Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Vi takker Bill Anderson, Charles Bowman og Jean-Christophe Ducom (TSRI) for hjelp med mikroskopi, Leginon installasjoner og dataoverføringsinfrastruktur. Vi takker også Gordon Louie (Salk Institute) og Yong Zi Tan (National University of Singapore) for kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) for å gi oss plasmidet for uttrykk for DPS. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 og R01AI136680 til DL), National Science Foundation (NSF MCB-2048095 til DL), Hearst Foundations (til DL), og Arthur og Julie Woodrow Chair (til JPN).

1. Forberedelse av prøver
<ol><li>Bruk rutenett som inneholder gullfolie og gullgitterstøtte16 (se Materialfortegnelse) fordi skråstilt datainnsamling kan fremheve stråleindusert bevegelse17. MERK: For denne studien ble prøver på rutenett vitrifisert ved hjelp av manuell stupende og blotting teknikk18 i et fuktet (større enn 80%) kjølerom (~ 4 ° C).</li>
	<li>Unngå å bruke rister som inneholder kobber...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis.">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. NYSBC.org Homepage Available from: <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022)</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li><li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy.">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

Foretrukket partikkelorientering forårsaket av prøvens overholdelse av luft-vann-grensesnittet er en av de siste store flaskehalsene for rutinemessig strukturbestemmelse med høy oppløsning ved bruk av kryo-EM SPA 4,5,6. Datainnsamlingsskjemaet som presenteres her gir en enkel å implementere strategi for å forbedre orienteringsfordelingen av partikler i et datasett. Vi gjør oppmerksom på at protokollen ikke krever ekstra ...

Fremkomsten av direkte elektrondetektorer i løpet av det siste tiåret 1,2,3 har ansporet en eksponentiell økning i antall høyoppløselige strukturer av makromolekyler og makromolekylære sammenstillinger løst ved bruk av enkeltpartikkelkryo-EM 4,5,6. Nesten alle rensede makromolekylære arter forventes å være egnet til strukturbestemmelse ved bruk av kryo-EM, bortsett fra de minste proteinene ~ 10 kDa i størrelse eller under7. Mengden utgangsmateriale som trengs for gridforberedelse og strukturbestemmelse er minst en størrelsesorden mindre enn andre strukturbestemmelsesteknikker, for eksempel kjernemagnetisk resonansspektroskopi og røntgenkrystallografi 4,5,6.
En hovedutfordring for strukturbestemmelse ved kryo-EM innebærer imidlertid egnet klargjøring av rutenett for avbildning. En omfattende studie som evaluerte ulike prøver ved hjelp av forskjellige vitrifikasjonsstrategier og rutenett antydet at de fleste tilnærminger for vitrifisering av prøver på kryo-EM-rutenett fører til fortrinnsvis overholdelse av makromolekyler til luft-vanngrensesnittet8. Slik etterlevelse kan potensielt forårsake fire suboptimale utfall: (1) den makromolekylære prøven denaturerer fullstendig, i hvilket tilfelle ingen vellykket datainnsamling og behandling er mulig; (2) prøven denaturerer delvis, i så fall kan det være mulig å oppnå strukturell innsikt fra regioner av makromolekylet som ikke er skadet; (3) prøven beholder innfødt struktur, men bare ett sett med partikkelorienteringer i forhold til retningen av elektronstrålen er representert i bildene; (4) prøven beholder naturlig struktur, og noen, men ikke alle mulige partikkelorienteringer i forhold til retningen til elektronstrålen er representert i bildene. For tilfeller (3) og (4) vil skråstilt datainnsamling bidra til å minimere retningsoppløsningsanisotropi som påvirker det rekonstruerte kryo-EM-kartet og gir en generaliserbar løsning for et bredt utvalg av prøver9. Teknisk sett kan vipping også være fordelaktig (2), siden denatureringen antagelig skjer ved luft-vann-grensesnittet og på samme måte begrenser antallet distinkte retninger som er representert i dataene. Graden av orienteringsskjevhet i datasettet kan potensielt endres ved å eksperimentere med løsningstilsetninger, men mangel på bred anvendelighet hindrer disse prøve-og-feile-tilnærmingene. Å vippe prøvetrinnet i en enkelt optimalisert hellingsvinkel er tilstrekkelig til å forbedre fordelingen av orienteringer i kraft av å endre geometrien til avbildningseksperimentet9 (figur 1). På grunn av den geometriske konfigurasjonen av den fortrinnsvis orienterte prøven med hensyn til elektronstrålen, for hver klynge av fortrinnsorienteringer, vipper rutenettet en kegle av belysningsvinkler i forhold til klyngesentroid. Derfor sprer dette utsikten og forbedrer følgelig Fourier-romprøvetaking og isotropien av retningsoppløsning.
Det er i praksis noen ulemper med å vippe scenen. Ved å vippe prøvetrinnet introduseres en fokusgradient over synsfeltet, noe som kan påvirke nøyaktigheten av CTF-estimeringer (contrast transfer function). Skråstilt datainnsamling kan også føre til økt stråleindusert partikkelbevegelse forårsaket av økte ladningseffekter ved avbildning av skråstilte prøver. Grid tilting fører også til en økning i tilsynelatende istykkelse, noe som igjen fører til støyende mikrografer og kan til slutt påvirke oppløsningen av rekonstruksjoner 5,9,10. Det kan være mulig å løse disse problemene ved å bruke avanserte databehandlingsskjemaer som er kort beskrevet i protokoll- og diskusjonsseksjonene. Til slutt kan vipping føre til økt partikkeloverlapping, noe som hindrer den påfølgende bildebehandlingsrørledningen. Selv om dette til en viss grad kan reduseres ved å optimalisere partikkelkonsentrasjonen på nettet, er det likevel en viktig faktor. Her beskrives en protokoll som er enkel å implementere for skråstilt datainnsamling ved hjelp av Leginon-programvarepakken (en automatisert programvare for bildeinnsamling), tilgjengelig åpen tilgang og kompatibel med et bredt spekter av mikroskoper11,12,13,14. Metoden krever minst versjon 3.0 eller nyere, med versjon 3.3 og utover som inneholder dedikerte forbedringer for å muliggjøre skråstilt datainnsamling. Ingen ekstra programvare eller utstyr er nødvendig for denne protokollen. Omfattende instruksjoner om beregningsinfrastruktur og installasjonsveiledninger er gitt andre steder15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

Enkeltpartikkelanalyse (SPA) ved kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) er nå en vanlig teknikk for høyoppløselig strukturbiologi. Strukturbestemmelse ved SPA er avhengig av å oppnå flere forskjellige visninger av et makromolekylært objekt vitrifisert i et tynt lag av is. Ideelt sett ville en samling av jevnt fordelte tilfeldige projeksjonsorienteringer utgjøre alle mulige visninger av objektet, noe som gir opphav til rekonstruksjoner preget av isotrop retningsoppløsning. Men i virkeligheten lider mange prøver av fortrinnsvis orienterte partikler som fester seg til luft-vann-grensesnittet. Dette fører til ujevne vinkelorienteringsfordelinger i datasettet og inhomogen Fourier-rom-prøvetaking i rekonstruksjonen, oversatt til kart preget av anisotrop oppløsning. Vipping av prøvetrinnet gir en generaliserbar løsning for å overvinne oppløsningsanisotropi i kraft av å forbedre ensartetheten av orienteringsfordelinger, og dermed isotropien til Fourier-romprøvetaking. Den nåværende protokollen beskriver en automatisert datainnsamlingsstrategi på skråstilt stadium ved hjelp av Leginon, en programvare for automatisert bildeinnsamling. Prosedyren er enkel å implementere, krever ikke noe ekstra utstyr eller programvare, og er kompatibel med de fleste standard transmisjonselektronmikroskoper (TEM) som brukes til avbildning av biologiske makromolekyler.

DPS ved 0,3 mg/ml ble brukt til å demonstrere avbildning ved 0°, 30° og 60° helling. Data fra forskjellige hellingsvinkler ble samlet inn på samme rutenett i forskjellige rutenettregioner. CTF-oppløsning som passer for høyere vinkelhellinger har en tendens til å være dårligere, slik tilfellet var når man sammenlignet de tre datasettene i denne studien. Figur 4 viser komparative representative bilder og 2D-klassifiseringsgjennomsnitt. Selv om proteinkonsentrasjonen er uendret over ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Denne protokollen beskriver et generalisert og lett implementert skjema for skråstilt enkeltpartikkeldatainnsamling i kryo-EM-eksperimenter. En slik prosedyre er spesielt nyttig for å skaffe et EM-kart av høy kvalitet for prøver som lider av fortrinnsorienteringsskjevhet på grunn av overholdelse av luft-vanngrensesnittet.

Kryo-EM-datainnsamling med enkeltpartikler med scenetilt ved bruk av Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Vipping av prøvetrinnet gir en enkel og generaliserbar måte å øke orienteringsfordelingen av partikler under enkeltpartikkelkryo-EM-datainnsamling. Den ensartede fordelingen av partikler oppnådd på grunn av helling av prøvestadiet gjør det mulig å forbedre den generelle kartkvaliteten og tolkbarheten. Begynn med å justere mikroskopet for å sikre parallell belysning av prøven og minimere komaavvik.For å identifisere kvadratene som er egnet for datainnsamling, registrer et rutenettatlas uten scenehelning eller med scenehelling, som gir en oversikt over den generelle rutenettkvaliteten og en første indikasjon på egnede områder for datainnsamling. Inspiser firkantene manuelt ved forstørrelsen som brukes i kvadratinnsamlingsnoden. Se etter rutene der folien er intakt, ikke ser dehydrert ut, og har ideell istykkelse, og flytt prøvestadiet til et kvadrat av interesse.Bestem den eusentriske høyden for sceneposisjonen ved hjelp av en alfa-wobbler ved rundt 15 graders trinnhelling og juster Z-høyden for å bringe scenen til eusentrisk høyde ved hjelp av tastaturpanelet for mikroskopet. Sørg for at bildeskiftet er minimalt under alfa-slingringsrutinen. Hvis du vil finne en mer nøyaktig Z-høyde, estimerer du den i fokuseringsnoden ved forstørrelsen som brukes i kvadratisk anskaffelsesnode.Juster innstillingene for fokusernoden og aktiver eller deaktiver det fine Z-fokusalternativet under den første køen av firkanter. Trykk deretter på Simuler. Vipp prøvetrinnet til ønsket hellingsvinkel for datainnsamling i ekte eusentrisk høyde og sentrer scenen om nødvendig.Trykk på Simuler i den firkantede innkjøpsnoden for å begynne å sette mål i kø for hele anskaffelsesnodeeksponeringer. Velg deretter et Z-fokusmål og regioner med hull som er egnet for eksponeringer med høy forstørrelse, og send målene til køen for avbildning. Ta prøvetrinnet tilbake til sin ubestilte tilstand, og flytt deretter til neste firkant.Gjenta disse trinnene til et tilstrekkelig antall hele eksponeringer er lagt i kø. Når alle rutene er lagt i kø, går du til hele målrettingsnoden og trykker Send inn mål i kø. Velg Tillat for brukerverifisering av valgte mål i nodeinnstillingene, og inspiser målene som er valgt av eksponeringsnoden med høy forstørrelse, manuelt for å teste om den automatiserte EM-hullfinneren nøyaktig kan identifisere de egnede områdene for bildeopptak når prøvetrinnet holdes på skrå.Når brukeren er fornøyd med målrettingsnøyaktigheten, fjerner du merket for alternativet Tillat brukerbekreftelse av valgte mål for automatisk datainnsamling. De representative bildene av rutenettet ved kvadratforstørrelse med forskjellige hellingsvinkler samlet nær og langt fra den eusentriske Z-høyden er vist her. Midten av strålen er indikert av midten av de røde konsentriske ringene, og den grønne pilen indikerer torget av interesse.Det er en ødelagt rutenettfunksjon ved siden av torget av interesse for referanse. Vist her er de representative hulleksponeringene og 2D-klassegjennomsnittene samlet inn ved 0 grader, 30 grader og 60 grader hellingsvinkler. Selv om proteinkonsentrasjonen er uendret over de forskjellige hellingsvinklene, gjør en høyere hellingsvinkel at det avbildede området virker mer overfylt når det gjelder partikkelkonsentrasjon.2D-klassegjennomsnitt påvirket av overbefolkning vises i denne røde boksen. Enkelheten i protokollen gjør at enhver standardbruker av mikroskopet enkelt kan tilpasse en vippet datainnsamlingsstrategi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt selvstendig karakterisering og datainnsamling fra krystaller av biologiske makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriedatasamling med fast mål ved diamantlyskilde

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveprepareringsmetode for å skille enkeltlag fra flerlags eller konsentrerte biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...