Name: isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 e 82170988) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l'assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e del Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center dell'Air Force Medical University.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Quarta Università medica militare ed eseguite in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati utilizzati topi C57Bl/6 di otto settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC), utilizzate per il presente studio, sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi T...

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	<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+in+bone+disorders:+Novel+cell-free+therapeutic+strategy.">The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).</li><li>Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+applications+of+multipotential+mesenchymal/stromal+stem+cells+in+skeletal+tissue+repair.">The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair.</a> Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).</li><li>Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+functions+of+mesenchymal+stromal/stem+cells+mediated+via+paracrine+activity.">The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+miRNAs:+From+Biomarkers+to+Mediators+of+Physiology+and+Disease.">Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).</li><li>Lei, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Obesity-Related+Insulin+Resistance.">Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).</li><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Boing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer.">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+Transplantation+Improves+Osteopenia+via+Epigenetic+Regulation+of+Notch+Signaling+in+Lupus.">MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).</li><li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+protection+by+mesenchymal+stem+cell+transplantation+identifies+exosomal+MiR-21+as+a+therapeutic+for+retinal+degeneration.">Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHED+aggregate+exosomes+shuttled+miR-26a+promote+angiogenesis+in+pulp+regeneration+via+TGF-beta/SMAD2/3+signalling.">SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling.</a> Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).</li><li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+educated+mesenchymal+stem+cells+accelerate+cutaneous+wound+healing+via+promoting+angiogenesis.">Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis.</a> Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosome+promotes+M2+polarization+and+enhances+cutaneous+wound+healing.">MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing.</a> Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).</li><li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles.">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-associated+procoagulant+phospholipid+and+tissue+factor+activity+in+multiple+myeloma.">Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma.</a> PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration.">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease.">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li><li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes.">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance.">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).</li></ol>

Le EV stanno emergendo per svolgere un ruolo importante in diverse attività biologiche, tra cui la presentazione dell'antigene, il trasporto di materiale genetico, la modifica del microambiente cellulare e altri. Inoltre, la loro ampia applicazione offre nuovi approcci e opportunità per la diagnosi e il trattamento delle malattie21. L'implementazione delle applicazioni terapeutiche delle EV si basa sul successo dell'isolamento e della caratterizzazione. Tuttavia, a causa della mancanza di metodi...

Le cellule staminali sono cellule pluripotenti indifferenziate con capacità di auto-rinnovamento e potenziale traslazionale1. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono facilmente isolate, coltivate, espanse e purificate in laboratorio, il che rimane caratteristico delle cellule staminali dopo più passaggi. Negli ultimi anni, prove crescenti hanno sostenuto l'opinione che le MSC agiscono in modo paracrino nell'uso terapeutico 2,3. Soprattutto la secrezione di vescicole extracellulari (EV) svolge un ruolo cruciale nel mediare le funzioni biologiche delle MSC. Come nanoparticelle membranose eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi di cellule, le EV consistono in sottocategorie denominate esosomi (Exos), microvescicole (MV) e corpi apoptotici ancora più grandi 4,5. Tra questi, Exos è l'EV più studiato con una dimensione di 40-150 nm, che è di origine endosomiale e attivamente secreto in condizioni fisiologiche. Le MV si formano spargendo direttamente dalla superficie della membrana plasmatica cellulare con un diametro di 100-1.000 nm, che sono caratterizzate da un'elevata espressione di fosfatidilserina e dall'espressione di marcatori superficiali di cellule donatrici6. Le EV contengono RNA, proteine e altre molecole bioattive, che hanno funzioni simili alle cellule madri e svolgono un ruolo significativo nella comunicazione cellulare, nella risposta immunitaria e nella riparazione dei danni tissutali7. Le MSC-EV sono state ampiamente studiate come un potente strumento terapeutico privo di cellule nella medicina rigenerativa8.
L'isolamento e la purificazione dei veicoli elettrici derivati da MSC è un problema comune nel campo della ricerca e dell'applicazione. Allo stato attuale, l'ultracentrifugazione differenziale e a gradiente di densità9, il processo di ultrafiltrazione10, la separazione immunomagnetica 11, il cromatografo ad esclusione molecolare 12 e il chip microfluidico13 sono metodi ampiamente impiegati nell'isolamento e nella purificazione delle EV. Con i vantaggi e gli svantaggi di ciascun approccio, la quantità, la purezza e l'attività dei veicoli elettrici raccolti non possono essere soddisfatti contemporaneamente14,15. Nel presente studio, viene mostrato in dettaglio il protocollo di centrifugazione differenziale di isolamento e caratterizzazione delle EV da MSC in coltura, che ha supportato un uso terapeutico efficiente 16,17,18,19,20. L'adattabilità di questo metodo per una serie di approcci a valle, come la marcatura fluorescente, il trapianto locale e l'iniezione sistemica, è stata ulteriormente esemplificata. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili delle MSC-EV nella ricerca traslazionale.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10% povidone-iodine (Betadine)</td>
			<td>Weizhenyuan</td>
			<td>10053956954292</td>
			<td>Wound disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration solution</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>110-0020</td>
			<td>Calibrate the NTA instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53716-49-7</td>
			<td>Analgesic medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caudal vein imager&#160;</td>
			<td>KEW Life Science</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td>Caudal vein imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon-coated square mesh</td>
			<td>PBL Assay Science&#160;</td>
			<td>24916-25</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Zhongke Life Science</td>
			<td>Z8G5JBMz</td>
			<td>Post-treatment care of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7980</td>
			<td>Systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td>Animal anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C12571500BT</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analyzer</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView PMX120</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0015</td>
			<td>Resuspend EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Procell Life Science</td>
			<td>PB180120</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>Labeling EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch</td>
			<td>Acuderm</td>
			<td>69038-10-50</td>
			<td>Skin defects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>Version 8.05.14 SP7&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic equipment</td>
			<td>Grant</td>
			<td>v-0001-0005</td>
			<td>Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>HT7800</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCMSCs</td>
			<td>Bai&#39;ao&#160;</td>
			<td>UKK220201</td>
			<td>Commercially UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure filtered water purification system</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>IQ 7000</td>
			<td>Preparation of ultrapure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle di membrana eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi cellulari e sono sempre più riconosciute come regolatori fisiologici dell'omeostasi dell'organismo e importanti indicatori di patologie; Nel frattempo, sta emergendo il loro immenso potenziale per stabilire terapie di malattia accessibili e controllabili. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono rilasciare grandi quantità di EV in coltura, che hanno dimostrato di promettere di avviare un'efficace rigenerazione dei tessuti e facilitare ampie applicazioni terapeutiche con una buona scalabilità e riproducibilità. C'è una crescente domanda di protocolli semplici ed efficaci per la raccolta e l'applicazione di MSC-EV. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato basato sulla centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentativi da MSC umane in coltura, esosomi e microvescicole per ulteriori applicazioni. L'adattabilità di questo metodo è dimostrata per una serie di approcci a valle, come l'etichettatura, il trapianto locale e l'iniezione sistemica. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili di MSC-EV nella ricerca traslazionale.

MV ed Exos da UCMSC umani in coltura vengono isolati seguendo il flusso di lavoro sperimentale (Figura 1). I risultati NTA dimostrano che la dimensione di Exos da MSC umane varia da 40 nm a 335 nm con una dimensione di picco di circa 100 nm, e la dimensione delle MV varia da 50 nm a 445 nm con una dimensione di picco di 150 nm (Figura 2). La caratterizzazione morfologica degli Exos derivati da MSC mostra una tipica forma a coppa (Figura 3</s...

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Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Questa procedura ha affrontato la necessità di una raccolta di vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali semplici e affidabili e di applicazione nella traduzione della ricerca. La raccolta di vescicole extracellulari mediante centrifugazione differenziale è semplice, facilmente scalabile e riproducibile, il che sarà utile al campo. Le vescicole extracellulari indistinte dalle cellule staminali mesenchimali indistinte sono un'applicazione indistinta nei moderni trattamenti delle malattie.Non avrò paura degli errori. Questa operazione è semplice e facile da imparare. Ci sono molti dettagli in questo semplice programma che possono essere presentati meglio attraverso il video.Per iniziare, coltivare le cellule staminali mesenchimali a oltre il 90% di confluenza. Sostituire il terreno di coltura in ogni piatto con 8 ml di alfa-MEM integrato. Dopo 48 ore di coltura, le cellule devono essere coltivate uniformemente per raccogliere completamente il terreno di coltura in provette da centrifuga da 50 ml.Quindi, centrifugare il terreno di coltura a 800 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in tubi conici da 1,5 mL per rimuovere i frammenti cellulari e i detriti cellulari. Centrifugare il surnatante a 16.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Utilizzare una pipetta per trasferire la sospensione in tubi ultracentrifuga. Quindi, centrifugare a 150.000 x g per due ore a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet di microvescicole in 50 uL di PBS per piatto.Scartare il surnatante e raccogliere il residuo, che è esosomi. Risospendere gli esosomi da sette piatti di cellule in 50 uL di PBS. In un tubo da 15 ml, diluire 1 uL di vescicole extracellulari in 1.499 uL di PBS e mescolare.Quindi, avviare il software compatibile per l'analizzatore di tracciamento. Riempire la cella del campione con acqua distillata e quindi consentire allo strumento di avviare il controllo della cella. Calibrare lo strumento con una soluzione standard preparata.Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia compreso tra 50 e 400, preferibilmente circa 200, e fare clic su OK. Quindi, sciacquare la cella del campione con 5 ml di acqua distillata. Prima dell'analisi del campione, lavare il canale con 1 mL di acqua distillata.Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia inferiore a 10. In un tubo conico da 1,5 ml, risospendere le vescicole extracellulari con 250 uL di PBS. In un altro tubo conico da 1,5 ml, preparare la soluzione di lavoro del colorante PKH26.Mescolare le vescicole extracellulari risospese con la soluzione di lavoro. Lasciare riposare a temperatura ambiente per cinque minuti e quindi aggiungere 500 uL di FBS impoverito di EV per fermare la reazione. Per le microvescicole, centrifugare a 16.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS per risciacquare il residuo. Centrifugare di nuovo e scartare il surnatante per rimuovere il colorante non legato.Per le microvescicole, centrifugare a 16.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il residuo con 200 uL di PBS. Far cadere 20 uL di sospensione sul vetrino e osservarlo al microscopio a fluorescenza.Risospendere le vescicole extracellulari in 200 uL di PBS, quindi mescolare con soluzione di eparina in un rapporto di volume 10: 1. Posizionare il mouse nel sistema di imaging della vena caudale. Premere l'interruttore per sollevare la leva.Con l'aiuto di un illustratore di vene della coda, eseguire un'iniezione sistematica della sospensione della vescicola extracellulare attraverso la vena della coda. L'analisi della distribuzione granulometrica utilizzando NTA ha dimostrato che la dimensione degli esosomi delle cellule staminali mesenchimali umane variava da 40 a 335 nm, con una dimensione di picco di circa 100 nm. Inoltre, la dimensione delle microvescicole variava da 50 a 445 nm, con una dimensione di picco di 150 nm.La caratterizzazione morfologica degli esosomi ha mostrato che esibivano una tipica forma a coppa. Le vescicole extracellulari sono state etichettate in modo efficiente da PKH26, che è stato osservato dalla vista grossolana come pellet marcati, nonché dalla microscopia fluorescente. L'operatore deve prestare attenzione durante la raccolta del surnatante perché le cellule devono essere soffiate uniformemente per raccogliere completamente le EV rilasciate trattenute nell'indistinguibile delle cellule staminali mesenchimali.Al fine di verificare il successo dell'iniezione, è possibile eseguire l'imaging in vivo della biodistribuzione di EV marcate con fluorescenza o sezioni congelate di specifici siti tissutali di attecchimento.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Ricerca

Biologia

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Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

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Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

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Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

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Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

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