Name: isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81930025 ו-82170988) ומהקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (2019M663986 ו-BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU) והמעבדה המרכזית לניתוח ובדיקות של המרכז לחדשנות רפואית צבאית של האוניברסיטה הרפואית של חיל האוויר.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 בני שמונה שבועות (ללא העדפה לנקבות או לזכרים). MSCs שמקורם בחבל הטבור האנושי (UCMSCs), ששימשו ל...

<ol>
	<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+in+bone+disorders:+Novel+cell-free+therapeutic+strategy.">The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).</li><li>Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+applications+of+multipotential+mesenchymal/stromal+stem+cells+in+skeletal+tissue+repair.">The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair.</a> Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).</li><li>Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+functions+of+mesenchymal+stromal/stem+cells+mediated+via+paracrine+activity.">The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+miRNAs:+From+Biomarkers+to+Mediators+of+Physiology+and+Disease.">Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).</li><li>Lei, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Obesity-Related+Insulin+Resistance.">Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).</li><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Boing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer.">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+Transplantation+Improves+Osteopenia+via+Epigenetic+Regulation+of+Notch+Signaling+in+Lupus.">MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).</li><li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+protection+by+mesenchymal+stem+cell+transplantation+identifies+exosomal+MiR-21+as+a+therapeutic+for+retinal+degeneration.">Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHED+aggregate+exosomes+shuttled+miR-26a+promote+angiogenesis+in+pulp+regeneration+via+TGF-beta/SMAD2/3+signalling.">SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling.</a> Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).</li><li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+educated+mesenchymal+stem+cells+accelerate+cutaneous+wound+healing+via+promoting+angiogenesis.">Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis.</a> Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosome+promotes+M2+polarization+and+enhances+cutaneous+wound+healing.">MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing.</a> Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).</li><li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles.">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-associated+procoagulant+phospholipid+and+tissue+factor+activity+in+multiple+myeloma.">Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma.</a> PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration.">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease.">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li><li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes.">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance.">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).</li></ol>

כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד חשוב בפעילויות ביולוגיות מגוונות, כולל הצגת אנטיגן, הובלת חומרים גנטיים, שינוי מיקרו-סביבה של תאים ועוד. יתר על כן, היישום הרחב שלהם מביא גישות חדשות והזדמנויות לאבחון וטיפול במחלות21. יישום יישומים טיפוליים של כלי רכב חשמליים מבוסס על בידוד ואפיון...

תאי גזע הם תאים פלוריפוטנטיים בלתי ממוינים בעלי יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל תרגום1. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבודדים, מתורבתים, מורחבים ומטוהרים בקלות במעבדה, מה שנשאר אופייני לתאי גזע לאחר מעברים מרובים. בשנים האחרונות, עדויות הולכות וגדלות תומכות בדעה כי MSCs לפעול במצב paracrine בשימוש טיפולי 2,3. במיוחד הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאת תפקיד מכריע בתיווך הפונקציות הביולוגיות של MSCs. כננו-חלקיקים קרומיים הטרוגניים המשתחררים מרוב סוגי התאים, כלי רכב חשמליים מורכבים מתת-קטגוריות הנקראות אקסוזומים (Exos), מיקרו-שלפוחיות (MVs), וגופים אפופטוטיים גדולים עוד יותר 4,5. ביניהם, Exos הוא EV הנחקר ביותר עם גודל של 40-150 ננומטר, שהוא ממוצא אנדוזומלי מופרש באופן פעיל בתנאים פיזיולוגיים. MVs נוצרים על ידי שפיכה ישירות מפני השטח של קרום פלזמה התא בקוטר של 100-1,000 ננומטר, אשר מאופיינים ביטוי גבוה של פוספטידיל סרין ביטוי של סמנים פני השטח של תאים תורמים6. כלי רכב חשמליים מכילים רנ"א, חלבונים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, שיש להן תפקידים דומים לתאי האב וממלאות תפקיד משמעותי בתקשורת התא, בתגובה החיסונית ובתיקון נזק לרקמות7. MSC-EVs נחקרו באופן נרחב ככלי טיפולי רב עוצמה ללא תאים ברפואה רגנרטיבית8.
בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC הוא נושא נפוץ בתחום המחקר והיישום. כיום, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וצפיפות שיפוע9, תהליך אולטרה-סינון 10, הפרדה אימונומגנטית 11, כרומטוגרף הדרה מולקולרית12 ושבב מיקרופלואידי13 הן שיטות בשימוש נרחב בבידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים. עם היתרונות והחסרונות של כל גישה, לא ניתן לספק את הכמות, הטוהר והפעילות של כלי רכב חשמליים שנאספו בו זמנית14,15. במחקר הנוכחי מוצג בפירוט פרוטוקול הצנטריפוגה הדיפרנציאלית של בידוד ואפיון של כלי רכב חשמליים מתאי MSC מתורבתים, אשר תמך בשימוש טיפולי יעיל 16,17,18,19,20. יכולת ההסתגלות של שיטה זו לסדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג פלואורסצנטי, השתלה מקומית והזרקה מערכתית, הוכחה עוד יותר. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EV במחקר תרגומי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% povidone-iodine (Betadine)</td>
			<td>Weizhenyuan</td>
			<td>10053956954292</td>
			<td>Wound disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration solution</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>110-0020</td>
			<td>Calibrate the NTA instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53716-49-7</td>
			<td>Analgesic medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caudal vein imager&#160;</td>
			<td>KEW Life Science</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td>Caudal vein imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon-coated square mesh</td>
			<td>PBL Assay Science&#160;</td>
			<td>24916-25</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Zhongke Life Science</td>
			<td>Z8G5JBMz</td>
			<td>Post-treatment care of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7980</td>
			<td>Systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td>Animal anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C12571500BT</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analyzer</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView PMX120</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0015</td>
			<td>Resuspend EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Procell Life Science</td>
			<td>PB180120</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>Labeling EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch</td>
			<td>Acuderm</td>
			<td>69038-10-50</td>
			<td>Skin defects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>Version 8.05.14 SP7&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic equipment</td>
			<td>Grant</td>
			<td>v-0001-0005</td>
			<td>Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>HT7800</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCMSCs</td>
			<td>Bai&#39;ao&#160;</td>
			<td>UKK220201</td>
			<td>Commercially UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure filtered water purification system</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>IQ 7000</td>
			<td>Preparation of ultrapure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקי קרום הטרוגניים המשוחררים על ידי רוב סוגי התאים, והם מוכרים יותר ויותר כרגולטורים פיזיולוגיים של הומאוסטזיס אורגניזם ואינדיקטורים חשובים לפתולוגיות; בינתיים, הפוטנציאל העצום שלהם לבסס טיפולים נגישים וניתנים לשליטה במחלות הולך וגדל. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים לשחרר כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים בתרבית, אשר הראו הבטחה להתניע התחדשות רקמות יעילה ולהקל על יישומים טיפוליים נרחבים עם מדרגיות טובה ויכולת שחזור. קיים ביקוש גובר לפרוטוקולים פשוטים ויעילים לאיסוף ויישום MSC-EVs. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד ולאפיין כלי רכב חשמליים מייצגים מתאי MSC אנושיים מתורבתים, אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות ליישומים נוספים. יכולת ההסתגלות של שיטה זו מוצגת עבור סדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג, השתלה מקומית והזרקה מערכתית. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EVs במחקר תרגומי.

MVs ו-Exos מ-UCMSCs אנושיים מתורבתים מבודדים בעקבות זרימת העבודה הניסויית (איור 1). תוצאות נת"ע מראות כי גודל Exos מ-MSCs אנושיים נע בין 40 ננומטר ל-335 ננומטר עם גודל שיא של כ-100 ננומטר, וגודל ה-MV נע בין 50 ננומטר ל-445 ננומטר עם גודל שיא של 150 ננומטר (איור 2). אפיון מורפולוגי של Exo...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

הליך זה התייחס לצורך באיסוף שלפוחית חוץ-תאית פשוטה ואמינה ממזנכימלית שמקורה בתאי גזע, וביישום בתרגום מחקרים. איסוף שלפוחיות חוץ-תאיות על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית הוא פשוט, ניתן להרחבה בקלות וניתן לשחזור, אשר יהיה שימושי לתחום. Extracellular vesicles indistinct}from indistinct}mesenchymel stem cell is instinct}application in modern disease therapies.אני לא אפחד מטעויות. פעולה זו פשוטה וקלה ללמידה. ישנם פרטים רבים בתוכנית פשוטה זו שניתן להציג טוב יותר באמצעות וידאו.בתור התחלה, תרבית את תאי הגזע המזנכימליים ליותר מ-90% מפגש. החליפו את מדיום התרבית בכל מנה ב-8 מ"ל של תוסף אלפא-MEM. לאחר 48 שעות של תרבית, התאים חייבים להיות מגודלים באופן שווה כדי לאסוף באופן מלא את מדיום התרבית לתוך צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל.לאחר מכן, צנטריפוגו את מדיום התרבית ב 800 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות חרוטיים בנפח 1.5 מ"ל כדי להסיר את שברי התא ואת פסולת התא. צנטריפוגה supernatant ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השתמש פיפטה כדי להעביר את המתלה צינורות אולטרה צנטריפוגה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 150, 000 x גרם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את גלולת microvesicle ב 50 uL של PBS לכל מנה.השליכו את הסופרנאטנט ואספו את השאריות, שהן אקסוזומות. השהה מחדש את האקסוזומים משבע צלחות של תאים ב- 50 uL של PBS. בצינור 15 מ"ל, לדלל 1 uL של שלפוחיות חוץ-תאיות ב 1, 499 uL של PBS ולערבב.לאחר מכן, הפעל את התוכנה התואמת עבור מנתח המעקב. מלא את תא הדגימה במים מזוקקים ולאחר מכן אפשר למכשיר להתחיל את בדיקת התא. כייל את המכשיר עם פתרון סטנדרטי מוכן.ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה הוא בין 50 ל- 400, רצוי בסביבות 200, ולחץ על אישור. לאחר מכן, לשטוף את תא הדגימה עם 5 מ"ל של מים מזוקקים. לפני ניתוח הדגימה, לשטוף את התעלה עם 1 מ"ל של מים מזוקקים.ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה קטן מ- 10. בצינור חרוטי של 1.5 מ"ל, להשעות מחדש את השלפוחיות החוץ תאיות עם 250 uL של PBS. בצינור חרוטי נוסף של 1.5 מ"ל, הכינו את פתרון העבודה של צבע PKH26.מערבבים את השלפוחיות החוץ תאיות המושעות מחדש עם פתרון העבודה. אפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ולאחר מכן הוסף 500 uL של FBS מדולדל EV כדי לעצור את התגובה. עבור microvesicles, צנטריפוגה ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של PBS כדי לשטוף את השאריות. צנטריפוגה שוב, ולהשליך את supernatant כדי להסיר את הצבע unbound.עבור microvesicles, צנטריפוגה ב 16, 000 x גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות מחדש את השאריות עם 200 uL של PBS. שחררו 20 uL של השעיה על המגלשה והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.יש להשהות מחדש שלפוחיות חוץ-תאיות ב-200 uL של PBS, ולאחר מכן לערבב עם תמיסת הפרין ביחס נפח של 10:1. הכנס את העכבר למערכת הדמיית הוורידים הקאודליים. לחץ על המתג כדי להרים את הידית.בעזרת מאייר ורידים זנב, לבצע הזרקה שיטתית של מתלה שלפוחית תאית דרך וריד הזנב. ניתוח התפלגות גודל החלקיקים באמצעות נת"ע הראה כי גודל האקסוזומים מתאי גזע מזנכימליים אנושיים נע בין 40 ל-335 ננומטר, עם גודל שיא של כ-100 ננומטר. כמו כן, גודל microvesicles נע בין 50 ל 445 ננומטר, עם גודל שיא של 150 ננומטר.אפיון מורפולוגי של אקסוזומים הראה שהם הציגו צורת טיפוסית. שלפוחיות חוץ-תאיות סומנו ביעילות על ידי PKH26, שנצפה על ידי התצוגה הגסה ככדורים מסומנים, כמו גם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המפעיל צריך לשים לב במהלך איסוף supernatant, כי תאים חייבים להיות מנופחים באופן שווה כדי לאסוף באופן מלא את EV שוחרר נשמר instinct} של תאי גזע mesenchymal.על מנת לאמת את הצלחת ההזרקה, ניתן לבצע הדמיה in vivo של הפצה ביולוגית של כלי רכב חשמליים המסומנים בפלואורסצנטיות או מקטעים קפואים של אתרי רקמה ספציפיים של קליטה.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...