdi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpü kullanarak santrifüjleme ve filtreleme ile hücre lizatını netleştirin.Çözeltiye kobalt kolon yükleme tamponu ekleyerek toplam hacmi 30 mililitreye kadar çıkarır. Hücre enkazını 30 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleme ile pelet edin. Daha sonra, süpernatantı 0,45 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve lizat ve kobalt kolon yükleme tamponunu 1:10'luk bir nihai seyreltme oranına kadar seyreltin.Üreticinin talimatlarını izleyerek bir kobalt veya nikel reçine sütunu kullanarak arıtılmış hücre lizat süpernatant üzerinde afinite kromatografisi yapın. Akış, yıkama ve elütlenmiş numuneleri analiz için saklayın. RNA polimeraz çözeltisi tampon çözeltisini, üreticinin talimatlarını izleyerek bir tampon değişim sütunu kullanarak depolama tampon çözeltisi ile hemen değiştirin.Daha sonra, RNA polimerazını, 10 kilodaltonluk kesme santrifüj filtre üniteleri kullanarak mililitre başına 0.2 ila 0.4 miligramlık bir konsantrasyona konsantre edin. Konsantrasyonu spektrofotometre ile belirleyin ve donma stoklarını hazırlayın. PCR tüplerinde 20 ila 50 mikrolitre hacimde RNA polimeraz stoklarını dondurun ve RNA polimerazı eksi 80 santigrat derecede depolayın.Radyasyon kontaminasyonunu azaltmak için radyasyon tezgahı da dahil olmak üzere çalışma yüzeylerini hazırlayın. Taze RNA polimeraz ve RpoD stoklarını buz üzerinde çözün ve pipetlemeden önce çözülmüş tüm dondurulmuş stokları iyice karıştırın Deneysel gereksinimlere göre radyoaktif işaretli nükleotidler için ayrı bir NTP karışımında bir ana reaksiyon karışımı hazırlayın. Kontrol reaksiyonlarını deney setlerinde PCR tüplerine dağıtın.Su, reaksiyon karışımı, RNA polimeraz ve RpoD'yi belirlenmiş PCR tüplerine dağıttıktan sonra, reaktifleri pipetleme ile karıştırın. Hazırlanan malzemeleri bir radyasyon tezgahına aktarın, NTP'ye alfa-32P etiketli ATP ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın. İn vitro transkripsiyon reaksiyonu karışımlarını içeren tüplere NTP ekleyin ve bir DNA şablonu ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonunu başlatın.Reaksiyon hacmini nazikçe pipetleyerek karıştırın ve tüpleri bir termosiklet veya ısı bloğunda beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Reaksiyonları termosiklerden veya ısı bloğundan çıkarın ve reaksiyon karışımına% 50 formamid içeren eşit hacimde 2X RNA yükleme boyası ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını durdurun. Bir termosiklet veya ısı bloğunda beş dakika boyunca 65 santigrat derecede reaksiyonları inkübe ederek enzimlerin denatürasyonu.Jel elektroforezi kullanarak, in vitro transkribe RNA'yı% 10 ila% 15 TBE üre poliakrilamid jellerinde 180 voltta 30 ila 45 dakika boyunca ayırın. Dahil edilmemiş radyoaktif etiketli ATP içeren jelin herhangi bir bölümünü çıkardıktan sonra, jeli bir gecede fosfo ekrana maruz bırakın ve bir fosfoekran görüntüleyici kullanarak radyoaktif etiketli RNA'yı görüntüleyin. SDS-PAGE, RNA polimeraz kompleksinin üç peptidine, RpoC, RpoB ve RpoA'ya karşılık gelen üç bant gösterdi.MBP etiketli rekombinant Borreliella burgdorferi RpoD'nin boyutuna uyan 115 kilodaltonluk bir peptit de gözlendi. Protein karışımının faktör XA proteaz ile bölünmesi, iki önemli ürünün, RpoD ve MBP'nin üretilmesine yol açtı. Borreliella burgdorferi FLGB'nin promotör sitesi PCR tarafından oluşturulmuştur.RpoD konsantrasyonunun iki kat seyreltilmesi, biriken RNA ürününün daha düşük bir seviyesine yol açar. Düşük RNA polimeraz konsantrasyonu, RpoD konsantrasyonları aralığında daha az RNA ürünü verir. Dansitometri sinyali, her iki deneyde de reaksiyonda bulunan RpoD miktarı arasında doğrusal bir ilişki olduğunu gösterdi.RNA polimeraz enzimatik aktivitesi, saflaştırma, depolama ve deneysel işlem sırasında çeşitli faktörlere duyarlıdır. Taze enzim ve reaktifler, iyi planlama ile birlikte, bu protokolde mümkün olan en iyi başarı şansını verir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...