Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
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Agradecemos a Bill Anderson, Charles Bowman y Jean-Christophe Ducom (TSRI) por su ayuda con la microscopía, las instalaciones de Leginon y la infraestructura de transferencia de datos. También agradecemos a Gordon Louie (Instituto Salk) y Yong Zi Tan (Universidad Nacional de Singapur) por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) por proporcionarnos el plásmido para la expresión de DPS. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (U54AI150472, U54 AI170855 y R01AI136680 a DL), la Fundación Nacional de Ciencias (NSF MCB-2048095 a DL), las Fundaciones Hearst (a DL) y Arthur y Julie Woodrow Chair (a J. P. N.).

1. Preparación de la muestra
<ol><li>Utilice rejillas que contengan lámina de oro y soporte de rejilla dorada 16 (consulte la Tabla de materiales) porque la recopilación de datos inclinada puede acentuar el movimiento inducido por el haz17. NOTA: Para el presente estudio, las muestras en rejillas fueron vitrificadas utilizando la técnica manual de inmersión y secado18 en una cámara frigorífica humidificad...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. 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Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

La orientación preferida de las partículas causada por la adherencia de la muestra a la interfaz aire-agua es uno de los últimos cuellos de botella importantes para la determinación rutinaria de estructuras de alta resolución utilizando cryo-EM SPA 4,5,6. El esquema de recopilación de datos presentado aquí proporciona una estrategia fácil de implementar para mejorar la distribución de orientación de partículas dentro ...

El advenimiento de los detectores directos de electrones en la última década 1,2,3 ha estimulado un aumento exponencial en el número de estructuras de alta resolución de macromoléculas y ensamblajes macromoleculares resueltos utilizando crio-EM 4,5,6 de una sola partícula. Se espera que casi todas las especies macromoleculares purificadas sean susceptibles de determinación de la estructura mediante crio-EM, excepto las proteínas más pequeñas ~ 10 kDa de tamaño o por debajo de7. La cantidad de material de partida necesario para la preparación de la rejilla y la determinación de la estructura es al menos un orden de magnitud menor que otras técnicas de determinación de la estructura, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X 4,5,6.
Sin embargo, un desafío principal para la determinación de la estructura mediante crio-EM implica una preparación adecuada de la rejilla para la obtención de imágenes. Un extenso estudio que evaluó diversas muestras utilizando diferentes estrategias y rejillas de vitrificación sugirió que la mayoría de los enfoques para vitrificar muestras en rejillas crio-EM conducen a la adhesión preferencial de macromoléculas a la interfaz aire-agua8. Tal adherencia puede causar potencialmente cuatro resultados subóptimos: (1) la muestra macromolecular se desnaturaliza por completo, en cuyo caso no es posible una recopilación y procesamiento de datos exitosos; (2) la muestra se desnaturaliza parcialmente, en cuyo caso puede ser posible obtener información estructural de regiones de la macromolécula que no están dañadas; (3) la muestra conserva la estructura nativa, pero solo un conjunto de orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones está representado en las imágenes; (4) La muestra conserva la estructura nativa, y algunas, pero no todas, las posibles orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones están representadas en las imágenes. Para los casos (3) y (4), la recolección de datos inclinados ayudará a minimizar la anisotropía de resolución direccional que afecta al mapa crio-EM reconstruido y proporciona una solución generalizable para una amplia variedad de muestras9. Técnicamente, la inclinación también puede beneficiar el caso (2), ya que la desnaturalización presumiblemente ocurre en la interfaz aire-agua y limita de manera similar el número de orientaciones distintas representadas dentro de los datos. El grado de sesgo de orientación en el conjunto de datos puede alterarse potencialmente experimentando con aditivos de solución, pero la falta de aplicabilidad amplia dificulta estos enfoques de prueba y error. Inclinar la etapa de la muestra en un solo ángulo de inclinación optimizado es suficiente para mejorar la distribución de las orientaciones en virtud de la alteración de la geometría del experimento de imagen9 (Figura 1). Debido a la configuración geométrica de la muestra orientada preferentemente con respecto al haz de electrones, para cada grupo de orientaciones preferenciales, inclinar la rejilla genera un cono de ángulos de iluminación con respecto al centroide del cúmulo. Por lo tanto, esto extiende las vistas y, en consecuencia, mejora el muestreo del espacio de Fourier y la isotropía de la resolución direccional.
Hay, en la práctica, algunos inconvenientes para inclinar el escenario. La inclinación de la etapa de la muestra introduce un gradiente de enfoque en todo el campo de visión, lo que puede afectar a la precisión de las estimaciones de la función de transferencia de contraste (CTF). La recopilación de datos inclinados también puede conducir a un aumento del movimiento de partículas inducido por el haz causado por el aumento de los efectos de carga al obtener imágenes de muestras inclinadas. La inclinación de la rejilla también conduce a un aumento en el espesor aparente del hielo, lo que a su vez conduce a micrografías más ruidosas y, en última instancia, puede afectar la resolución de las reconstrucciones 5,9,10. Puede ser posible superar estos problemas aplicando esquemas avanzados de procesamiento computacional de datos que se describen brevemente en las secciones de protocolo y discusión. Por último, la inclinación puede conducir a una mayor superposición de partículas, lo que dificulta la posterior canalización de procesamiento de imágenes. Aunque esto puede mitigarse hasta cierto punto optimizando la concentración de partículas en la red, no obstante es una consideración importante. Aquí, se describe un protocolo fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados utilizando el paquete de software Leginon (un software automatizado de adquisición de imágenes), disponible en acceso abierto y compatible con una amplia gama de microscopios11,12,13,14. El método requiere al menos la versión 3.0 o superior, con las versiones 3.3 en adelante que contienen mejoras dedicadas para permitir la recopilación de datos inclinados. No se necesita software o equipo adicional para este protocolo. En otra parte se proporcionan instrucciones extensas sobre infraestructura computacional y guías de instalación15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

El análisis de partículas individuales (SPA) por microscopía crioelectrónica (crio-EM) es ahora una técnica convencional para la biología estructural de alta resolución. La determinación de la estructura por SPA se basa en la obtención de múltiples vistas distintas de un objeto macromolecular vitrificado dentro de una fina capa de hielo. Idealmente, una colección de orientaciones de proyección aleatorias uniformemente distribuidas equivaldría a todas las vistas posibles del objeto, dando lugar a reconstrucciones caracterizadas por una resolución direccional isotrópica. Sin embargo, en realidad, muchas muestras sufren de partículas orientadas preferentemente que se adhieren a la interfaz aire-agua. Esto conduce a distribuciones de orientación angular no uniformes en el conjunto de datos y a un muestreo del espacio de Fourier no homogéneo en la reconstrucción, lo que se traduce en mapas caracterizados por una resolución anisotrópica. La inclinación de la etapa de la muestra proporciona una solución generalizable para superar la anisotropía de resolución en virtud de mejorar la uniformidad de las distribuciones de orientación y, por lo tanto, la isotropía del muestreo del espacio de Fourier. El presente protocolo describe una estrategia de recopilación automatizada de datos de etapa inclinada utilizando Leginon, un software para la adquisición automatizada de imágenes. El procedimiento es simple de implementar, no requiere ningún equipo o software adicional, y es compatible con la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión estándar (TEM) utilizados para obtener imágenes de macromoléculas biológicas.

Se utilizó DPS a 0,3 mg/ml para demostrar imágenes a 0°, 30° y 60° de inclinación. Los datos de diferentes ángulos de inclinación se recopilaron en la misma cuadrícula en diferentes regiones de la cuadrícula. Los ajustes de resolución CTF para inclinaciones de ángulo más alto tienden a ser más pobres, como fue el caso al comparar los tres conjuntos de datos en este estudio. La Figura 4 muestra imágenes representativas comparativas y promedios de clasificación 2D. Aunque la co...

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Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

El presente protocolo describe un esquema generalizado y fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados de una sola partícula en experimentos crio-EM. Este procedimiento es especialmente útil para obtener un mapa EM de alta calidad para muestras que sufren un sesgo de orientación preferencial debido a la adherencia a la interfaz aire-agua.

Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

La inclinación de la etapa de la muestra proporciona una forma simple y generalizable de aumentar la distribución de orientación de las partículas durante la recopilación de datos crio-EM de una sola partícula. La distribución uniforme de las partículas obtenidas debido a la inclinación de la etapa de la muestra permite mejorar la calidad general del mapa y la interpretabilidad. Comience alineando el microscopio para asegurar la iluminación paralela de la muestra y minimizar las aberraciones del coma.Para identificar los cuadrados adecuados para la recopilación de datos, registre un atlas de cuadrícula sin inclinación de escenario o con inclinación de escenario, que proporciona una visión general de la calidad general de la cuadrícula y una indicación inicial de las áreas adecuadas para la recopilación de datos. Inspeccione los cuadrados manualmente en el aumento utilizado en el nodo de adquisición cuadrado. Busque los cuadrados donde la lámina está intacta, no se ve deshidratada y tiene un grosor de hielo ideal, y mueva la etapa de la muestra a un cuadrado de interés.Determine la altura eucéntrica para la posición del escenario usando un oscilante alfa a unos 15 grados de inclinación del escenario y ajuste la altura Z para llevar el escenario a la altura eucéntrica usando el panel del teclado para el microscopio. Asegúrese de que el cambio de imagen sea mínimo durante la rutina de oscilación alfa. Para encontrar una altura Z más precisa, estime en el nodo de enfoque con el aumento utilizado en el nodo de adquisición cuadrado.Ajuste la configuración del nodo de enfoque y habilite o deshabilite la opción de enfoque Z fino durante la cola inicial de cuadrados. A continuación, pulse Simular. Incline la etapa de la muestra al ángulo de inclinación deseado para la recopilación de datos a la altura eucéntrica real y vuelva a centrar la etapa si es necesario.Pulse Simular en el nodo de adquisición cuadrado para comenzar a poner en cola destinos para exposiciones completas del nodo de adquisición. A continuación, seleccione un objetivo de enfoque Z y regiones con orificios adecuados para exposiciones de gran aumento y envíe los objetivos a la cola para obtener imágenes. Lleve la etapa de la muestra a su estado no inclinado y luego muévase a la siguiente casilla.Repita estos pasos hasta que se haya puesto en cola un número adecuado de exposiciones completas. Una vez que todos los cuadrados estén en cola, vaya a todo el nodo de destino y presione Enviar destinos en cola. Seleccione Permitir la verificación por parte del usuario de los objetivos seleccionados en la configuración del nodo e inspeccione manualmente los objetivos seleccionados por el nodo de adquisición de exposición de gran aumento para comprobar si el buscador de orificios EM automatizado puede identificar con precisión las regiones adecuadas para la adquisición de imágenes cuando la etapa de la muestra está inclinada.Una vez que el usuario esté satisfecho con la precisión de la segmentación, anule la selección de la opción Permitir la verificación del usuario de los objetivos seleccionados para la recopilación automatizada de datos. Aquí se muestran las imágenes representativas de la cuadrícula con aumento cuadrado con diferentes ángulos de inclinación recogidos cerca y lejos de la altura Z eucéntrica. El centro de la viga está indicado por el centro de los anillos concéntricos rojos y la flecha verde indica el cuadrado de interés.Hay una característica de cuadrícula rota adyacente al cuadrado de interés como referencia. Aquí se muestran las exposiciones representativas de los orificios y los promedios de clase 2D recopilados en ángulos de inclinación de 0 grados, 30 grados y 60 grados. Aunque la concentración de proteína no cambia en los diferentes ángulos de inclinación, un ángulo de inclinación más alto hace que el área fotografiada parezca más concurrida en términos de concentración de partículas.Los promedios de clase 2D afectados por el hacinamiento se muestran en este cuadro rojo. La simplicidad del protocolo permite a cualquier usuario estándar del microscopio adaptar fácilmente una estrategia de recopilación de datos inclinada.

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A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...