Name: isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81930025 و 82170988) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة المقدمة من المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU) والمختبر المركزي التحليلي والاختبار لمركز الابتكار الطبي العسكري التابع لجامعة الطب للقوات الجوية.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في الجامعة الطبية العسكرية الرابعة وتم تنفيذها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام الفئران C57Bl / 6 البالغة من العمر ثمانية أسابيع (لا يوجد تفضيل للإناث أو الذكور). تم الحصول على MSCs...

<ol>
	<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+in+bone+disorders:+Novel+cell-free+therapeutic+strategy.">The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).</li><li>Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+applications+of+multipotential+mesenchymal/stromal+stem+cells+in+skeletal+tissue+repair.">The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair.</a> Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).</li><li>Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+functions+of+mesenchymal+stromal/stem+cells+mediated+via+paracrine+activity.">The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+miRNAs:+From+Biomarkers+to+Mediators+of+Physiology+and+Disease.">Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).</li><li>Lei, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Obesity-Related+Insulin+Resistance.">Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).</li><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Boing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer.">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+Transplantation+Improves+Osteopenia+via+Epigenetic+Regulation+of+Notch+Signaling+in+Lupus.">MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).</li><li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+protection+by+mesenchymal+stem+cell+transplantation+identifies+exosomal+MiR-21+as+a+therapeutic+for+retinal+degeneration.">Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHED+aggregate+exosomes+shuttled+miR-26a+promote+angiogenesis+in+pulp+regeneration+via+TGF-beta/SMAD2/3+signalling.">SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling.</a> Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).</li><li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+educated+mesenchymal+stem+cells+accelerate+cutaneous+wound+healing+via+promoting+angiogenesis.">Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis.</a> Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosome+promotes+M2+polarization+and+enhances+cutaneous+wound+healing.">MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing.</a> Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).</li><li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles.">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-associated+procoagulant+phospholipid+and+tissue+factor+activity+in+multiple+myeloma.">Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma.</a> PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration.">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease.">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li><li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes.">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance.">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).</li></ol>

تظهر المركبات الكهربائية لتلعب دورا مهما في الأنشطة البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك عرض المستضد ، ونقل المواد الوراثية ، وتعديل البيئة الدقيقة للخلايا ، وغيرها. علاوة على ذلك ، فإن تطبيقها على نطاق واسع يجلب مناهج وفرصا جديدة لتشخيص الأمراض وعلاجها21. يعتمد تنفيذ التطبيقات ا...

الخلايا الجذعية هي خلايا متعددة القدرات غير متمايزة ذات قدرة على التجديد الذاتي وإمكانات متعدية1. يتم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بسهولة وزراعتها وتوسيعها وتنقيتها في المختبر ، والتي تظل مميزة للخلايا الجذعية بعد ممرات متعددة. في السنوات الأخيرة ، دعمت الأدلة المتزايدة الرأي القائل بأن MSCs تعمل في وضع paracrine في الاستخدام العلاجي 2,3. يلعب إفراز الحويصلات خارج الخلية (EVs) بشكل خاص دورا حاسما في التوسط في الوظائف البيولوجية ل MSCs. كجسيمات نانوية غشائية غير متجانسة يتم إطلاقها من معظم أنواع الخلايا ، تتكون EVs من فئات فرعية تسمى exosomes (Exos) ، والحويصلات الدقيقة (MVs) ، وحتى الأجسام المبرمج الأكبر 4,5. من بينها ، Exos هو EV الأكثر دراسة على نطاق واسع بحجم 40-150 نانومتر ، وهو من أصل endosomal ويفرز بنشاط في الظروف الفسيولوجية. تتشكل MVs عن طريق سفك مباشرة من سطح غشاء بلازما الخلية بقطر 100-1000 نانومتر ، والتي تتميز بالتعبير العالي عن الفوسفاتيديل سيرين والتعبير عن العلامات السطحية للخلايا المانحة6. تحتوي EVs على الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات النشطة بيولوجيا الأخرى ، والتي لها وظائف مماثلة للخلايا الأم وتلعب دورا مهما في اتصال الخلايا والاستجابة المناعية وإصلاح تلف الأنسجة7. تم التحقيق على نطاق واسع في MSC-EVs كأداة علاجية قوية خالية من الخلايا في الطب التجديدي8.
يعد عزل وتنقية المركبات الكهربائية المشتقة من MSC مشكلة شائعة في مجال البحث والتطبيق. في الوقت الحاضر ، الطرد المركزي التفاضلي والكثافة9 ، عملية الترشيح الفائق 10 ، الفصل المغناطيسي المناعي 11 ، كروماتوجراف الاستبعاد الجزيئي12 ، ورقاقة الموائع الدقيقة13 هي طرق مستخدمة على نطاق واسع في عزل وتنقية المركبات الكهربائية. مع مزايا وعيوب كل نهج ، لا يمكن تلبية كمية ونقاء ونشاط المركبات الكهربائية المجمعة في نفس الوقت14,15. في هذه الدراسة ، يتم عرض بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من MSCs المستزرعة بالتفصيل ، مما دعم الاستخدام العلاجي الفعال16،17،18،19،20. كما تم تقديم مثال على قابلية هذه الطريقة للتكيف مع سلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات الفلورية ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع وتطبيق MSC-EVs بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% povidone-iodine (Betadine)</td>
			<td>Weizhenyuan</td>
			<td>10053956954292</td>
			<td>Wound disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration solution</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>110-0020</td>
			<td>Calibrate the NTA instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53716-49-7</td>
			<td>Analgesic medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caudal vein imager&#160;</td>
			<td>KEW Life Science</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td>Caudal vein imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon-coated square mesh</td>
			<td>PBL Assay Science&#160;</td>
			<td>24916-25</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Zhongke Life Science</td>
			<td>Z8G5JBMz</td>
			<td>Post-treatment care of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7980</td>
			<td>Systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td>Animal anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C12571500BT</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analyzer</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView PMX120</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0015</td>
			<td>Resuspend EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Procell Life Science</td>
			<td>PB180120</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>Labeling EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch</td>
			<td>Acuderm</td>
			<td>69038-10-50</td>
			<td>Skin defects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>Version 8.05.14 SP7&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic equipment</td>
			<td>Grant</td>
			<td>v-0001-0005</td>
			<td>Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>HT7800</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCMSCs</td>
			<td>Bai&#39;ao&#160;</td>
			<td>UKK220201</td>
			<td>Commercially UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure filtered water purification system</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>IQ 7000</td>
			<td>Preparation of ultrapure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية غشائية غير متجانسة تطلقها معظم أنواع الخلايا ، ويتم التعرف عليها بشكل متزايد كمنظمات فسيولوجية للتوازن العضوي ومؤشرات مهمة للأمراض. وفي غضون ذلك، بدأت تظهر إمكاناتها الهائلة لإنشاء علاجات للأمراض يمكن السيطرة عليها ويمكن السيطرة عليها. يمكن للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) إطلاق كميات كبيرة من EVs في الثقافة ، والتي أظهرت وعدا ببدء تجديد الأنسجة بشكل فعال وتسهيل التطبيقات العلاجية واسعة النطاق مع قابلية جيدة للتوسع والتكاثر. هناك طلب متزايد على بروتوكولات بسيطة وفعالة لجمع وتطبيق MSC-EVs. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية من MSCs البشرية المستزرعة ، والإكسوسومات ، والحويصلات الدقيقة لمزيد من التطبيقات. تظهر قابلية التكيف لهذه الطريقة لسلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع MSC-EVs وتطبيقها بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.

يتم عزل MVs و Exos من UCMSCs البشرية المستزرعة باتباع سير العمل التجريبي (الشكل 1). توضح نتائج NTA أن حجم Exos من MSCs البشرية يتراوح من 40 نانومتر إلى 335 نانومتر مع حجم ذروة يبلغ حوالي 100 نانومتر ، ويتراوح حجم MVs من 50 نانومتر إلى 445 نانومتر مع حجم ذروة يبلغ 150 نانومتر (الشكل 2)....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

يصف هذا البروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية (exosomes و microvesicles) من MSCs البشرية المستزرعة. يتم شرح المزيد من التطبيقات لهذه المركبات الكهربائية أيضا في هذه المقالة.

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

عالج هذا الإجراء الحاجة إلى مجموعة حويصلات خارج الخلية مشتقة من الخلايا الجذعية المتوسطة بسيطة وموثوقة ، والتطبيق في ترجمة البحث. إن جمع الحويصلات خارج الخلية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي أمر بسيط وقابل للتطوير بسهولة وقابل للتكرار ، مما سيكون مفيدا لهذا المجال. الحويصلات خارج الخلية غير واضحة}من غير واضحة}الخلايا الجذعية الوسيطة هو تطبيق غير واضح في علاجات الأمراض الحديثة.لن أخاف من الأخطاء. هذه العملية بسيطة وسهلة التعلم. هناك العديد من التفاصيل في هذا البرنامج البسيط التي يمكن تقديمها بشكل أفضل من خلال الفيديو.للبدء ، قم بزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى أكثر من التقاء 90٪. استبدل وسط الاستزراع في كل طبق ب 8 مل من ألفا ميم المضاف. بعد 48 ساعة من المزرعة ، يجب أن تنمو الخلايا بالتساوي لجمع وسط الاستزراع بالكامل في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.بعد ذلك ، قم بطرد مركزي وسط الاستزراع عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية سعة 1.5 مل لإزالة شظايا الخلايا والحطام الخلوي. أجهزة الطرد المركزي طاف في 16،000 × ز لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.استخدم ماصة لنقل التعليق إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 150،000 × ز لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق حبيبات الحويصلة الدقيقة في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل طبق.تخلص من المادة الطافية واجمع البقايا ، وهي إكسوسومات. إعادة تعليق exosomes من سبعة أطباق من الخلايا في 50 uL من PBS. في أنبوب 15 مل ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من الحويصلات خارج الخلية في 1،499 ميكرولتر من PBS واخلطها.ثم ابدأ تشغيل البرنامج المتوافق لمحلل التتبع. املأ خلية العينة بالماء المقطر ثم اترك الأداة تبدأ فحص الخلية. قم بمعايرة الجهاز بمحلول قياسي معد.تأكد من أن رقم الجسيمات المعروض على واجهة اكتشاف البرنامج يتراوح بين 50 إلى 400 ، ويفضل أن يكون حوالي 200 ، وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، اشطف خلية العينة ب 5 مل من الماء المقطر. قبل تحليل العينة ، اغسل القناة ب 1 مل من الماء المقطر.تأكد من أن رقم الجسيمات المعروض على واجهة اكتشاف البرنامج أقل من 10. في أنبوب مخروطي سعة 1.5 مل ، أعد تعليق الحويصلات خارج الخلية ب 250 ميكرولتر من PBS. في أنبوب مخروطي آخر سعة 1.5 مل ، قم بإعداد محلول العمل لصبغة PKH26.امزج الحويصلات خارج الخلية المعاد تعليقها مع محلول العمل. اتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ثم أضف 500 ميكرولتر من FBS المستنفد ل EV لإيقاف التفاعل. بالنسبة للحويصلات الدقيقة ، أجهزة الطرد المركزي عند 16،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.تخلص من المادة الطافية. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لشطف البقايا. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وتجاهل المادة الطافية لإزالة الصبغة غير المنضمة.بالنسبة للحويصلات الدقيقة ، أجهزة الطرد المركزي عند 16،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق البقايا ب 200 ميكرولتر من PBS. أسقط 20 ميكرولتر من التعليق على الشريحة وراقبها تحت المجهر الفلوري.أعد تعليق الحويصلات خارج الخلية في 200 ميكرولتر من PBS ، ثم اخلطها بمحلول الهيبارين بنسبة حجم 10: 1. ضع الفأر في نظام تصوير الوريد الذيلي. اضغط على المفتاح لرفع الرافعة.بمساعدة مصور وريد الذيل ، قم بإجراء حقن منهجي لتعليق الحويصلة خارج الخلية من خلال الوريد الذيل. أظهر تحليل توزيع حجم الجسيمات باستخدام NTA أن حجم الإكسوسومات من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية تراوح من 40 إلى 335 نانومتر ، مع حجم ذروة يبلغ حوالي 100 نانومتر. أيضا ، تراوح حجم الحويصلات الدقيقة من 50 إلى 445 نانومتر ، مع حجم ذروة 150 نانومتر.أظهر التوصيف المورفولوجي للإكسوسومات أنها أظهرت شكل كوب نموذجي. تم تصنيف الحويصلات خارج الخلية بكفاءة بواسطة PKH26 ، والتي لوحظت من خلال العرض الإجمالي على أنها كريات موسومة ، وكذلك بواسطة المجهر الفلوري. يجب على المشغل الانتباه أثناء جمع الخلايا الطافية ، لأنه يجب نفخ الخلايا بالتساوي لجمع EVs المفرج عنها بالكامل في الخلايا الجذعية الوسيطة غير الواضحة.من أجل التحقق من نجاح الحقن ، يمكن إجراء التصوير في الجسم الحي للتوزيع الحيوي للمركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية أو الأقسام المجمدة لمواقع الأنسجة المحددة للتطعيم.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs (Video) | JoVE

العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts (Video) | JoVE

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin (Video) | JoVE

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

العزلة وتوصيف هويشت منخفضة CD45 السلبية ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÂ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures (Video) | JoVE

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates (Video) | JoVE

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor (Video) | JoVE

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells (Video) | JoVE

تحليل الجريان خارج الخلية عزل وتوصيف وإنتاجية عالية للماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria (Video) | JoVE

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...