Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
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현미경 검사, Leginon 설치 및 데이터 전송 인프라에 대한 도움을 주신 Bill Anderson, Charles Bowman 및 Jean-Christophe Ducom(TSRI)에게 감사드립니다. 또한 원고를 비판적으로 읽어 주신 Gordon Louie (Salk Institute)와 Yong Zi Tan (싱가포르 국립 대학교)에게도 감사드립니다. DPS 발현을 위한 플라스미드를 제공해 주신 Chris Russo(MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건원 (U54AI150472, U54 AI170855 및 R01AI136680 DL), 국립 과학 재단 (NSF MCB-2048095 DL), 허스트 재단 (DL), Arthur and Julie Woodrow Chair (JPN).

1. 시료 전처리
<ol><li>금박과 금 그리드 지지대(16)를 포함하는 그리드를 사용하는데, 이는 기울어진 데이터 수집이 빔-유도 모션(17)을 강조할 수 있기 때문이다. 참고: 본 연구를 위해, 그리드 상의 샘플은 가습된(80% 초과) 냉장실(~4°C)에서 수동 플런지 및 블로팅 기술18 을 사용하여 유리화되었습니다.</li>
	<li>절대?...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis.">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. NYSBC.org Homepage Available from: <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022)</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li><li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy.">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

공기-물 계면에 대한 시편 부착으로 인한 바람직한 입자 배향은 Cryo-EM SPA 4,5,6을 사용한 일상적인 고분해능 구조 측정의 마지막 주요 병목 현상 중 하나입니다. 여기에 제시된 데이터 수집 체계는 데이터 세트 내에서 입자의 방향 분포를 개선하기 위한 구현하기 쉬운 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 추가 장비나 소프트웨어?...

지난 10년 동안 직접 전자 검출기 1,2,3의 출현 으로 단일 입자 Cryo-EM 4,5,6을 사용하여 해결된 거대분자 및 거대분자 어셈블리의 고분해능 구조 수가 기하급수적으로 증가했습니다. 크기가 ~10kDa 이하이거나7 미만인 가장 작은 단백질을 제외하고 거의 모든 정제된 거대분자 종은 Cryo-EM을 사용하여 구조를 측정할 수 있을 것으로 예상됩니다. 그리드 준비 및 구조 결정에 필요한 출발 물질의 양은 핵 자기 공명 분광법 및 X선 결정학 4,5,6과 같은 다른 구조 결정 기술보다 적어도 한 단계 적습니다.
그러나 Cryo-EM에 의한 구조 결정의 주요 과제는 이미징을 위한 적절한 그리드 준비와 관련이 있습니다. 다양한 유리화 전략과 그리드를 사용하여 다양한 시료를 평가한 광범위한 연구에 따르면, Cryo-EM 그리드에서 시료를 유리화하는 대부분의 접근법은 거대분자가 공기-물 계면에 우선적으로 부착되는 것으로 나타났다8. 이러한 순응은 잠재적으로 4가지 차선의 결과를 초래할 수 있다: (1) 거대분자 샘플은 완전히 변성되며, 이 경우 성공적인 데이터 수집 및 처리가 불가능하다; (2) 샘플이 부분적으로 변성되며, 이 경우 손상되지 않은 거대분자 영역으로부터 구조적 통찰력을 얻을 수 있습니다. (3) 샘플은 기본 구조를 유지하지만 전자빔의 방향에 대한 입자 방향의 한 세트만 이미지에 표시됩니다. (4) 샘플은 본래의 구조를 유지하고, 전자빔의 방향에 대한 가능한 입자 방향이 전부는 아니지만 일부가 이미지에 표현된다. 사례 (3)과 (4)의 경우, 기울어진 데이터 수집은 재구성된 Cryo-EM 맵에 영향을 미치는 방향 분해능 이방성을 최소화하는 데 도움이 되며 다양한 샘플에 대한 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다9. 기술적으로, 틸팅은 또한 사례 (2)에 도움이 될 수 있는데, 이는 변성이 아마도 공기-물 계면에서 발생하고 유사하게 데이터 내에서 표현되는 뚜렷한 방향의 수를 제한하기 때문입니다. 데이터 세트의 방향 편향 범위는 솔루션 첨가제를 실험하여 잠재적으로 변경할 수 있지만 광범위한 적용 가능성이 부족하면 이러한 시행착오 접근 방식이 방해를 받습니다. 시편 스테이지를 최적화된 단일 기울기 각도로 기울이는 것은 이미징 실험9 의 기하학적 구조를 변경하여 방향 분포를 개선하기에 충분합니다(그림 1). 전자빔에 대한 우선적으로 배향된 샘플의 기하학적 구성으로 인해, 우선적인 배향의 각 클러스터에 대해, 그리드를 기울이는 것은 클러스터 중심에 대해 조명 각도의 원뿔을 생성한다. 따라서 이것은 뷰를 분산시키고 결과적으로 푸리에 공간 샘플링과 방향 분해능의 등방성을 향상시킵니다.
실제로 무대를 기울이는 데는 몇 가지 단점이 있습니다. 시편 스테이지를 기울이면 시야 전체에 초점 그라데이션이 발생하여 CTF(대비 전달 함수) 추정의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 기울어진 데이터 수집은 또한 기울어진 표본을 이미징할 때 증가된 충전 효과로 인해 빔으로 인한 입자 이동을 증가시킬 수 있습니다. 그리드 기울기는 또한 겉보기 얼음 두께의 증가로 이어지며, 이는 차례로 더 시끄러운 현미경 사진으로 이어지고 궁극적으로 재구성 5,9,10의 해상도에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로토콜 및 토론 섹션에서 간략하게 설명된 고급 계산 데이터 처리 방식을 적용하여 이러한 문제를 극복하는 것이 가능할 수 있습니다. 마지막으로, 틸팅은 입자 겹침을 증가시켜 후속 이미지 처리 파이프라인을 방해할 수 있습니다. 이는 그리드 상의 입자 농도를 최적화하여 어느 정도 완화할 수 있지만 그럼에도 불구하고 중요한 고려 사항입니다. 여기에서는 Leginon 소프트웨어 제품군(자동 이미지 획득 소프트웨어)을 사용하여 기울어진 데이터 수집을 위해 구현하기 쉬운 프로토콜에 대해 설명하며, 오픈 액세스가 가능하고 광범위한 현미경11,12,13,14와 호환됩니다. 이 방법에는 버전 3.0 이상이 필요하며, 버전 3.3 이상에는 기울어진 데이터 수집을 가능하게 하는 전용 개선 사항이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에는 추가 소프트웨어나 장비가 필요하지 않습니다. 전산 인프라스트럭처 및 설치 가이드에 대한 광범위한 지침은 다른 곳에서 제공된다15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

초저온 전자 현미경(Cryo-EM)에 의한 단일 입자 분석(SPA)은 이제 고분해능 구조 생물학의 주류 기술입니다. SPA에 의한 구조 결정은 얇은 얼음 층 내에서 유리화된 거대 분자 물체에 대한 여러 가지 뚜렷한 견해를 얻는 데 의존합니다. 이상적으로, 균일하게 분포 된 무작위 투영 방향의 집합은 물체의 모든 가능한 뷰에 해당하며, 등방성 방향 분해능을 특징으로하는 재구성을 발생시킵니다. 그러나 실제로 많은 샘플은 공기-물 계면에 부착된 우선적인 방향의 입자로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 이로 인해 데이터 세트에서 균일하지 않은 각도 방향 분포가 발생하고 재구성에서 불균일한 푸리에 공간 샘플링이 발생하여 이방성 분해능을 특징으로 하는 맵으로 변환됩니다. 시편 스테이지를 기울이는 것은 배향 분포의 균일성을 개선하여 분해능 이방성을 극복하고 푸리에 공간 샘플링의 등방성을 극복할 수 있는 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다. 현재 프로토콜은 자동화된 이미지 획득을 위한 소프트웨어인 Leginon을 사용하는 기울어진 단계의 자동화된 데이터 수집 전략을 설명합니다. 이 절차는 구현이 간단하고 추가 장비나 소프트웨어가 필요하지 않으며 생물학적 거대분자 이미징에 사용되는 대부분의 표준 투과 전자 현미경(TEM)과 호환됩니다.

0.3mg/mL의 DPS를 사용하여 0°, 30° 및 60° 기울기에서 이미징을 시연했습니다. 서로 다른 기울기 각도의 데이터는 서로 다른 그리드 영역의 동일한 그리드에서 수집되었습니다. 더 높은 각도 기울기에 대한 CTF 해상도 적합은 이 연구에서 세 가지 데이터 세트를 비교할 때와 같이 더 좋지 않은 경향이 있습니다. 그림 4 는 비교 대표 이미지와 2D 분류 평균을 보여줍니다. 단백질 농...

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Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

시편 스테이지를 기울이면 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집 중에 입자의 방향 분포를 증가시키는 간단하고 일반화 가능한 방법을 제공합니다. 시편 스테이지 틸팅으로 인해 얻은 입자의 균일한 분포는 전체 지도 품질과 해석 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 먼저 현미경을 정렬하여 표본의 평행 조명을 보장하고 혼수 수차를 최소화합니다.데이터 수집에 적합한 사각형을 식별하려면 스테이지 틸트 또는 스테이지 틸트가 없는 그리드 아틀라스를 기록하여 전체 그리드 품질에 대한 개요와 데이터 수집에 적합한 영역의 초기 표시를 제공합니다. 정사각형 획득 노드에 사용된 배율로 정사각형을 수동으로 검사합니다. 호일이 손상되지 않고 탈수된 것처럼 보이지 않으며 이상적인 얼음 두께를 가진 사각형을 찾고 표본 스테이지를 관심 있는 사각형으로 이동합니다.약 15도에서 알파 워블러를 사용하여 스테이지 위치에 대한 유센트릭 높이 결정tage 기울기 및 Z 높이를 조정하여 s를 유센트릭 높이로 가져옵니다.tage 현미경용 키패드 패널을 사용하여 높이로. 알파 워블 루틴 동안 이미지 이동이 최소화되었는지 확인합니다. 더 정확한 Z 높이를 찾으려면 정사각형 획득 노드에 사용된 배율로 포커서 노드에서 추정합니다.포커서 노드에 대한 설정을 조정하고 사각형의 초기 대기열 중에 미세 Z 초점 옵션을 활성화 또는 비활성화합니다. 그런 다음 시뮬레이션을 누릅니다. 표본 스테이지를 실제 유센트릭 높이에서 데이터 수집을 위해 원하는 기울기 각도로 기울이고 필요한 경우 스테이지를 중앙에 다시 맞춥니다.정사각형 수집 노드에서 Simulate 를 눌러 전체 수집 노드 노출에 대한 타겟 대기열을 시작합니다. 그런 다음 Z 초점 대상과 고배율 노출에 적합한 구멍이 있는 영역을 선택하고 이미징을 위해 대상을 대기열에 제출합니다. 시편 스테이지를 기울이지 않은 상태로 되돌리고 다음 사각형으로 이동합니다.적절한 수의 전체 노출이 대기열에 추가될 때까지 이 단계를 반복합니다. 모든 사각형이 대기열에 있으면 전체 타겟팅 노드로 이동하여 Submit Queued Targets를 누릅니다. 노드 설정에서 선택한 표적에 대한 사용자 검증 허용을 선택하고 고배율 노출 획득 노드에서 선택한 표적을 수동으로 검사하여 시편 스테이지가 기울어졌을 때 자동 EM 구멍 측정기가 이미지 획득에 적합한 영역을 정확하게 식별할 수 있는지 테스트합니다.사용자가 타겟팅 정확도에 만족하면 자동 데이터 수집을 위해 선택한 타겟의 사용자 확인 허용 옵션을 선택 취소합니다. 유센트릭 Z 높이에서 가까운 곳과 먼 곳에서 수집된 다양한 기울기 각도를 가진 정사각형 배율의 그리드의 대표 이미지가 여기에 표시됩니다. 빔의 중심은 빨간색 동심원 링의 중심으로 표시되고 녹색 화살표는 관심 제곱을 나타냅니다.참조를 위해 관심 사각형 옆에 깨진 그리드 기능이 있습니다. 다음은 0도, 30도 및 60도 기울기 각도에서 수집된 대표적인 구멍 노출 및 2D 클래스 평균입니다. 단백질 농도는 다른 기울기 각도에서 변하지 않지만 기울기 각도가 높을수록 입자 농도 측면에서 이미지 영역이 더 복잡해 보입니다.과밀화의 영향을 받는 2D 클래스 평균이 이 빨간색 상자에 표시됩니다. 프로토콜의 단순성으로 인해 현미경의 모든 표준 사용자는 기울어진 데이터 수집 전략을 쉽게 조정할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

연구

생화학

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...