Name: isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81930025 ve 82170988) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi (AMFU) ve Hava Kuvvetleri Tıp Üniversitesi Askeri Tıbbi İnovasyon Merkezi Analitik ve Test Merkez Laboratuvarı'nın yardımları için minnettarız.

Tüm hayvan prosedürleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sekiz haftalık C57Bl / 6 fareler (dişi veya erkek tercihi yok) kullanıldı. Bu çalışma için kullanılan kriyokorunmuş insan göbek kordonu türevli MSC'ler (UCMSC'ler), ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. İnsan hücrelerini...

<ol>
	<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+in+bone+disorders:+Novel+cell-free+therapeutic+strategy.">The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).</li><li>Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+applications+of+multipotential+mesenchymal/stromal+stem+cells+in+skeletal+tissue+repair.">The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair.</a> Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).</li><li>Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+functions+of+mesenchymal+stromal/stem+cells+mediated+via+paracrine+activity.">The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+miRNAs:+From+Biomarkers+to+Mediators+of+Physiology+and+Disease.">Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).</li><li>Lei, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Obesity-Related+Insulin+Resistance.">Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).</li><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Boing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer.">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC+Transplantation+Improves+Osteopenia+via+Epigenetic+Regulation+of+Notch+Signaling+in+Lupus.">MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).</li><li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+protection+by+mesenchymal+stem+cell+transplantation+identifies+exosomal+MiR-21+as+a+therapeutic+for+retinal+degeneration.">Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHED+aggregate+exosomes+shuttled+miR-26a+promote+angiogenesis+in+pulp+regeneration+via+TGF-beta/SMAD2/3+signalling.">SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling.</a> Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).</li><li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+educated+mesenchymal+stem+cells+accelerate+cutaneous+wound+healing+via+promoting+angiogenesis.">Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis.</a> Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosome+promotes+M2+polarization+and+enhances+cutaneous+wound+healing.">MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing.</a> Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).</li><li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles.">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-associated+procoagulant+phospholipid+and+tissue+factor+activity+in+multiple+myeloma.">Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma.</a> PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162 (2016).</li><li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration.">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease.">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li><li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes.">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance.">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).</li></ol>

EV'ler, antijen sunumu, genetik materyal taşınması, hücre mikroçevre modifikasyonu ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktivitelerde önemli bir rol oynamak için ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, geniş uygulamaları hastalıkların teşhisi ve tedavisi için yeni yaklaşımlar ve fırsatlar getirmektedir21. EV'lerin terapötik uygulamalarının uygulanması, başarılı izolasyon ve karakterizasyona dayanmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış izolasyon ve safla...

Kök hücreler kendini yenileme yeteneğine ve translasyonel potansiyele sahip farklılaşmamış pluripotent hücrelerdir1. Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) laboratuvarda kolayca izole edilir, kültürlenir, genişletilir ve saflaştırılır, bu da çoklu geçişlerden sonra kök hücrelerin karakteristiği olarak kalır. Son yıllarda, artan kanıtlar, MSC'lerin terapötik kullanımda parakrin modda hareket ettiği görüşünü desteklemektedir 2,3. Özellikle hücre dışı veziküllerin (EV) salgılanması, MSC'lerin biyolojik fonksiyonlarına aracılık etmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Çoğu hücre tipinden salınan heterojen membranöz nanopartiküller olarak, EV'ler eksozomlar (Exos), mikro-parçacıklar (MV'ler) ve hatta daha büyük apoptotik cisimler 4,5 olarak adlandırılan alt kategorilerden oluşur. Bunlar arasında Exos, endozomal kökenli ve fizyolojik koşullarda aktif olarak salgılanan 40-150 nm büyüklüğünde en çok çalışılan EV'dir. MV'ler, yüksek fosfatidilserin ekspresyonu ve donör hücrelerin yüzey belirteçlerinin ekspresyonu ile karakterize edilen 100-1.000 nm çapında hücre plazma zarının yüzeyinden doğrudan dökülerek oluşturulur6. EV'ler, ana hücrelere benzer işlevlere sahip olan ve hücre iletişimi, bağışıklık tepkisi ve doku hasarı onarımında önemli bir rol oynayan RNA, proteinler ve diğer biyoaktif molekülleri içerir7. MSC-EV'ler, rejeneratif tıpta güçlü bir hücresiz terapötik araç olarak geniş çapta araştırılmıştır8.
MSC kaynaklı EV'lerin izolasyonu ve saflaştırılması, araştırma ve uygulama alanında yaygın bir konudur. Günümüzde, diferansiyel ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme9, ultrafiltrasyon işlemi 10, immünomanyetik ayırma 11, moleküler dışlama kromatografı12 ve mikroakışkan çip13, EV'lerin izolasyonunda ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Her yaklaşımın avantajları ve dezavantajları ile, toplanan EV'lerin miktarı, saflığı ve aktivitesi aynı anda karşılanamaz14,15. Bu çalışmada, EV'lerin kültürlü MSC'lerden izolasyonu ve karakterizasyonunun diferansiyel santrifüjleme protokolü ayrıntılı olarak gösterilmiş olup, etkin terapötik kullanımı desteklemiştir 16,17,18,19,20. Bu yöntemin floresan etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımına uyarlanabilirliği daha da örneklenmiştir. Bu prosedürün uygulanması, MSC-EV'lerin çeviri araştırmalarında basit ve güvenilir bir şekilde toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% povidone-iodine (Betadine)</td>
			<td>Weizhenyuan</td>
			<td>10053956954292</td>
			<td>Wound disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration solution</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>110-0020</td>
			<td>Calibrate the NTA instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53716-49-7</td>
			<td>Analgesic medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caudal vein imager&#160;</td>
			<td>KEW Life Science</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td>Caudal vein imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418R</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon-coated square mesh</td>
			<td>PBL Assay Science&#160;</td>
			<td>24916-25</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Zhongke Life Science</td>
			<td>Z8G5JBMz</td>
			<td>Post-treatment care of animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7980</td>
			<td>Systemic injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-22</td>
			<td>Animal anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C12571500BT</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analyzer</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView PMX120</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0015</td>
			<td>Resuspend EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Procell Life Science</td>
			<td>PB180120</td>
			<td>Culture of UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>Labeling EVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch</td>
			<td>Acuderm</td>
			<td>69038-10-50</td>
			<td>Skin defects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>Version 8.05.14 SP7&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic equipment</td>
			<td>Grant</td>
			<td>v-0001-0005</td>
			<td>Water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>HT7800</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCMSCs</td>
			<td>Bai&#39;ao&#160;</td>
			<td>UKK220201</td>
			<td>Commercially UCMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>XPN-100</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure filtered water purification system</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>IQ 7000</td>
			<td>Preparation of ultrapure water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and therapeutic application of extracellular vesicles from cultured human mesenchymal stem cells

Hücre dışı veziküller (EV'ler), çoğu hücre tipi tarafından salınan heterojen membran nanopartikülleridir ve organizma homeostazının fizyolojik düzenleyicileri ve patolojilerin önemli göstergeleri olarak giderek daha fazla tanınmaktadır; Bu arada, erişilebilir ve kontrol edilebilir hastalık terapötikleri oluşturmak için muazzam potansiyelleri ortaya çıkmaktadır. Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), etkili doku rejenerasyonunu hızlandırma ve iyi ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik ile kapsamlı terapötik uygulamaları kolaylaştırma sözü veren kültürde büyük miktarda EV'yi serbest bırakabilir. MSC-EV'lerin toplanması ve uygulanması için basit ve etkili protokollere yönelik artan bir talep vardır. Burada, temsili EV'leri kültürlü insan MSC'lerinden, eksozomlardan ve mikro-parçacıklardan izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntemin uyarlanabilirliği, etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımı için gösterilmiştir. Bu prosedürün uygulanması, translasyonel araştırmalarda basit ve güvenilir MSC-EV'lerin toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.

Kültürlü insan KMLSC'lerinden MV'ler ve Exo'lar, deneysel iş akışını takiben izole edilir (Şekil 1). NTA sonuçları, insan MSC'lerinden Exos'un boyutunun yaklaşık 100 nm'lik bir tepe boyutuyla 40 nm ila 335 nm arasında değiştiğini ve MV'lerin boyutunun 150 nm'lik bir tepe boyutuyla 50 nm ila 445 nm arasında değiştiğini göstermektedir (Şekil 2). MSC kaynaklı Exos'un morfolojik karakterizasyonu tipik bir fincan şekli sergiler (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Bu prosedür, basit ve güvenilir mezenkimal kök hücre kaynaklı hücre dışı vezikül toplama ve araştırmanın çevirisinde uygulama ihtiyacını ele almıştır. Diferansiyel santrifüjleme ile hücre dışı veziküllerin toplanması basit, kolayca ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, bu da alan için yararlı olacaktır. Hücre dışı veziküller belirsiz}den belirsiz}mezenkimal kök hücre, modern hastalık tedavilerinde belirsiz bir uygulamadır.Hatalardan korkmayacağım. Bu işlem basit ve öğrenmesi kolaydır. Bu basit programda video yoluyla daha iyi sunulabilecek birçok ayrıntı var.Başlamak için, mezenkimal kök hücreleri% 90'dan fazla birleşime kültürleyin. Her yemekteki kültür ortamını 8 mL takviyeli alfa-MEM ile değiştirin. 48 saatlik kültürden sonra, kültür ortamını 50 mL santrifüj tüplerine tamamen toplamak için hücreler eşit şekilde büyütülmelidir.Ardından, kültür ortamını 800 x g'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre parçalarını ve hücresel kalıntıları çıkarmak için süpernatantı 1.5 mL konik tüplere aktarın. Süpernatantı 16.000 x g'de dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin.Süspansiyonu ultrasantrifüj tüplerine aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra, dört santigrat derecede iki saat boyunca 150.000 x g'de santrifüj. Mikro-parçacıklı peleti çanak başına 50 uL PBS'de tekrar askıya alın.Süpernatantı atın ve eksozomlar olan kalıntıyı toplayın. Eksozomları 50 uL PBS'deki yedi hücre kabından yeniden askıya alın. 15 mL'lik bir tüpte, 1.499 uL PBS'de 1 uL hücre dışı vezikülü seyreltin ve karıştırın.Ardından, izleme analizörü için uyumlu yazılımı başlatın. Numune hücresini damıtılmış suyla doldurun ve ardından cihazın hücre kontrolünü başlatmasına izin verin. Cihazı hazırlanmış bir standart çözelti ile kalibre edin.Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 50 ila 400 arasında, tercihen 200 civarında olduğundan emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Daha sonra, numune hücresini 5 mL damıtılmış su ile durulayın. Numune analizinden önce, kanalı 1 mL damıtılmış su ile yıkayın.Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 10'dan az olduğundan emin olun. 1.5 mL'lik bir konik tüpte, hücre dışı vezikülleri 250 uL PBS ile yeniden askıya alın. Başka bir 1.5 mL konik tüpte, PKH26 boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın.Askıya alınmış hücre dışı vezikülleri çalışma çözeltisi ile karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika bekletin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 500 uL EV tükenmiş FBS ekleyin. Mikro-parçacıklar için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj.Supernatan'ı atın. Kalıntıyı durulamak için 1 mL PBS ekleyin. Tekrar santrifüj yapın ve bağlanmamış boyayı çıkarmak için süpernatantı atın.Mikro-parçacıklar için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj. Kalıntıyı 200 uL PBS ile yeniden askıya alın. Slaytın üzerine 20 uL süspansiyon bırakın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin.Hücre dışı vezikülleri 200 uL PBS'de yeniden askıya alın ve daha sonra 10: 1 hacim oranında heparin çözeltisi ile karıştırın. Fareyi kaudal ven görüntüleme sistemine yerleştirin. Kolu kaldırmak için düğmeye basın.Bir kuyruk damarı illüstratör yardımıyla, hücre dışı vezikül süspansiyonunun kuyruk damarından sistematik bir enjeksiyonunu gerçekleştirin. NTA kullanılarak partikül boyutu dağılımının analizi, insan mezenkimal kök hücrelerinden gelen eksozomların boyutunun, yaklaşık 100 nm'lik bir tepe boyutu ile 40 ila 335 nm arasında değiştiğini göstermiştir. Ayrıca, mikro-parçacıkların boyutu, tepe boyutu 150 nm olan 50 ila 445 nm arasında değişmiştir.Eksozomların morfolojik karakterizasyonu, tipik bir fincan şekli sergilediklerini göstermiştir. Hücre dışı veziküller, etiketli peletler olarak brüt görünüm ve floresan mikroskopi ile gözlemlenen PKH26 tarafından etkili bir şekilde etiketlendi. Operatör süpernatant toplama sırasında dikkat etmelidir, çünkü mezenkimal kök hücrelerin belirsizliğinde tutulan serbest bırakılan EV'leri tam olarak toplamak için hücreler eşit şekilde üflenmelidir.Enjeksiyonun başarısını doğrulamak için, floresan etiketli EV'lerin biyodağılımının in vivo görüntülemesi veya engraftmanın spesifik doku bölgelerinin dondurulmuş bölümleri yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...