Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Мы благодарим Билла Андерсона, Чарльза Боумана и Жана-Кристофа Дюкома (TSRI) за помощь с микроскопией, установками Leginon и инфраструктурой передачи данных. Мы также благодарим Гордона Луи (Институт Солка) и Йонг Зи Тан (Национальный университет Сингапура) за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Криса Руссо (Chris Russo) из Лаборатории молекулярной биологии MRC, Кембридж) за предоставление нам плазмиды для экспрессии DPS. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (U54AI150472, U54 AI170855 и R01AI136680 в DL), Национального научного фонда (NSF MCB-2048095 в DL), Фондов Херста (в DL) и Артура и Джули Вудро Стул (в JPN).

1. Пробоподготовка
<ol><li>Используйте сетки, содержащие золотую фольгу и золотую опору16 сетки (см. Таблицу материалов), поскольку сбор данных под наклоном может усилить движение, вызванное лучом17. ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования обра?...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis.">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. NYSBC.org Homepage Available from: <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022)</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li><li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy.">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

Предпочтительная ориентация частиц, обусловленная прилипанием образца к границе раздела воздух-вода, является одним из последних серьезных узких мест для рутинного определения структуры с высоким разрешением с использованием крио-ЭМ SPA 4,5,6<sup class="...

Появление детекторов прямых электронов за последнее десятилетие 1,2,3 стимулировало экспоненциальный рост числа структур высокого разрешения макромолекул и макромолекулярных сборок, решаемых с помощью одночастичных крио-ЭМ 4,5,6. Ожидается, что почти все очищенные макромолекулярные частицы будут поддаваться определению структуры с помощью крио-ЭМ, за исключением мельчайших белков размером ~ 10 кДа или менее7. Количество исходного материала, необходимого для подготовки сетки и определения структуры, по крайней мере, на порядок меньше, чем у других методов определения структуры, таких как спектроскопия ядерного магнитного резонанса и рентгеновская кристаллография 4,5,6.
Тем не менее, основная проблема для определения структуры с помощью крио-ЭМ связана с подходящей подготовкой сетки для визуализации. Обширное исследование, оценивающее различные образцы с использованием различных стратегий и сеток витрификации, показало, что большинство подходов к витрификации образцов на крио-электромагнитных сетках приводят к преимущественному присоединению макромолекул к границе разделавоздух-вода 8. Такая приверженность потенциально может привести к четырем неоптимальным результатам: (1) макромолекулярный образец полностью денатурирует, и в этом случае успешный сбор и обработка данных невозможны; (2) образец частично денатурируется, и в этом случае можно получить структурную информацию из областей макромолекулы, которые не повреждены; (3) образец сохраняет нативную структуру, но на изображениях представлен только один набор ориентаций частиц относительно направления электронного пучка; (4) образец сохраняет нативную структуру, и некоторые, но не все возможные ориентации частиц относительно направления электронного пучка представлены на изображениях. Для случаев (3) и (4) наклонный сбор данных поможет свести к минимуму анизотропию направленного разрешения, влияющую на реконструированную крио-ЭМ-карту, и обеспечит обобщаемое решение для широкого спектра образцов9. С технической точки зрения, наклон также может принести пользу в случае (2), поскольку денатурация, по-видимому, происходит на границе раздела воздух-вода и аналогичным образом ограничивает количество различных ориентаций, представленных в данных. Степень смещения ориентации в наборе данных потенциально может быть изменена путем экспериментов с добавками раствора, но отсутствие широкой применимости препятствует этим подходам методом проб и ошибок. Наклон столика образца на один оптимизированный угол наклона достаточен для улучшения распределения ориентаций за счет изменения геометрии эксперимента9 (рис. 1). Из-за геометрической конфигурации предпочтительно ориентированного образца по отношению к электронному пучку для каждого кластера преимущественных ориентаций наклон сетки создает конус углов освещения по отношению к центроиду кластера. Следовательно, это расширяет представления и, следовательно, улучшает дискретизацию пространства Фурье и изотропию направленного разрешения.
На практике есть некоторые недостатки в наклоне сцены. Наклон предметного столика образца приводит к градиенту фокусировки по всему полю зрения, что может повлиять на точность оценки функции переноса контраста (CTF). Сбор данных под наклоном также может привести к увеличению движения частиц, вызванного пучком, вызванным усилением эффектов зарядки при визуализации наклонных образцов. Наклон сетки также приводит к увеличению кажущейся толщины льда, что, в свою очередь, приводит к более шумным микрофотографиям и может в конечном итоге повлиять на разрешение реконструкций 5,9,10. Эти проблемы можно преодолеть, применяя передовые схемы обработки вычислительных данных, которые кратко описаны в разделах, посвященных протоколу и обсуждению. Наконец, наклон может привести к увеличению перекрытия частиц, что затруднит последующую обработку изображений. Хотя это можно в некоторой степени смягчить, оптимизировав концентрацию частиц на сетке, это, тем не менее, важное соображение. Здесь описан простой в реализации протокол для наклонного сбора данных с использованием программного пакета Leginon (программное обеспечение для автоматического получения изображений), доступного в открытом доступе и совместимого с широким спектром микроскопов11,12,13,14. Для этого метода требуется как минимум версия 3.0 или выше, а версии 3.3 и более поздние версии содержат специальные улучшения для включения наклонного сбора данных. Для этого протокола не требуется никакого дополнительного программного обеспечения или оборудования. Подробные инструкции по вычислительной инфраструктуре и руководства по установке приведены в других разделах15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

Анализ отдельных частиц (SPA) с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) в настоящее время является основным методом структурной биологии высокого разрешения. Определение структуры с помощью SPA основано на получении нескольких различных изображений макромолекулярного объекта, остеклованного в тонком слое льда. В идеале совокупность равномерно распределенных ориентаций случайной проекции должна составлять все возможные виды объекта, что приводит к реконструкциям, характеризующимся изотропным направленным разрешением. Однако в действительности многие образцы страдают от предпочтительно ориентированных частиц, прилипших к границе раздела воздух-вода. Это приводит к неравномерным распределениям угловой ориентации в наборе данных и неоднородной выборке в пространстве Фурье при реконструкции, что приводит к отображениям, характеризующимся анизотропным разрешением. Наклон ступени образца обеспечивает обобщаемое решение для преодоления анизотропии разрешения за счет улучшения однородности ориентационных распределений и, следовательно, изотропии дискретизации пространства Фурье. Настоящий протокол описывает стратегию автоматизированного сбора данных с наклонной стадией с использованием Leginon, программного обеспечения для автоматического получения изображений. Процедура проста в реализации, не требует какого-либо дополнительного оборудования или программного обеспечения и совместима с большинством стандартных просвечивающих электронных микроскопов (ПЭМ), используемых для визуализации биологических макромолекул.

DPS в дозе 0,3 мг/мл использовался для демонстрации визуализации при наклонах 0°, 30° и 60°. Данные с разных углов наклона были собраны на одной и той же сетке в разных областях сетки. Разрешение CTF подходит для более высоких угловых наклонов, как правило, хуже, как это было при сравнении трех на...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

В настоящем протоколе описана обобщенная и простая в реализации схема наклонного сбора данных об одночастичных частицах в крио-ЭМ-экспериментах. Такая процедура особенно полезна для получения высококачественной ЭМ-карты для образцов, страдающих преимущественным смещением ориентации из-за прилипания к границе раздела воздух-вода.

Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Наклон ступени образца обеспечивает простой и обобщаемый способ увеличения распределения ориентации частиц при сборе одночастичных крио-ЭМ-данных. Равномерное распределение частиц, полученное за счет наклона ступени образца, позволяет улучшить общее качество карты и интерпретируемость. Начните с выравнивания микроскопа, чтобы обеспечить параллельное освещение образца и свести к минимуму аберрации комы.Чтобы определить квадраты, пригодные для сбора данных, запишите атлас сетки без наклона сцены или с наклоном сцены, который дает общее представление об общем качестве сетки и первоначальное указание подходящих областей для сбора данных. Осмотрите квадраты вручную при увеличении, используемом в узле сбора квадратов. Найдите квадраты, в которых фольга не повреждена, не выглядит обезвоженной и имеет идеальную толщину льда, и переместите стадию образца в интересующий квадрат.Определите эуцентрическую высоту для положения столика с помощью альфа-воблера при наклоне столика около 15 градусов и отрегулируйте высоту Z, чтобы довести предметный столик до эуцентрической высоты, используя панель клавиатуры микроскопа. Убедитесь, что сдвиг изображения минимален во время процедуры альфа-колебания. Чтобы найти более точную высоту Z, оцените ее в узле фокусера по увеличению, используемому в квадратном узле захвата.Отрегулируйте настройки узла фокусера и включите или отключите параметр точной фокусировки Z во время первоначальной очереди квадратов. Затем нажмите «Имитировать». Наклоните столик образца на желаемый угол наклона для сбора данных на истинной эуцентрической высоте и при необходимости отцентрируйте столик.Нажмите кнопку Имитировать в квадратном узле сбора данных, чтобы начать постановку в очередь целевых объектов для экспозиции всего узла сбора данных. Затем выберите Z-фокусную цель и области с отверстиями, подходящими для экспозиции с большим увеличением, и отправьте цели в очередь на съемку. Верните стадию образца в ненаклоненное состояние, а затем перейдите к следующему квадрату.Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет поставлено в очередь достаточное количество целых экспозиций. После того, как все квадраты поставлены в очередь, перейдите ко всему узлу таргетинга и нажмите «Отправить цели в очереди». Выберите «Разрешить» для проверки пользователем выбранных целей в настройках узла и вручную осмотрите цели, выбранные узлом сбора экспозиции с большим увеличением, чтобы проверить, может ли автоматический искатель электромагнитных отверстий точно определить подходящие области для получения изображения при наклоне столика образца.Убедившись в точности таргетинга, снимите флажок Разрешить пользователю проверку выбранных целей для автоматического сбора данных. Здесь показаны репрезентативные изображения сетки при квадратном увеличении с различными углами наклона, собранные вблизи и вдали от эуцентрической высоты Z. Центр луча обозначен центром красных концентрических колец, а зеленая стрелка указывает на интересующий квадрат.Для справки к интересующему квадрату примыкает сломанная сетка. Здесь показаны репрезентативные экспозиции отверстий и средние значения 2D-класса, собранные при углах наклона 0 градусов, 30 градусов и 60 градусов. Хотя концентрация белка остается неизменной при различных углах наклона, более высокий угол наклона делает изображенную область более переполненной с точки зрения концентрации частиц.Средние значения 2D-классов, затронутые переполненностью, показаны в этом красном поле. Простота протокола позволяет любому стандартному пользователю микроскопа легко адаптировать наклонную стратегию сбора данных.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...