Name: isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 og 82170988) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 og BX20190380). Vi er takknemlige for hjelp fra National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) og Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center of Air Force Medical University.

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved det fjerde militære medisinske universitetet og utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for pleie og bruk av forsøksdyr. Åtte uker gamle C57Bl/6-mus (ingen preferanse for verken hunner eller hanner) ble brukt. Kryopreserverte humane navlestrengsavledede MSC (UCMSC), brukt til denne studien, ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). Bruken av humane celler ble godkjent av etikkomiteen for fjerde milit...

<ol>
	<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+in+bone+disorders:+Novel+cell-free+therapeutic+strategy.">The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).</li><li>Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+applications+of+multipotential+mesenchymal/stromal+stem+cells+in+skeletal+tissue+repair.">The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair.</a> Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).</li><li>Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+functions+of+mesenchymal+stromal/stem+cells+mediated+via+paracrine+activity.">The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+miRNAs:+From+Biomarkers+to+Mediators+of+Physiology+and+Disease.">Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).</li><li>Lei, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Obesity-Related+Insulin+Resistance.">Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).</li><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Boing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer.">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+Transplantation+Improves+Osteopenia+via+Epigenetic+Regulation+of+Notch+Signaling+in+Lupus.">MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).</li><li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+protection+by+mesenchymal+stem+cell+transplantation+identifies+exosomal+MiR-21+as+a+therapeutic+for+retinal+degeneration.">Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHED+aggregate+exosomes+shuttled+miR-26a+promote+angiogenesis+in+pulp+regeneration+via+TGF-beta/SMAD2/3+signalling.">SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling.</a> Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).</li><li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+educated+mesenchymal+stem+cells+accelerate+cutaneous+wound+healing+via+promoting+angiogenesis.">Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis.</a> Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosome+promotes+M2+polarization+and+enhances+cutaneous+wound+healing.">MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing.</a> Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).</li><li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles.">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-associated+procoagulant+phospholipid+and+tissue+factor+activity+in+multiple+myeloma.">Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma.</a> PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration.">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease.">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li><li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes.">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance.">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).</li></ol>

Elbiler dukker opp til å spille en viktig rolle i ulike biologiske aktiviteter, inkludert antigenpresentasjon, transport av genetisk materiale, modifisering av cellemikromiljø og andre. Videre gir deres brede anvendelse nye tilnærminger og muligheter for diagnostisering og behandling av sykdommer21. Implementering av terapeutiske anvendelser av elbiler er basert på vellykket isolering og karakterisering. På grunn av mangelen på standardiserte isolasjons- og rensemetoder og den lave utvinning...

Stamceller er udifferensierte pluripotente celler med selvfornyelsesevne og translasjonspotensial1. Mesenkymale stamceller (MSC) blir lett isolert, dyrket, utvidet og renset i laboratoriet, som forblir karakteristisk for stamceller etter flere passasjer. I de senere år har økende bevis støttet synspunktet om at MSC opptrer i en parakrin modus ved terapeutisk bruk 2,3. Spesielt sekresjonen av ekstracellulære vesikler (EV) spiller en avgjørende rolle i formidling av MSCs biologiske funksjoner. Som heterogene membranøse nanopartikler frigjort fra de fleste celletyper, består EV av underkategorier kalt eksosomer (Exos), mikrovesikler (MV) og enda større apoptotiske legemer 4,5. Blant dem er Exos den mest studerte EV med en størrelse på 40-150 nm, som er av endosomal opprinnelse og aktivt utskilt under fysiologiske forhold. MVer dannes ved å kaste direkte fra overflaten av celleplasmamembranen med en diameter på 100-1000 nm, som er preget av høyt uttrykk av fosfatidylserin og ekspresjon av overflatemarkører av donorceller6. EV inneholder RNA, proteiner og andre bioaktive molekyler, som har lignende funksjoner som foreldrecellene og spiller en betydelig rolle i cellekommunikasjon, immunrespons og reparasjon av vevskader7. MSC-EV har blitt mye undersøkt som et kraftig cellefritt terapeutisk verktøy i regenerativ medisin8.
Isolering og rensing av MSC-avledede elbiler er et vanlig problem innen forskning og anvendelse. For tiden er differensial- og tetthetsgradient ultrasentrifugering9, ultrafiltreringsprosess10, immunomagnetisk separasjon 11, molekylær eksklusjonskromatograf 12 og mikrofluidisk chip13 mye brukte metoder i isolering og rensing av EV. Med fordelene og ulempene ved hver tilnærming, kan mengden, renheten og aktiviteten til innsamlede elbiler ikke tilfredsstilles samtidig14,15. I denne studien er differensialsentrifugeringsprotokollen for isolasjon og karakterisering av elbiler fra dyrkede MSC-er vist i detalj, noe som har støttet effektiv terapeutisk bruk 16,17,18,19,20. Tilpasningsevnen til denne metoden for en rekke nedstrøms tilnærminger, som fluorescerende merking, lokal transplantasjon og systemisk injeksjon, har videre blitt eksemplet. Implementering av denne prosedyren vil adressere behovet for enkel og pålitelig innsamling og anvendelse av MSC-EVs i translasjonsforskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% povidone-iodine (Betadine)</td>
			<td>Weizhenyuan</td>
			<td>10053956954292</td>
			<td>Wound disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration solution</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>110-0020</td>
			<td>Calibrate the NTA instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53716-49-7</td>
			<td>Analgesic medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caudal vein imager&#160;</td>
			<td>KEW Life Science</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td>Caudal vein imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon-coated square mesh</td>
			<td>PBL Assay Science&#160;</td>
			<td>24916-25</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Zhongke Life Science</td>
			<td>Z8G5JBMz</td>
			<td>Post-treatment care of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7980</td>
			<td>Systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td>Animal anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C12571500BT</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analyzer</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView PMX120</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0015</td>
			<td>Resuspend EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Procell Life Science</td>
			<td>PB180120</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>Labeling EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch</td>
			<td>Acuderm</td>
			<td>69038-10-50</td>
			<td>Skin defects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>Version 8.05.14 SP7&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic equipment</td>
			<td>Grant</td>
			<td>v-0001-0005</td>
			<td>Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>HT7800</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCMSCs</td>
			<td>Bai&#39;ao&#160;</td>
			<td>UKK220201</td>
			<td>Commercially UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure filtered water purification system</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>IQ 7000</td>
			<td>Preparation of ultrapure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells

Ekstracellulære vesikler (EV) er heterogene membrannanopartikler frigjort av de fleste celletyper, og de blir stadig mer anerkjent som fysiologiske regulatorer av organisatorisk homeostase og viktige indikatorer på patologier; I mellomtiden vokser deres enorme potensial for å etablere tilgjengelige og kontrollerbare sykdomsbehandlinger fram. Mesenkymale stamceller (MSC) kan frigjøre store mengder EV i kultur, som har vist løfte om å starte effektiv vevregenerering og legge til rette for omfattende terapeutiske applikasjoner med god skalerbarhet og reproduserbarhet. Det er en økende etterspørsel etter enkle og effektive protokoller for innsamling og anvendelse av MSC-EV-er. Her er det gitt en detaljert protokoll basert på differensiell sentrifugering for å isolere og karakterisere representative elbiler fra dyrkede humane MSC-er, eksosomer og mikrovesikler for videre anvendelser. Tilpasningsevnen til denne metoden er vist for en rekke nedstrøms tilnærminger, for eksempel merking, lokal transplantasjon og systemisk injeksjon. Implementeringen av denne prosedyren vil adressere behovet for enkel og pålitelig MSC-EVs innsamling og anvendelse i translasjonsforskning.

MV-er og Exo-er fra dyrkede humane UCMSC-er isoleres etter den eksperimentelle arbeidsflyten (figur 1). NTA-resultatene viser at størrelsen på Exos fra menneskelige MSCer varierer fra 40 nm til 335 nm med en toppstørrelse på ca. 100 nm, og størrelsen på MVer varierer fra 50 nm til 445 nm med en toppstørrelse på 150 nm (figur 2). Morfologisk karakterisering av MSC-avledet Exos viser en typisk koppform (figur 3). Elbiler merke...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Den nåværende protokollen beskriver differensialsentrifugeringen for isolering og karakterisering av representative EV (eksosomer og mikrovesikler) fra dyrkede humane MSC-er. Ytterligere anvendelser av disse elbilene er også forklart i denne artikkelen.

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse av ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Denne prosedyren adresserte behovet for enkel og pålitelig mesenkymal stamcelleavledet ekstracellulær vesikkelsamling, og anvendelse i oversettelse av forskning. Innsamling av ekstracellulære vesikler ved differensialsentrifugering er enkel, lett skalerbar og reproduserbar, noe som vil være nyttig for feltet. Ekstracellulære vesikler indistinct}fra indistinct}mesenkymal stamcelle er en indistinct}applikasjon i moderne sykdomsbehandlinger.Jeg vil ikke være redd for feil. Denne operasjonen er enkel og lett å lære. Det er mange detaljer i dette enkle programmet som bedre kan presenteres gjennom video.For å begynne, kultur mesenkymale stamceller til mer enn 90% sammenløp. Bytt ut kulturmediet i hver tallerken med 8 ml supplert alfa-MEM. Etter 48 timers kultur må cellene dyrkes jevnt for å samle kulturmediet fullt ut i 50 ml sentrifugerør.Deretter sentrifugerer du kulturmediet ved 800 x g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til 1,5 ml koniske rør for å fjerne cellefragmentene og cellulært rusk. Sentrifuge supernatanten ved 16.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius.Bruk en pipette til å overføre suspensjonen til ultrasentrifugerør. Deretter sentrifuge ved 150.000 x g i to timer ved fire grader Celsius. Resuspender mikrovesikkelpelleten i 50 uL PBS per tallerken.Kast supernatanten og samle resten, som er eksosomer. Resuspender eksosomene fra syv retter av celler i 50 uL PBS. I et 15 ml rør, fortynn 1 uL ekstracellulære vesikler i 1, 499 uL PBS og bland.Start deretter den kompatible programvaren for sporingsanalysatoren. Fyll prøvecellen med destillert vann og la instrumentet starte cellekontrollen. Kalibrer instrumentet med en forberedt standardløsning.Kontroller at partikkelnummeret som vises på programvaredeteksjonsgrensesnittet er mellom 50 og 400, helst rundt 200, og klikk ok. Skyll deretter prøvecellen med 5 ml destillert vann. Før prøveanalyse, skyll kanalen med 1 ml destillert vann.Kontroller at partikkelnummeret som vises på programvaredeteksjonsgrensesnittet, er mindre enn 10. I et 1,5 ml konisk rør, resuspender de ekstracellulære vesiklene med 250 uL PBS. I et annet 1,5 ml konisk rør, lag arbeidsløsningen av PKH26-fargestoffet.Bland de resuspenderte ekstracellulære vesiklene med arbeidsløsningen. La den stå i romtemperatur i fem minutter, og tilsett deretter 500 uL EV-utarmet FBS for å stoppe reaksjonen. For mikrovesikler, sentrifuge ved 16.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius.Kast supernatanten. Tilsett 1 ml PBS for å skylle restene. Sentrifuge igjen, og kast supernatanten for å fjerne det ubundne fargestoffet.For mikrovesikler, sentrifuge ved 16.000 x g i 30 minutter ved fire grader Celsius. Resuspender resten med 200 uL PBS. Slipp 20 uL suspensjon på lysbildet og observer det under et fluorescensmikroskop.Resuspender ekstracellulære vesikler i 200 uL PBS, og bland deretter med heparinoppløsning i et volumforhold på 10: 1. Plasser musen i det kaudale veneavbildningssystemet. Trykk på bryteren for å løfte spaken.Ved hjelp av en hale vene illustratør, utfør en systematisk injeksjon av den ekstracellulære vesikkelsuspensjonen gjennom halvenen. Analyse av partikkelstørrelsesfordeling ved hjelp av NTA viste at størrelsen på eksosomer fra humane mesenkymale stamceller varierte fra 40 til 335 nm, med en toppstørrelse på ca. 100 nm. Også størrelsen på mikrovesikler varierte fra 50 til 445 nm, med en toppstørrelse på 150 nm.Morfologisk karakterisering av eksosomer viste at de viste en typisk koppform. Ekstracellulære vesikler ble effektivt merket av PKH26, som ble observert ved grov visning som merkede pellets, samt ved fluorescerende mikroskopi. Operatøren bør være oppmerksom under supernatantinnsamling, fordi celler må blåses jevnt for fullt ut å samle de frigjorte EVene som beholdes i indistinct} av mesenkymale stamceller.For å verifisere injeksjonens suksess kan in vivo-avbildning av biodistribusjon av fluorescensmerkede elbiler eller frosne seksjoner av spesifikke vevssteder for innsetting utføres.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolasjon &amp; Karakterisering av Hoechst Lav CD45 Negative Mus Lung stamceller

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolering og karakterisering høy gjennomstrømning ekstracellulære Flux analyse av musen primære nyre rørformede epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...