Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
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Nous remercions Bill Anderson, Charles Bowman et Jean-Christophe Ducom (TSRI) pour leur aide en matière de microscopie, d’installations Leginon et d’infrastructure de transfert de données. Nous remercions également Gordon Louie (Salk Institute) et Yong Zi Tan (Université nationale de Singapour) pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) de nous avoir fourni le plasmide pour l’expression du DPS. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (U54AI150472, U54 AI170855 et R01AI136680 à DL), de la National Science Foundation (NSF MCB-2048095 à DL), des Hearst Foundations (à DL) et Arthur and Julie Woodrow Chair (à J. P. N.).

1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Utilisez des grilles contenant une feuille d’or et un support de grille d’or16 (voir le tableau des matériaux), car la collecte de données inclinée peut accentuer le mouvement induit par le faisceau17. NOTE: Pour la présente étude, des échantillons sur grilles ont été vitrifiés à l’aide de la technique manuelle de plongeon et de buvardage18 dans une cha...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. 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(180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

L’orientation préférée des particules causée par l’adhérence de l’échantillon à l’interface air-eau est l’un des derniers goulots d’étranglement majeurs à la détermination de routine de la structure à haute résolution à l’aide de cryo-EM SPA 4,5,6. Le schéma de collecte de données présenté ici fournit une stratégie facile à mettre en œuvre pour améliorer la distribution d’orientation des part...

L’avènement des détecteurs d’électrons directs au cours de la dernière décennie 1,2,3 a entraîné une augmentation exponentielle du nombre de structures à haute résolution de macromolécules et d’assemblages macromoléculaires résolus à l’aide de cryo-EM 4,5,6 à particule unique. Presque toutes les espèces macromoléculaires purifiées devraient pouvoir être déterminées par cryo-EM, à l’exception des plus petites protéines ~10 kDa de taille ou inférieure à7. La quantité de matière de départ nécessaire pour la préparation de la grille et la détermination de la structure est inférieure d’au moins un ordre de grandeur à celle d’autres techniques de détermination de structure, telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons X 4,5,6.
Cependant, l’un des principaux défis pour la détermination de la structure par cryo-EM implique une préparation de grille appropriée pour l’imagerie. Une étude approfondie évaluant divers échantillons à l’aide de différentes stratégies et grilles de vitrification a suggéré que la plupart des approches de vitrification d’échantillons sur des grilles cryo-EM conduisent à une adhésion préférentielle des macromolécules à l’interface air-eau8. Une telle observance peut potentiellement entraîner quatre résultats sous-optimaux : (1) l’échantillon macromoléculaire se dénature complètement, auquel cas aucune collecte et traitement de données réussis n’est possible ; (2) l’échantillon se dénature partiellement, auquel cas il peut être possible d’obtenir des informations structurelles à partir de régions de la macromolécule qui ne sont pas endommagées; (3) l’échantillon conserve sa structure native, mais un seul ensemble d’orientations de particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons est représenté dans les images; (4) L’échantillon conserve sa structure native, et certaines orientations possibles des particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons sont représentées dans les images. Pour les cas (3) et (4), la collecte de données inclinée aidera à minimiser l’anisotropie de résolution directionnelle affectant la carte cryo-EM reconstruite et fournira une solution généralisable pour une grande variété d’échantillons9. Techniquement, l’inclinaison peut également bénéficier au cas (2), puisque la dénaturation se produit vraisemblablement à l’interface air-eau et limite de la même manière le nombre d’orientations distinctes représentées dans les données. L’étendue du biais d’orientation dans l’ensemble de données peut potentiellement être modifiée en expérimentant avec des additifs de solution, mais un manque d’applicabilité générale entrave ces approches par essais et erreurs. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon à un seul angle d’inclinaison optimisé est suffisant pour améliorer la distribution des orientations en modifiant la géométrie de l’expérience d’imagerie9 (Figure 1). En raison de la configuration géométrique de l’échantillon préférentiellement orienté par rapport au faisceau d’électrons, pour chaque groupe d’orientations préférentielles, l’inclinaison de la grille génère un cône d’angles d’éclairage par rapport au centroïde de l’amas. Par conséquent, cela répartit les vues et améliore par conséquent l’échantillonnage de l’espace de Fourier et l’isotropie de la résolution directionnelle.
Il y a, dans la pratique, certains inconvénients à incliner la scène. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon introduit un dégradé de mise au point dans le champ de vision, ce qui peut affecter la précision des estimations de la fonction de transfert de contraste (CTF). La collecte de données inclinée peut également entraîner une augmentation du mouvement des particules induit par le faisceau causée par des effets de charge accrus lors de l’imagerie d’échantillons inclinés. L’inclinaison de la grille entraîne également une augmentation de l’épaisseur apparente de la glace, ce qui entraîne des micrographies plus bruyantes et peut finalement avoir un impact sur la résolution des reconstructions 5,9,10. Il peut être possible de surmonter ces problèmes en appliquant des schémas de traitement informatique avancés qui sont brièvement décrits dans les sections protocole et discussion. Enfin, l’inclinaison peut entraîner une augmentation du chevauchement des particules, ce qui entrave le pipeline de traitement d’image ultérieur. Bien que cela puisse être atténué dans une certaine mesure en optimisant la concentration de particules sur le réseau, il s’agit néanmoins d’une considération importante. Ici, un protocole simple à mettre en œuvre est décrit pour la collecte de données inclinées à l’aide de la suite logicielle Leginon (un logiciel d’acquisition d’images automatisé), disponible en libre accès et compatible avec une large gamme de microscopes11,12,13,14. La méthode nécessite au moins la version 3.0 ou supérieure, avec les versions 3.3 et ultérieures contenant des améliorations dédiées pour permettre la collecte de données inclinée. Aucun logiciel ou équipement supplémentaire n’est nécessaire pour ce protocole. Des instructions détaillées sur l’infrastructure informatique et des guides d’installation sont fournis ailleurs15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

L’analyse monoparticulaire (SPA) par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est maintenant une technique courante pour la biologie structurale à haute résolution. La détermination de la structure par SPA repose sur l’obtention de plusieurs vues distinctes d’un objet macromoléculaire vitrifié dans une fine couche de glace. Idéalement, une collection d’orientations de projection aléatoires uniformément réparties équivaudrait à toutes les vues possibles de l’objet, donnant lieu à des reconstructions caractérisées par une résolution directionnelle isotrope. Cependant, en réalité, de nombreux échantillons souffrent de particules orientées préférentiellement adhérant à l’interface air-eau. Cela conduit à des distributions d’orientation angulaire non uniformes dans l’ensemble de données et à un échantillonnage inhomogène de l’espace de Fourier dans la reconstruction, se traduisant par des cartes caractérisées par une résolution anisotrope. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon fournit une solution généralisable pour surmonter l’anisotropie de résolution en améliorant l’uniformité des distributions d’orientation, et donc l’isotropie de l’échantillonnage de l’espace de Fourier. Le présent protocole décrit une stratégie de collecte automatisée de données à étapes inclinées à l’aide de Leginon, un logiciel d’acquisition automatisée d’images. La procédure est simple à mettre en œuvre, ne nécessite aucun équipement ou logiciel supplémentaire et est compatible avec la plupart des microscopes électroniques à transmission (MET) standard utilisés pour l’imagerie des macromolécules biologiques.

Le DPS à 0,3 mg/mL a été utilisé pour démontrer l’imagerie à des inclinaisons de 0°, 30° et 60°. Des données provenant de différents angles d’inclinaison ont été recueillies sur la même grille dans différentes régions du réseau. La résolution CTF adaptée aux inclinaisons d’angle plus élevées a tendance à être plus faible, comme ce fut le cas lors de la comparaison des trois ensembles de données de cette étude. La figure 4 montre des images représentatives comp...

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Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Le présent protocole décrit un schéma généralisé et facile à mettre en œuvre pour la collecte de données à une seule particule inclinée dans les expériences cryo-EM. Une telle procédure est particulièrement utile pour obtenir une carte EM de haute qualité pour les échantillons souffrant d’un biais d’orientation préférentielle dû au respect de l’interface air-eau.

Collecte de données cryo-EM à particule unique avec inclinaison de scène à l’aide de Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

L’inclinaison de l’étage de l’échantillon fournit un moyen simple et généralisable d’augmenter la distribution d’orientation des particules lors de la collecte de données cryo-EM à une seule particule. La distribution uniforme des particules obtenue grâce à l’inclinaison de l’étage de l’échantillon permet d’améliorer la qualité globale de la carte et l’interprétabilité. Commencez par aligner le microscope pour assurer un éclairage parallèle de l’échantillon et minimiser les aberrations de coma.Pour identifier les carrés appropriés pour la collecte de données, enregistrez un atlas de grille sans inclinaison de scène ou avec inclinaison de scène, qui fournit une vue d’ensemble de la qualité globale de la grille et une indication initiale des zones appropriées pour la collecte de données. Inspectez manuellement les carrés au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition de carrés. Recherchez les carrés où la feuille est intacte, n’a pas l’air déshydratée et a une épaisseur de glace idéale, et déplacez le stade du spécimen vers un carré d’intérêt.Déterminez la hauteur eucentrique pour la position de la scène à l’aide d’un oscillant alpha à une inclinaison de scène d’environ 15 degrés et ajustez la hauteur Z pour amener la scène à la hauteur eucentrique à l’aide du panneau du clavier pour le microscope. Assurez-vous que le décalage de l’image est minimal pendant la routine d’oscillation alpha. Pour trouver une hauteur Z plus précise, estimez-la dans le nœud de focalisation au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition carrée.Ajustez les paramètres du nœud de mise au point et activez ou désactivez l’option de mise au point Z fine lors de la mise en file d’attente initiale des carrés. Appuyez ensuite sur Simuler. Inclinez l’étage de l’échantillon à l’angle d’inclinaison souhaité pour la collecte de données à la hauteur eucentrique réelle et recentrez l’étage si nécessaire.Appuyez sur Simuler dans le nœud d’acquisition carré pour commencer à mettre en file d’attente les cibles pour les expositions de nœud d’acquisition entier. Ensuite, sélectionnez une cible de mise au point Z et des régions avec des trous adaptés aux expositions à fort grossissement et soumettez les cibles à la file d’attente pour l’imagerie. Ramenez le stade de l’échantillon à son état non incliné, puis passez au carré suivant.Répétez ces étapes jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’expositions entières aient été mises en file d’attente. Une fois que tous les carrés sont mis en file d’attente, accédez à l’ensemble du nœud de ciblage et appuyez sur Soumettre les cibles en file d’attente. Sélectionnez Autoriser l’utilisateur à vérifier les cibles sélectionnées dans les paramètres du nœud et inspectez manuellement les cibles sélectionnées par le nœud d’acquisition d’exposition à fort grossissement pour tester si le détecteur de trous EM automatisé peut identifier avec précision les régions appropriées pour l’acquisition d’images lorsque l’étage de l’échantillon est incliné.Une fois que l’utilisateur est satisfait de la précision du ciblage, désélectionnez l’option Autoriser la vérification par l’utilisateur des cibles sélectionnées pour la collecte automatisée des données. Les images représentatives de la grille à grossissement carré avec différents angles d’inclinaison collectés près et loin de la hauteur Z eucentrique sont montrées ici. Le centre du faisceau est indiqué par le centre des anneaux concentriques rouges et la flèche verte indique le carré d’intérêt.Il y a une grille brisée adjacente au carré d’intérêt pour référence. Les expositions représentatives des trous et les moyennes de classe 2D collectées à des angles d’inclinaison de 0 degré, 30 degrés et 60 degrés. Bien que la concentration de protéines soit inchangée selon les différents angles d’inclinaison, un angle d’inclinaison plus élevé rend la zone imagée plus encombrée en termes de concentration de particules.Les moyennes des classes 2D affectées par le surpeuplement sont indiquées dans cet encadré rouge. La simplicité du protocole permet à tout utilisateur standard du microscope d’adapter facilement une stratégie de collecte de données inclinée.

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High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM et analyse monoparticule avec Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-microscopie électronique à particule unique : de l’échantillon à la structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Collecte de routine d’ensembles de données cryo-EM haute résolution à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...