Name: single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Bill Anderson, Charles Bowman ve Jean-Christophe Ducom'a (TSRI) mikroskopi, Leginon kurulumları ve veri aktarım altyapısı ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Gordon Louie (Salk Enstitüsü) ve Yong Zi Tan'a (Singapur Ulusal Üniversitesi) el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Chris Russo'ya (MRC Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Cambridge) DPS'nin ekspresyonu için bize plazmid sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (U54AI150472, U54 AI170855 ve R01AI136680'den DL'ye), Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF MCB-2048095'ten DL'ye), Hearst Vakıfları'ndan (DL'ye) ve Arthur ve Julie Woodrow Kürsüsü'nden (J. P. N.'ye) gelen hibelerle desteklenmiştir.

1. Numune hazırlama
<ol><li>Altın folyo ve altın ızgara desteği16 içeren ızgaralar kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) çünkü eğimli veri toplama ışın kaynaklı hareketivurgulayabilir 17. NOT: Bu çalışma için, ızgaralar üzerindeki örnekler, nemlendirilmiş (% 80'den fazla) soğuk bir odada (~ 4 ° C) manuel daldırma ve lekeleme tekniği18 kullanılarak vitrifiye edilmiştir.</li>
	<li>Kesinlikl...

<ol>
	<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li><li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis.">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li><li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis.">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+limitations+of+neutrons,+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules.">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257 (2018).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day.">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens.">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li><li>. NYSBC.org Homepage Available from: <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022)</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li><li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy.">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+at+100+keV:+a+demonstration+and+prospects.">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li><li>Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).</li><li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV.">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li><li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM.">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li><li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography.">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift.">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>. Structura Biotechnology Inc Available from: <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022)</li><li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+processing+workflow+with+cryoSPARC,+RELION,+and+Scipion.">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM.">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li><li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM.">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li><li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading).">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).</li></ol>

Numunenin hava-su arayüzüne yapışmasından kaynaklanan tercih edilen parçacık oryantasyonu, cryo-EM SPA 4,5,6 kullanılarak rutin yüksek çözünürlüklü yapı belirleme işleminin son büyük darboğazlarından biridir. Burada sunulan veri toplama şeması, bir veri kümesi içindeki parçacıkların oryantasyon dağılımını iyileştirmek için uygulanması kolay bir strateji sağlar. Protokolün ek ekipman veya yaz...

Son on yılda doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı 1,2,3, tek parçacıklı kriyo-EM 4,5,6 kullanılarak çözülen makromoleküllerin ve makromoleküler montajların yüksek çözünürlüklü yapılarının sayısında üstel bir artışa neden olmuştur. Hemen hemen tüm saflaştırılmış makromoleküler türlerin, ~ 10 kDa boyutunda veya7'nin altındaki en küçük proteinler hariç, kriyo-EM kullanılarak yapı tayinine uygun olması beklenir. Izgara hazırlama ve yapı belirleme için gereken başlangıç malzemesi miktarı, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve X-ışını kristalografisi 4,5,6 gibi diğer yapı belirleme tekniklerinden en az bir büyüklük sırası daha azdır.
Bununla birlikte, kriyo-EM ile yapı tayini için temel bir zorluk, görüntüleme için uygun ızgara hazırlığını içerir. Farklı vitrifikasyon stratejileri ve ızgaraları kullanarak çeşitli numuneleri değerlendiren kapsamlı bir çalışma, kriyo-EM ızgaralarındaki numuneleri vitrifiye etmek için çoğu yaklaşımın, makromoleküllerin hava-su arayüzüne tercihli olarak yapışmasına yol açtığını göstermiştir8. Bu tür bir bağlılık potansiyel olarak dört optimal olmayan sonuca neden olabilir: (1) makromoleküler numune tamamen denatüre olur, bu durumda başarılı bir veri toplama ve işleme mümkün değildir; (2) numune kısmen denatüre olur, bu durumda makromolekülün zarar görmemiş bölgelerinden yapısal bilgiler elde etmek mümkün olabilir; (3) numune doğal yapıyı korur, ancak görüntülerde elektron ışınının yönüne göre sadece bir parçacık oryantasyonu seti temsil edilir; (4) numune doğal yapısını korur ve elektron ışınının yönüne göre olası parçacık oryantasyonlarının bazıları ancak hepsi değil, bazıları görüntülerde temsil edilir. (3) ve (4) numaralı durumlar için, eğik veri toplama, yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritasını etkileyen yönlü çözünürlüklü anizotropinin en aza indirilmesine yardımcı olacak ve çok çeşitli örnekler için genelleştirilebilir bir çözüm sağlayacaktır9. Teknik olarak, eğme aynı zamanda duruma da fayda sağlayabilir (2), çünkü denatürasyon muhtemelen hava-su arayüzünde meydana gelir ve benzer şekilde verilerde temsil edilen farklı yönelimlerin sayısını sınırlar. Veri kümesindeki oryantasyon yanlılığının kapsamı, çözüm katkı maddeleri ile deneyler yapılarak potansiyel olarak değiştirilebilir, ancak geniş uygulanabilirlik eksikliği bu deneme yanılma yaklaşımlarını engellemektedir. Numune aşamasının optimize edilmiş tek bir eğme açısında eğilmesi, görüntüleme deneyi9'un geometrisini değiştirerek oryantasyonların dağılımını iyileştirmek için yeterlidir (Şekil 1). Tercihli yönelimli numunenin elektron ışınına göre geometrik konfigürasyonu nedeniyle, tercihli yönelimlerin her kümesi için, ızgaranın eğilmesi, küme sentroidine göre bir aydınlatma açıları konisi oluşturur. Bu nedenle, bu görüşleri yayar ve sonuç olarak Fourier uzay örneklemesini ve yönlü çözünürlüğün izotropisini geliştirir.
Pratikte, sahneyi eğmenin bazı zararları vardır. Numune aşamasının eğilmesi, görüş alanı boyunca kontrast aktarım işlevi (CTF) tahminlerinin doğruluğunu etkileyebilecek bir odak gradyanı oluşturur. Eğik veri toplama, eğik örnekleri görüntülerken artan şarj efektlerinin neden olduğu ışın kaynaklı parçacık hareketinin artmasına da neden olabilir. Izgara eğimi ayrıca görünür buz kalınlığında bir artışa yol açar, bu da daha gürültülü mikrograflara yol açar ve sonuçta rekonstrüksiyonların çözünürlüğünü etkileyebilir 5,9,10. Protokol ve tartışma bölümlerinde kısaca açıklanan gelişmiş hesaplamalı veri işleme şemalarını uygulayarak bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olabilir. Son olarak, eğme, parçacık üst üste binmesinin artmasına neden olabilir ve sonraki görüntü işleme boru hattını engelleyebilir. Bu, şebeke üzerindeki parçacık konsantrasyonunu optimize ederek bir dereceye kadar azaltılabilse de, yine de önemli bir husustur. Burada, Leginon yazılım paketi (otomatik bir görüntü alma yazılımı), mevcut açık erişim ve çok çeşitli mikroskoplarla uyumlu11,12,13,14 kullanılarak eğimli veri toplama için uygulanması kolay bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, en az sürüm 3.0 veya üstünü gerektirir ve 3.3'ten sonraki sürümler, eğimli veri toplamayı etkinleştirmek için özel iyileştirmeler içerir. Bu protokol için ek bir yazılım veya ekipman gerekmez. Hesaplama altyapısı ve kurulum kılavuzları hakkında kapsamlı talimatlar başka bir yerde verilmiştir15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td>
			<td>Structura Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPS protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&#8211;1098.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 Summit Direct Electron Detector</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leginon software suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual plunging device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos Arctica</td>
			<td>FEI/Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-A14nAu30-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-particle cryo-em data collection with stage tilt using leginon

Kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile tek parçacık analizi (SPA) artık yüksek çözünürlüklü yapısal biyoloji için ana akım bir tekniktir. SPA ile yapı belirleme, ince bir buz tabakası içinde vitrifiye edilmiş bir makromoleküler nesnenin birden fazla farklı görünümünü elde etmeye dayanır. İdeal olarak, eşit olarak dağılmış rastgele projeksiyon yönelimlerinin bir koleksiyonu, nesnenin tüm olası görünümlerine karşılık gelir ve izotropik yönlü çözünürlük ile karakterize edilen rekonstrüksiyonlara yol açar. Bununla birlikte, gerçekte, birçok örnek, hava-su arayüzüne yapışan tercihli olarak yönlendirilmiş parçacıklardan muzdariptir. Bu, veri kümesinde düzgün olmayan açısal yönelim dağılımlarına ve rekonstrüksiyonda homojen olmayan Fourier uzayı örneklemesine yol açarak, anizotropik çözünürlük ile karakterize edilen haritalara çevrilir. Numune aşamasının eğilmesi, oryantasyon dağılımlarının homojenliğini ve dolayısıyla Fourier uzay örneklemesinin izotropisini geliştirerek çözünürlük anizotropisinin üstesinden gelmek için genelleştirilebilir bir çözüm sağlar. Mevcut protokol, otomatik görüntü toplama için bir yazılım olan Leginon'u kullanarak eğimli aşamalı bir otomatik veri toplama stratejisini açıklamaktadır. Prosedürün uygulanması basittir, herhangi bir ek ekipman veya yazılım gerektirmez ve biyolojik makromolekülleri görüntülemek için kullanılan çoğu standart iletim elektron mikroskobu (TEM) ile uyumludur.

0.3 mg/mL'de DPS, 0°, 30° ve 60° eğimlerde görüntülemeyi göstermek için kullanıldı. Farklı eğim açılarından elde edilen veriler, farklı ızgara bölgelerinde aynı ızgarada toplanmıştır. CTF çözünürlüğü, bu çalışmada üç veri kümesini karşılaştırırken olduğu gibi, daha yüksek açılı eğimlere uyar ve daha zayıf olma eğilimindedir. Şekil 4 , karşılaştırmalı temsili görüntüleri ve 2B sınıflandırma ortalamalarını göstermektedir. Protein...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon at JoVE.com

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Mevcut protokol, kriyo-EM deneylerinde eğimli tek parçacıklı veri toplama için genelleştirilmiş ve uygulanması kolay bir şemayı açıklamaktadır. Böyle bir prosedür, hava-su arayüzüne bağlılık nedeniyle tercihli oryantasyon yanlılığından muzdarip numuneler için yüksek kaliteli bir EM haritası elde etmek için özellikle yararlıdır.

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Numune aşamasının eğilmesi, tek parçacıklı kriyo-EM veri toplama sırasında parçacıkların oryantasyon dağılımını arttırmanın basit ve genelleştirilebilir bir yolunu sağlar. Numune aşamasının eğilmesi nedeniyle elde edilen parçacıkların eşit dağılımı, genel harita kalitesinin ve yorumlanabilirliğinin iyileştirilmesini sağlar. Numunenin paralel aydınlatılmasını sağlamak ve koma anormalliklerini en aza indirmek için mikroskobu hizalayarak başlayın.Veri toplamaya uygun kareleri belirlemek için, genel ızgara kalitesine genel bir bakış ve veri toplama için uygun alanların ilk göstergesini sağlayan sahne alanı eğimi olmadan veya sahne alanı eğimi ile bir ızgara atlası kaydedin. Kare toplama düğümünde kullanılan büyütmede kareleri manuel olarak inceleyin. Folyo bozulmamış, susuz görünmediği ve ideal buz kalınlığına sahip olduğu kareleri arayın ve numune aşamasını ilgi çekici bir kareye taşıyın.Yaklaşık 15 derecelik sahne eğiminde bir alfa yalpalayıcı kullanarak sahne konumu için ösentrik yüksekliği belirleyin ve mikroskop için tuş takımı panelini kullanarak sahneyi ösentrik yüksekliğe getirmek için Z yüksekliğini ayarlayın. Alfa yalpalama rutini sırasında görüntü kaymasının minimum düzeyde olduğundan emin olun. Daha doğru bir Z yüksekliği bulmak için, kare toplama düğümünde kullanılan büyütmedeki odak düğümünde tahmin edin.Netleme düğümü için ayarları yapın ve karelerin ilk sıraya alınması sırasında ince Z netleme seçeneğini etkinleştirin veya devre dışı bırakın. Ardından Simüle Et'e basın. Gerçek ösentrik yükseklikte veri toplamak için numune aşamasını istenen eğim açısına eğin ve gerekirse sahneyi yeniden ortalayın.Tüm edinme düğümü pozlamaları için hedefleri sıraya almaya başlamak üzere kare alma düğümünde simüle et düğmesine basın. Ardından, bir Z odak hedefi ve yüksek büyütme pozlamaları için uygun deliklere sahip bölgeler seçin ve hedefleri görüntüleme için kuyruğa gönderin. Örnek aşamasını eğilmemiş durumuna geri getirin ve ardından bir sonraki kareye geçin.Yeterli sayıda tam pozlama sıraya alınana kadar bu adımları tekrarlayın. Tüm kareler sıraya alındıktan sonra, tüm hedefleme düğümüne gidin ve Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basın. Düğüm ayarlarında seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver'i seçin ve otomatik EM delik bulucunun numune aşaması eğildiğinde görüntü alımı için uygun bölgeleri doğru bir şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını test etmek için yüksek büyütmeli pozlama toplama düğümü tarafından seçilen hedefleri manuel olarak inceleyin.Kullanıcı hedefleme doğruluğundan memnun kaldıktan sonra, otomatik veri toplama için Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver seçeneğinin işaretini kaldırın. Izgaranın ösentrik Z yüksekliğine yakın ve uzak toplanan farklı eğim açılarına sahip kare büyütmedeki temsili görüntüleri burada gösterilmektedir. Kirişin merkezi, kırmızı eşmerkezli halkaların merkezi ile gösterilir ve yeşil ok, ilgilenilen kareyi gösterir.Referans için ilgi karesine bitişik kırık bir ızgara özelliği vardır. Burada, 0 derece, 30 derece ve 60 derece eğim açılarında toplanan temsili delik pozlamaları ve 2B sınıf ortalamaları gösterilmektedir. Protein konsantrasyonu farklı eğim açıları boyunca değişmemiş olsa da, daha yüksek bir eğim açısı, görüntülenen alanın parçacık konsantrasyonu açısından daha kalabalık görünmesini sağlar.Aşırı kalabalıktan etkilenen 2B sınıf ortalamaları bu kırmızı kutuda gösterilir. Protokolün basitliği, mikroskobun herhangi bir standart kullanıcısının eğimli bir veri toplama stratejisini kolayca uyarlamasını sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...