Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Vi takker Bill Anderson, Charles Bowman og Jean-Christophe Ducom (TSRI) for hjælp med mikroskopi, Leginon installationer og dataoverførselsinfrastruktur. Vi takker også Gordon Louie (Salk Institute) og Yong Zi Tan (National University of Singapore) for den kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) for at give os plasmidet til ekspression af DPS. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 og R01AI136680 til DL), National Science Foundation (NSF MCB-2048095 til DL), Hearst Foundations (til DL) og Arthur og Julie Woodrow Chair (til J. P. N.).

1. Forberedelse af prøver
<ol><li>Brug gitre, der indeholder guldfolie og guldgitterunderstøttelse16 (se materialetabel), fordi vippet dataindsamling kan fremhæve stråleinduceret bevægelse17. BEMÆRK: I denne undersøgelse blev prøver på gitter forglasset ved hjælp af manuel nedsænknings- og blottingteknik18 i et befugtet (større end 80%) kølerum (~ 4 ° C).</li>
	<li>Undgå at bruge gitter, der indeh...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis.">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. NYSBC.org Homepage Available from: <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022)</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li><li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy.">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

Foretrukken partikelorientering forårsaget af prøvens vedhæftning til luft-vand-grænsefladen er en af de sidste store flaskehalse for rutinemæssig strukturbestemmelse med høj opløsning ved hjælp af cryo-EM SPA 4,5,6. Dataindsamlingsskemaet, der præsenteres her, giver en let at implementere strategi til forbedring af orienteringsfordelingen af partikler inden for et datasæt. Vi bemærker, at protokollen ikke kræver yde...

Fremkomsten af direkte elektrondetektorer i løbet af det sidste årti 1,2,3 har ansporet en eksponentiel stigning i antallet af højopløsningsstrukturer af makromolekyler og makromolekylære samlinger løst ved hjælp af enkeltpartikelkryo-EM 4,5,6. Næsten alle oprensede makromolekylære arter forventes at kunne struktureres ved hjælp af cryo-EM, bortset fra de mindste proteiner ~10 kDa i størrelse eller under7. Den mængde udgangsmateriale, der er nødvendig til gitterforberedelse og strukturbestemmelse, er mindst en størrelsesorden mindre end andre strukturbestemmelsesteknikker, såsom kernemagnetisk resonansspektroskopi og røntgenkrystallografi 4,5,6.
En væsentlig udfordring for strukturbestemmelse ved cryo-EM involverer imidlertid passende gitterforberedelse til billeddannelse. En omfattende undersøgelse, der evaluerede forskellige prøver ved hjælp af forskellige forglasningsstrategier og gitre, foreslog, at de fleste tilgange til forglasningsprøver på kryo-EM-gitter fører til præferencevedhæftning af makromolekyler til luft-vand-grænsefladen8. En sådan vedhæftning kan potentielt forårsage fire suboptimale resultater: (1) den makromolekylære prøve denaturerer fuldstændigt, i hvilket tilfælde ingen vellykket dataindsamling og -behandling er mulig; (2) prøven denaturerer delvist, i hvilket tilfælde det kan være muligt at opnå strukturel indsigt fra områder af makromolekylet, der ikke er beskadiget; (3) prøven bevarer sin oprindelige struktur, men kun ét sæt partikelorienteringer i forhold til elektronstrålens retning er repræsenteret på billederne; (4) prøven bevarer sin oprindelige struktur, og nogle, men ikke alle mulige partikelorienteringer i forhold til elektronstrålens retning er repræsenteret på billederne. I tilfælde (3) og (4) vil vippet dataindsamling hjælpe med at minimere retningsbestemt opløsningsanisotropi, der påvirker det rekonstruerede kryo-EM-kort og giver en generaliserbar løsning til en lang række prøver9. Teknisk set kan hældning også gavne tilfælde (2), da denatureringen formodentlig forekommer ved luft-vand-grænsefladen og tilsvarende begrænser antallet af forskellige retninger, der er repræsenteret i dataene. Omfanget af orienteringsbias i datasættet kan potentielt ændres ved at eksperimentere med løsningsadditiver, men manglen på bred anvendelighed hæmmer disse trial-and-error-tilgange. Hældning af prøvetrinnet i en enkelt optimeret hældningsvinkel er tilstrækkelig til at forbedre fordelingen af orienteringer i kraft af ændring af geometrien i billeddannelseseksperimentet9 (figur 1). På grund af den geometriske konfiguration af den fortrinsvis orienterede prøve i forhold til elektronstrålen genererer hældning af gitteret for hver klynge af præferenceorienteringer en kegle af belysningsvinkler i forhold til klyngecentroiden. Derfor spreder dette synspunkterne ud og forbedrer følgelig Fourier-rumprøvetagning og isotropien af retningsbestemt opløsning.
Der er i praksis nogle ulemper ved at vippe scenen. Hvis prøvetrinnet vippes, introduceres en fokusgradient på tværs af synsfeltet, hvilket kan påvirke nøjagtigheden af CTF-estimater (contrast transfer function). Vippet dataindsamling kan også føre til øget stråleinduceret partikelbevægelse forårsaget af øgede opladningseffekter ved billeddannelse af vippede prøver. Gitterhældning fører også til en stigning i tilsyneladende istykkelse, hvilket igen fører til mere støjende mikrografier og i sidste ende kan påvirke opløsningen af rekonstruktioner 5,9,10. Det kan være muligt at løse disse problemer ved at anvende avancerede beregningsmæssige databehandlingsordninger, der kort beskrives i protokol- og diskussionsafsnittene. Endelig kan hældning føre til øget partikeloverlapning, hvilket forhindrer den efterfølgende billedbehandlingsrørledning. Selvom dette til en vis grad kan afbødes ved at optimere partikelkoncentrationen på nettet, er det ikke desto mindre en vigtig overvejelse. Her beskrives en protokol, der er enkel at implementere, til vippedataindsamling ved hjælp af Leginon softwarepakken (en automatiseret billedoptagelsessoftware), tilgængelig åben adgang og kompatibel med en bred vifte af mikroskoper11,12,13,14. Metoden kræver mindst version 3.0 eller nyere, med version 3.3 og senere, der indeholder dedikerede forbedringer for at muliggøre vippet dataindsamling. Ingen yderligere software eller udstyr er nødvendig for denne protokol. Omfattende instruktioner om beregningsinfrastruktur og installationsvejledninger findes andetsteds15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

Enkeltpartikelanalyse (SPA) ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er nu en almindelig teknik til strukturel biologi med høj opløsning. Strukturbestemmelse ved SPA er afhængig af at opnå flere forskellige visninger af et makromolekylært objekt forglasset i et tyndt lag is. Ideelt set ville en samling af ensartet fordelte tilfældige projektionsorienteringer udgøre alle mulige visninger af objektet, hvilket giver anledning til rekonstruktioner præget af isotrop retningsopløsning. Men i virkeligheden lider mange prøver af fortrinsvis orienterede partikler, der klæber til luft-vand-grænsefladen. Dette fører til ikke-ensartede vinkelorienteringsfordelinger i datasættet og inhomogen Fourier-rumprøveudtagning i rekonstruktionen, der oversættes til kort, der er kendetegnet ved anisotrop opløsning. Hældning af prøvestadiet giver en generaliserbar løsning til at overvinde opløsningsanisotropi i kraft af forbedring af ensartetheden af orienteringsfordelinger og dermed isotropien af Fourier-rumprøvetagning. Denne protokol beskriver en vippet fase automatiseret dataindsamlingsstrategi ved hjælp af Leginon, en software til automatiseret billedoptagelse. Proceduren er enkel at implementere, kræver ikke yderligere udstyr eller software og er kompatibel med de fleste standard transmissionselektronmikroskoper (TEM'er), der anvendes til billeddannelse af biologiske makromolekyler.

DPS ved 0,3 mg/ml blev brugt til at demonstrere billeddannelse ved 0°, 30° og 60° hældninger. Data fra forskellige hældningsvinkler blev indsamlet på det samme gitter i forskellige gitterområder. CTF-opløsning, der passer til hældninger med højere vinkel, har tendens til at være dårligere, som det var tilfældet, når man sammenlignede de tre datasæt i denne undersøgelse. Figur 4 viser sammenlignende repræsentative billeder og 2D-klassificeringsgennemsnit. Selvom proteinkoncen...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Denne protokol beskriver et generelt og let at implementere skema til vippet enkeltpartikeldataindsamling i kryo-EM-eksperimenter. En sådan procedure er især nyttig til opnåelse af et EM-kort af høj kvalitet for prøver, der lider af præferenceorienteringsbias på grund af overholdelse af luft-vand-grænsefladen.

Enkeltpartikel-kryo-EM-dataindsamling med scenehældning ved hjælp af Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Vipning af prøvetrinnet giver en enkel og generaliserbar måde at øge orienteringsfordelingen af partikler under enkeltpartikelkryo-EM-dataindsamling. Den ensartede fordeling af partikler opnået på grund af prøvestadiets hældning muliggør forbedring af den samlede kortkvalitet og fortolkningsevne. Begynd med at justere mikroskopet for at sikre parallel belysning af prøven og minimere komaafvigelser.For at identificere de firkanter, der er egnede til dataindsamling, skal du registrere et gitteratlas uden fasehældning eller med fasehældning, som giver et overblik over den overordnede gitterkvalitet og en indledende indikation af egnede områder til dataindsamling. Undersøg kvadraterne manuelt ved den forstørrelse, der bruges i kvadratisk anskaffelsesnode. Se efter de firkanter, hvor folien er intakt, ikke ser dehydreret ud og har ideel istykkelse, og flyt prøvestadiet til en firkant af interesse.Bestem den eucentriske højde for scenepositionen ved hjælp af en alfawobler ved omkring 15 grader scenehældning, og juster Z-højden for at bringe scenen til eucentrisk højde ved hjælp af tastaturpanelet til mikroskopet. Sørg for, at billedskiftet er minimalt under alfa-wobble-rutinen. Hvis du vil finde en mere nøjagtig Z-højde, skal du estimere den i fokusernoden ved den forstørrelse, der bruges i kvadratisk anskaffelsesnode.Juster indstillingerne for fokuseringsnoden, og aktiver eller deaktiver indstillingen fin Z-fokus under den første kø af firkanter. Tryk derefter på Simuler. Vip prøvetrinnet til den ønskede hældningsvinkel til dataindsamling i den sande eucentriske højde, og centrer trinnet igen, hvis det er nødvendigt.Tryk på Simuler i den firkantede anskaffelsesnode for at begynde at sætte mål i kø for eksponeringer for hele anskaffelsesnoder. Vælg derefter et Z-fokusmål og områder med huller, der er egnede til eksponeringer med høj forstørrelse, og send målene til billedkøen. Bring prøvestadiet tilbage til dets ikke-vippede tilstand, og flyt derefter til næste firkant.Gentag disse trin, indtil et tilstrækkeligt antal hele eksponeringer er sat i kø. Når alle firkanter er sat i kø, skal du gå til hele målretningsnoden og trykke på Send mål i kø. Vælg Tillad brugerbekræftelse af valgte mål i nodeindstillinger, og undersøg manuelt de mål, der er valgt af noden til erhvervelse af eksponering med høj forstørrelse, for at teste, om den automatiserede EM-hulfinder nøjagtigt kan identificere de egnede områder til billedoptagelse, når prøvetrinnet vippes.Når brugeren er tilfreds med målretningsnøjagtigheden, skal du fravælge indstillingen Tillad brugerbekræftelse af valgte mål for automatisk dataindsamling. De repræsentative billeder af gitteret ved kvadratisk forstørrelse med forskellige hældningsvinkler indsamlet nær og langt fra den eucentriske Z-højde vises her. Bjælkens centrum er angivet med midten af de røde koncentriske ringe, og den grønne pil angiver kvadratet af interesse.Der er en brudt gitterfunktion ved siden af firkanten af interesse til reference. Her vises de repræsentative huleksponeringer og 2D-klassegennemsnit indsamlet ved 0 grader, 30 grader og 60 graders hældningsvinkler. Selvom proteinkoncentrationen er uændret på tværs af de forskellige hældningsvinkler, får en højere hældningsvinkel det afbildede område til at virke mere overfyldt med hensyn til partikelkoncentration.2D-klassegennemsnit, der påvirkes af overbelægning, vises i denne røde boks. Protokollens enkelhed gør det muligt for enhver standardbruger af mikroskopet nemt at tilpasse en vippet dataindsamlingsstrategi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Fast target seriel dataindsamling på Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...