Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

אנו מודים לביל אנדרסון, צ'ארלס באומן וז'אן-כריסטוף דוקום (TSRI) על עזרתם במיקרוסקופיה, התקנות לגינון ותשתית העברת נתונים. אנו מודים גם לגורדון לואי (מכון סאלק) וליונג זי טאן (האוניברסיטה הלאומית של סינגפור) על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים לכריס רוסו (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) על שסיפק לנו את הפלסמיד לביטוי DPS. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (U54AI150472, U54 AI170855 ו-R01AI136680 ל-DL), הקרן הלאומית למדע (NSF MCB-2048095 ל-DL), קרנות הרסט (ל-DL) וקתדרת ארתור וג'ולי וודרו (ל-J. P. N).

1. הכנת מדגם
<ol><li>השתמש ברשתות המכילות רדיד זהב ותמיכה ברשת זהב16 (ראה טבלת חומרים) מכיוון שאיסוף נתונים מוטה יכול להדגיש תנועה הנגרמת על ידי קרן17. הערה: עבור המחקר הנוכחי, דגימות על רשתות היו זגוגית באמצעות טכניקת צלילה ידנית ו blotting18</s...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis.">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. NYSBC.org Homepage Available from: <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022)</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li><li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy.">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

כיוון חלקיקים מועדף הנגרם על ידי היצמדות הדגימה לממשק אוויר-מים הוא אחד מצווארי הבקבוק העיקריים האחרונים לקביעת מבנה שגרתית ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-EM SPA 4,5,6. סכימת איסוף הנתונים המוצגת כאן מספקת אסטרטגיה קלה ליישום לשיפור התפלגות האו?...

הופעתם של גלאי אלקטרונים ישירים במהלך העשור האחרון 1,2,3 דרבנה עלייה אקספוננציאלית במספר מבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות ומכלולים מקרומולקולריים שנפתרו באמצעות קריו-EM 4,5,6 של חלקיק יחיד. כמעט כל המינים המקרומולקולריים המטוהרים צפויים להיות מקובלים לקביעת מבנה באמצעות cryo-EM, למעט החלבונים הקטנים ביותר ~ 10 kDa בגודל או מתחת ל -7. כמות חומר המוצא הדרושה להכנת רשת ולקביעת מבנה היא לפחות בסדר גודל קטן יותר מטכניקות אחרות לקביעת מבנה, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן 4,5,6.
עם זאת, אתגר עיקרי לקביעת מבנה על ידי cryo-EM כרוך בהכנת רשת מתאימה להדמיה. מחקר מקיף שהעריך דגימות מגוונות באמצעות אסטרטגיות ויטריפיקציה ורשתות שונות הציע כי רוב הגישות לדגימות ויטריפיקציה ברשתות cryo-EM מובילות להיצמדות מועדפת של מקרומולקולות לממשק אוויר-מים8. היצמדות כזו עלולה לגרום לארבע תוצאות תת-אופטימליות: (1) הדגימה המקרומולקולרית מתפרקת לחלוטין, ובמקרה כזה לא ניתן לאסוף ולעבד נתונים מוצלחים; (2) הדגימה מנטרלת חלקית, ובמקרה כזה ניתן יהיה לקבל תובנות מבניות מאזורים במקרומולקולה שאינם פגומים; (3) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, אך רק קבוצה אחת של כיווני חלקיקים ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגת בתמונות; (4) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, וחלק מכיווני החלקיקים האפשריים, אם כי לא כולם, ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגים בתמונות. במקרים (3) ו-(4), איסוף נתונים מוטים יסייע במזעור אנאיזוטרופיה ברזולוציה כיוונית המשפיעה על מפת cryo-EM המשוחזרת ומספק פתרון הניתן להכללה למגוון רחב של דגימות9. מבחינה טכנית, הטיה יכולה להועיל גם במקרה (2), מכיוון שהדנטורציה מתרחשת ככל הנראה בממשק אוויר-מים ומגבילה באופן דומה את מספר הכיוונים השונים המיוצגים בתוך הנתונים. ניתן לשנות את מידת הטיית ההתמצאות במערך הנתונים באופן פוטנציאלי על ידי ניסויים בתוספי תמיסה, אך היעדר ישימות רחבה מעכב גישות אלה של ניסוי וטעייה. די בהטיית שלב הדגימה בזווית הטיה אופטימלית אחת כדי לשפר את התפלגות הכיוונים הודות לשינוי הגיאומטריה של ניסוי ההדמיה9 (איור 1). בשל התצורה הגיאומטרית של המדגם המכוון המועדף ביחס לקרן האלקטרונים, עבור כל צביר של כיוונים מועדפים, הטיית הרשת יוצרת חרוט של זוויות הארה ביחס לצביר. לפיכך, זה מפזר את התצוגות וכתוצאה מכך משפר את דגימת מרחב פורייה ואת האיזוטרופיה של רזולוציה כיוונית.
יש, בפועל, כמה נזקים להטיית הבמה. הטיית שלב הדגימה מציגה מעבר צבע מיקוד על פני שדה הראייה, שעשוי להשפיע על דיוק הערכות פונקציית העברת הניגודיות (CTF). איסוף נתונים מוטים עשוי גם להוביל לתנועת חלקיקים מוגברת הנגרמת על ידי אלומה הנגרמת על ידי השפעות טעינה מוגברות בעת הדמיה של דגימות מוטות. הטיית הרשת מובילה גם לעלייה בעובי הקרח הנראה לעין, מה שבתורו מוביל למיקרוגרפים רועשים יותר ועשוי בסופו של דבר להשפיע על הרזולוציה של שחזורים 5,9,10. ייתכן שניתן יהיה להתגבר על בעיות אלה על ידי יישום סכמות עיבוד נתונים חישוביות מתקדמות המתוארות בקצרה בסעיפי הפרוטוקול והדיון. לבסוף, הטיה יכולה להוביל לחפיפה מוגברת של חלקיקים, ולעכב את צינור עיבוד התמונה הבא. למרות שניתן למתן זאת במידה מסוימת על ידי אופטימיזציה של ריכוז החלקיקים ברשת, זהו בכל זאת שיקול חשוב. כאן, מתואר פרוטוקול פשוט ליישום לאיסוף נתונים מוטים באמצעות חבילת התוכנה Leginon (תוכנה אוטומטית לרכישת תמונות), זמין בגישה פתוחה ותואם למגוון רחב של מיקרוסקופים11,12,13,14. השיטה דורשת לפחות גרסה 3.0 ומעלה, כאשר גרסאות 3.3 ואילך מכילות שיפורים ייעודיים כדי לאפשר איסוף נתונים מוטה. אין צורך בתוכנה או ציוד נוספים עבור פרוטוקול זה. הוראות נרחבות בנושא תשתיות חישוביות ומדריכי התקנה ניתנים במקום אחר15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

ניתוח חלקיק יחיד (SPA) על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הוא כיום טכניקה מקובלת לביולוגיה מבנית ברזולוציה גבוהה. קביעת מבנה על ידי SPA מסתמכת על קבלת תצוגות שונות מרובות של עצם מקרומולקולרי המזוגג בתוך שכבה דקה של קרח. באופן אידיאלי, אוסף של כיווני הקרנה אקראיים המפוזרים באופן אחיד יסתכם בכל התצוגות האפשריות של האובייקט, ויולידו שחזורים המאופיינים ברזולוציה כיוונית איזוטרופית. עם זאת, במציאות, דגימות רבות סובלות מחלקיקים בעלי אוריינטציה מועדפת הנצמדים לממשק אוויר-מים. זה מוביל להתפלגויות אוריינטציה זוויתית לא אחידות במערך הנתונים ולדגימת מרחב פורייה לא הומוגנית בשחזור, המתורגמת למפות המאופיינות ברזולוציה אנאיזוטרופית. הטיית שלב הדגימה מספקת פתרון הניתן להכללה להתגברות על אנאיזוטרופיה ברזולוציה מכוח שיפור אחידות התפלגות הכיוון, ובכך האיזוטרופיה של דגימת מרחב פורייה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיית איסוף נתונים אוטומטית בשלב מוטה באמצעות Leginon, תוכנה לרכישת תמונות אוטומטית. ההליך פשוט ליישום, אינו דורש ציוד או תוכנה נוספים, ותואם לרוב מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטי (TEMs) המשמש להדמיית מקרומולקולות ביולוגיות.

DPS ב-0.3 מ"ג/מ"ל שימש להדגמת הדמיה בהטיות של 0°, 30° ו-60°. נתונים מזוויות הטיה שונות נאספו באותה רשת באזורי רשת שונים. רזולוציית CTF המתאימה להטיות בזווית גבוהה יותר נוטות להיות גרועות יותר, כפי שהיה במקרה של השוואת שלושת מערכי הנתונים במחקר זה. איור 4 מציג תמונות מייצגות השוואתיות...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

הפרוטוקול הנוכחי מתאר סכמה כללית וקלה ליישום לאיסוף נתונים מוטים של חלקיק יחיד בניסויי cryo-EM. הליך כזה שימושי במיוחד לקבלת מפת EM באיכות גבוהה עבור דגימות הסובלות מהטיה אוריינטציה מועדפת עקב היצמדות לממשק אוויר-מים.

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

הטיית שלב הדגימה מספקת דרך פשוטה וניתנת להכללה להגדלת התפלגות הכיוון של חלקיקים במהלך איסוף נתוני cryo-EM של חלקיק יחיד. הפיזור האחיד של החלקיקים המתקבלים כתוצאה מהטיה של שלב הדגימה מאפשר שיפור באיכות המפה הכוללת וביכולת הפרשנות. התחל על ידי יישור המיקרוסקופ כדי להבטיח הארה מקבילה של הדגימה ולמזער סטיות תרדמת.כדי לזהות את הריבועים המתאימים לאיסוף נתונים, רשום אטלס רשת ללא הטיית במה או עם הטיית שלב, המספק סקירה כללית של איכות הרשת הכוללת ואינדיקציה ראשונית לאזורים מתאימים לאיסוף נתונים. בדוק את הריבועים באופן ידני בהגדלה המשמשת בצומת רכישת ריבועים. חפשו את הריבועים שבהם נייר הכסף שלם, אינו נראה מיובש ובעל עובי קרח אידיאלי, והזיזו את שלב הדגימה לריבוע מעניין.קבע את הגובה האוצנטרי עבור מיקום הבמה באמצעות נדנוד אלפא בהטיית במה בסביבות 15 מעלות וכוונן את גובה Z כדי להביא את הבמה לגובה אאוצנטרי באמצעות לוח המקשים למיקרוסקופ. ודא שהיסט התמונה מינימלי במהלך שגרת נדנוד אלפא. כדי למצוא גובה Z מדויק יותר, הערך אותו בצומת המיקוד בהגדלה המשמשת בצומת רכישה ריבועית.התאם את ההגדרות עבור צומת המיקוד והפעל או בטל את אפשרות המיקוד Z העדינה במהלך התור הראשוני של ריבועים. לאחר מכן לחץ על Simulate. הטה את שלב הדגימה לזווית ההטיה הרצויה לאיסוף נתונים בגובה האוצנטרי האמיתי ומרכז מחדש את הבמה במידת הצורך.הקש Simulate בצומת הרכישה הריבועי כדי להתחיל להציב יעדים בתור עבור חשיפות שלמות של צומת רכישה. לאחר מכן, בחרו יעד מיקוד Z ואזורים עם חורים המתאימים לחשיפות להגדלה גבוהה והגישו את המטרות לתור להדמיה. החזירו את שלב הדגימה למצבו הבלתי מוטה ולאחר מכן עברו לריבוע הבא.חזור על שלבים אלה עד למספר מספיק של חשיפות שלמות בתור. לאחר שכל הריבועים עומדים בתור, עבור אל צומת הפילוח כולו ולחץ על שלח יעדים בתור. בחר אפשר לאימות משתמש של יעדים נבחרים בהגדרות צומת ובדוק ידנית את המטרות שנבחרו על-ידי צומת רכישת החשיפה להגדלה גבוהה כדי לבדוק אם מאתר חורי ה- EM האוטומטי יכול לזהות במדויק את האזורים המתאימים לרכישת תמונה בעת הטיית שלב הדגימה.לאחר שהמשתמש מרוצה מדיוק הפילוח, בטל את הבחירה באפשרות אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים לאיסוף נתונים אוטומטי. התמונות המייצגות של הרשת בהגדלה מרובעת עם זוויות הטיה שונות שנאספו קרוב ורחוק מגובה Z האיוצנטרי מוצגות כאן. מרכז הקרן מסומן על ידי מרכז הטבעות הקונצנטריות האדומות והחץ הירוק מציין את ריבוע העניין.קיימת תכונת רשת שבורה הצמודה לריבוע העניין לצורך התייחסות. להלן החשיפות המייצגות לחורים וממוצעים דו-ממדיים שנאספו בזוויות הטיה של 0 מעלות, 30 מעלות ו-60 מעלות. למרות שריכוז החלבון אינו משתנה על פני זוויות ההטיה השונות, זווית הטיה גבוהה יותר גורמת לאזור המצולם להיראות צפוף יותר במונחים של ריכוז חלקיקים.ממוצעי מחלקות דו-ממדיות המושפעים מצפיפות מוצגים בתיבה אדומה זו. פשטות הפרוטוקול מאפשרת לכל משתמש סטנדרטי במיקרוסקופ להתאים בקלות אסטרטגיית איסוף נתונים מוטה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...