Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
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Wir danken Bill Anderson, Charles Bowman und Jean-Christophe Ducom (TSRI) für ihre Hilfe bei der Mikroskopie, den Leginon-Installationen und der Datenübertragungsinfrastruktur. Wir danken auch Gordon Louie (Salk Institute) und Yong Zi Tan (National University of Singapore) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) für die Bereitstellung des Plasmids für die Expression von DPS. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 und R01AI136680 an DL), der National Science Foundation (NSF MCB-2048095 an DL), der Hearst Foundations (an DL) und des Arthur and Julie Woodrow Chair (an J. P. N.) unterstützt.

1. Probenvorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie Gitter, die Goldfolie und Goldgitterträger16 enthalten (siehe Materialtabelle), da eine geneigte Datenerfassung die strahlinduzierte Bewegung17 verstärken kann. HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden Proben auf Gittern mit der manuellen Tauch- und Blotting-Technik18 in einem befeuchteten (mehr als 80%) Kühlraum (~4 °C) verglast.</li>
	<li>Vermeiden Sie die Ver...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. 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Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

Die bevorzugte Partikelorientierung, die durch die Anhaftung der Probe an der Luft-Wasser-Grenzfläche verursacht wird, ist einer der letzten großen Engpässe bei der routinemäßigen hochauflösenden Strukturbestimmung mit Kryo-EM SPA 4,5,6. Das hier vorgestellte Datenerhebungsschema bietet eine einfach zu implementierende Strategie zur Verbesserung der Orientierungsverteilung von Partikeln innerhalb eines Datensatzes. Wir wei...

Das Aufkommen von Direktelektronendetektorenin den letzten zehn Jahren 1,2,3 hat zu einem exponentiellen Anstieg der Anzahl hochauflösender Strukturen von Makromolekülen und makromolekularen Anordnungen geführt, die mit Einzelpartikel-Kryo-EM 4,5,6 gelöst wurden. Es wird erwartet, dass fast alle gereinigten makromolekularen Spezies für die Strukturbestimmung mittels Kryo-EM geeignet sind, mit Ausnahme der kleinsten Proteine mit einer Größe von ~10 kDa oder unter7. Die Menge an Ausgangsmaterial, die für die Gittervorbereitung und Strukturbestimmung benötigt wird, ist mindestens um eine Größenordnung geringer als bei anderen Strukturbestimmungstechniken wie Kernspinresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie 4,5,6.
Eine grundsätzliche Herausforderung bei der Strukturbestimmung mittels Kryo-EM besteht jedoch in der geeigneten Gittervorbereitung für die Bildgebung. Eine umfangreiche Studie, in der verschiedene Proben unter Verwendung unterschiedlicher Vitrifikationsstrategien und -gitter ausgewertet wurden, deutete darauf hin, dass die meisten Ansätze zur Vitrifizierung von Proben auf Kryo-EM-Gittern zu einer bevorzugten Adhärenz von Makromolekülen an der Luft-Wasser-Grenzfläche führen8. Eine solche Adhärenz kann potenziell zu vier suboptimalen Ergebnissen führen: (1) Die makromolekulare Probe denaturiert vollständig, in diesem Fall ist keine erfolgreiche Datenerhebung und -verarbeitung möglich; (2) Die Probe denaturiert teilweise, in diesem Fall kann es möglich sein, strukturelle Einblicke aus Regionen des Makromoleküls zu erhalten, die nicht beschädigt sind. (3) Die Probe behält ihre native Struktur bei, aber in den Bildern wird nur ein Satz von Teilchenorientierungen relativ zur Richtung des Elektronenstrahls dargestellt. (4) Die Probe behält ihre native Struktur bei, und einige, aber nicht alle möglichen Partikelorientierungen relativ zur Richtung des Elektronenstrahls sind in den Bildern dargestellt. In den Fällen (3) und (4) hilft die geneigte Datenerfassung bei der Minimierung der Anisotropie der Richtungsauflösung, die sich auf die rekonstruierte Kryo-EM-Karte auswirkt, und bietet eine verallgemeinerbare Lösung für eine Vielzahl von Proben9. Technisch gesehen kann die Neigung auch im Fall (2) von Vorteil sein, da die Denaturierung vermutlich an der Luft-Wasser-Grenzfläche stattfindet und in ähnlicher Weise die Anzahl der in den Daten dargestellten unterschiedlichen Orientierungen begrenzt. Das Ausmaß der Orientierungsverzerrung im Datensatz kann möglicherweise durch das Experimentieren mit Lösungsadditiven verändert werden, aber ein Mangel an breiter Anwendbarkeit behindert diese Trial-and-Error-Ansätze. Das Kippen des Probentisches um einen einzigen optimierten Neigungswinkel reicht aus, um die Verteilung der Orientierungen durch Änderung der Geometrie des Abbildungsexperiments9 zu verbessern (Abbildung 1). Aufgrund der geometrischen Konfiguration der bevorzugt ausgerichteten Probe in Bezug auf den Elektronenstrahl erzeugt die Neigung des Gitters für jeden Cluster bevorzugter Orientierungen einen Kegel von Beleuchtungswinkeln in Bezug auf den Cluster-Schwerpunkt. Dadurch werden die Ansichten ausgeweitet und folglich die Fourier-Raumabtastung und die Isotropie der Richtungsauflösung verbessert.
In der Praxis gibt es einige Nachteile, wenn man die Bühne kippt. Durch das Kippen des Probentisches wird ein Fokusgradient über das Sichtfeld eingeführt, der sich auf die Genauigkeit der CTF-Schätzungen (Contrast Transfer Function) auswirken kann. Die geneigte Datenerfassung kann auch zu einer erhöhten strahlinduzierten Partikelbewegung führen, die durch erhöhte Aufladungseffekte bei der Abbildung geneigter Proben verursacht wird. Die Gitterneigung führt auch zu einer Zunahme der scheinbaren Eisdicke, was wiederum zu verrauschten Schliffbildern führt und letztendlich die Auflösung von Rekonstruktionen beeinflussenkann 5,9,10. Es kann möglich sein, diese Probleme zu überwinden, indem fortgeschrittene computergestützte Datenverarbeitungsschemata angewendet werden, die in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten kurz beschrieben werden. Schließlich kann das Kippen zu einer erhöhten Partikelüberlappung führen, was die nachfolgende Bildverarbeitungspipeline behindert. Obwohl dies bis zu einem gewissen Grad durch die Optimierung der Partikelkonzentration im Netz gemildert werden kann, ist dies dennoch ein wichtiger Aspekt. Hier wird ein einfach zu implementierendes Protokoll für die geneigte Datenerfassung mit der Leginon Software Suite (einer automatisierten Bilderfassungssoftware) beschrieben, das frei zugänglich und mit einer breiten Palette von Mikroskopenkompatibel ist 11,12,13,14. Die Methode erfordert mindestens Version 3.0 oder höher, wobei die Version 3.3 ab Version 3.3 dedizierte Verbesserungen enthält, um eine geneigte Datenerfassung zu ermöglichen. Für dieses Protokoll ist keine zusätzliche Software oder Ausrüstung erforderlich. Ausführliche Anweisungen zur Recheninfrastruktur und zu Installationsanleitungen finden Sie an anderer Stelle15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

Die Einzelpartikelanalyse (SPA) mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist heute eine gängige Technik für die hochauflösende Strukturbiologie. Die Strukturbestimmung durch SPA beruht auf der Gewinnung mehrerer unterschiedlicher Ansichten eines makromolekularen Objekts, das in einer dünnen Eisschicht verglast ist. Im Idealfall würde eine Sammlung von gleichmäßig verteilten zufälligen Projektionsorientierungen alle möglichen Ansichten des Objekts ergeben, was zu Rekonstruktionen führt, die durch eine isotrope Richtungsauflösung gekennzeichnet sind. In der Realität leiden jedoch viele Proben unter bevorzugt orientierten Partikeln, die an der Luft-Wasser-Grenzfläche haften. Dies führt zu ungleichmäßigen Winkelorientierungsverteilungen im Datensatz und inhomogenem Fourier-Raum-Sampling in der Rekonstruktion, was sich in Karten niederschlägt, die durch anisotrope Auflösung gekennzeichnet sind. Die Neigung des Probentisches bietet eine verallgemeinerbare Lösung zur Überwindung der Auflösungsanisotropie durch die Verbesserung der Gleichmäßigkeit der Orientierungsverteilungen und damit der Isotropie der Fourier-Raumabtastung. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine automatisierte Datenerfassungsstrategie mit geneigter Stufe unter Verwendung von Leginon, einer Software zur automatisierten Bilderfassung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren, erfordert keine zusätzliche Ausrüstung oder Software und ist mit den meisten Standard-Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs) kompatibel, die für die Abbildung biologischer Makromoleküle verwendet werden.

DPS bei 0,3 mg/ml wurde verwendet, um die Bildgebung bei 0°-, 30°- und 60°-Neigungen zu demonstrieren. Daten aus verschiedenen Neigungswinkeln wurden auf demselben Gitter in verschiedenen Gitterregionen gesammelt. Die CTF-Auflösung für höhere Neigungen ist tendenziell schlechter, wie es beim Vergleich der drei Datensätze in dieser Studie der Fall war. Abbildung 4 zeigt vergleichende repräsentative Bilder und 2D-Klassifizierungsmittelwerte. Obwohl die Proteinkonzentration über die ve...

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Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein verallgemeinertes und einfach zu implementierendes Schema für die Datenerfassung von gekippten Einzelpartikeln in Kryo-EM-Experimenten. Ein solches Verfahren ist besonders nützlich, um eine qualitativ hochwertige EM-Karte für Proben zu erhalten, die aufgrund der Einhaltung der Luft-Wasser-Grenzfläche unter einer bevorzugten Orientierungsverzerrung leiden.

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Das Kippen des Probentisches bietet eine einfache und verallgemeinerbare Möglichkeit, die Orientierungsverteilung von Partikeln während der Kryo-EM-Datenerfassung von Einzelpartikeln zu erhöhen. Die gleichmäßige Verteilung der Partikel, die durch die Neigung des Probentisches erhalten wird, ermöglicht die Verbesserung der allgemeinen Kartenqualität und Interpretierbarkeit. Beginnen Sie mit der Ausrichtung des Mikroskops, um eine parallele Beleuchtung der Probe zu gewährleisten und Komaaberrationen zu minimieren.Um die für die Datenerhebung geeigneten Quadrate zu identifizieren, erfassen Sie einen Rasteratlas ohne Bühnenneigung oder mit Bühnenneigung, der einen Überblick über die Gesamtrasterqualität und einen ersten Hinweis auf geeignete Bereiche für die Datenerhebung gibt. Überprüfen Sie die Quadrate manuell mit der Vergrößerung, die im Quadraterfassungsknoten verwendet wird. Suchen Sie nach den Quadraten, in denen die Folie intakt ist, nicht dehydriert aussieht und eine ideale Eisdicke aufweist, und verschieben Sie den Probentisch auf ein interessantes Quadrat.Bestimmen Sie die euzentrische Höhe für die Tischposition mit einem Alpha-Wobbler bei einer Bühnenneigung von etwa 15 Grad und stellen Sie die Z-Höhe ein, um die Bühne mit der Tastatur für das Mikroskop auf euzentrische Höhe zu bringen. Stellen Sie sicher, dass die Bildverschiebung während der Alpha-Wobble-Routine minimal ist. Um eine genauere Z-Höhe zu finden, schätzen Sie sie im Okularauszugsknoten bei der Vergrößerung, die im quadratischen Erfassungsknoten verwendet wird.Passen Sie die Einstellungen für den Okularauszugsknoten an und aktivieren oder deaktivieren Sie die Option für den feinen Z-Fokus während der ersten Warteschlange von Quadraten. Drücken Sie dann auf Simulieren. Kippen Sie den Probentisch auf den gewünschten Neigungswinkel für die Datenerfassung auf der wahren euzentrischen Höhe und zentrieren Sie den Tisch bei Bedarf neu.Drücken Sie im quadratischen Erfassungsknoten auf Simulieren, um mit der Warteschlange für die Belichtung ganzer Erfassungsknoten zu beginnen. Wählen Sie als Nächstes ein Z-Fokusziel und Bereiche mit Löchern aus, die für Belichtungen mit hoher Vergrößerung geeignet sind, und senden Sie die Ziele zur Bildgebung an die Warteschlange. Bringen Sie den Probentisch wieder in seinen nicht geneigten Zustand und bewegen Sie sich dann zum nächsten Quadrat.Wiederholen Sie diese Schritte, bis eine ausreichende Anzahl ganzer Aufnahmen in die Warteschlange eingereiht wurde. Sobald alle Quadrate in der Warteschlange stehen, gehen Sie zum gesamten Targeting-Knoten und klicken Sie auf Submit Queued Targets. Wählen Sie in den Knoteneinstellungen die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen aus, und überprüfen Sie die vom Belichtungserfassungsknoten mit hoher Vergrößerung ausgewählten Ziele manuell, um zu testen, ob der automatisierte EM-Bohrlochsucher die geeigneten Bereiche für die Bildaufnahme genau identifizieren kann, wenn der Probentisch geneigt ist.Wenn der Benutzer mit der Targetinggenauigkeit zufrieden ist, deaktivieren Sie die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen für die automatisierte Datenerfassung. Die repräsentativen Bilder des Gitters bei quadratischer Vergrößerung mit unterschiedlichen Neigungswinkeln, die nahe und fern von der euzentrischen Z-Höhe aufgenommen wurden, sind hier zu sehen. Die Mitte des Strahls wird durch die Mitte der roten konzentrischen Ringe angezeigt und der grüne Pfeil zeigt das interessierende Quadrat an.Es gibt ein unterbrochenes Raster-Feature neben dem interessierenden Quadrat als Referenz. Hier sind die repräsentativen Lochbelichtungen und 2D-Klassendurchschnitte dargestellt, die bei Neigungswinkeln von 0 Grad, 30 Grad und 60 Grad erfasst wurden. Obwohl die Proteinkonzentration über die verschiedenen Neigungswinkel hinweg unverändert bleibt, lässt ein höherer Neigungswinkel den abgebildeten Bereich in Bezug auf die Partikelkonzentration überfüllter erscheinen.2D-Klassendurchschnitte, die von Überfüllung betroffen sind, werden in diesem roten Kasten angezeigt. Die Einfachheit des Protokolls ermöglicht es jedem Standardbenutzer des Mikroskops, eine geneigte Datenerfassungsstrategie einfach anzupassen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...