Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

ونشكر مرفق الفحص المجهري التابع للمعهد الدولي للدراسات الاستراتيجية في بيون على إمكانية الوصول إلى المعدات والبنية التحتية ودعم التجارب. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة من وزارة التكنولوجيا الحيوية (DBT) ، حكومة الهند (BT / PR8699 / MED/30/1018/2013) ، مجلس أبحاث العلوم والهندسة (SERB) ، حكومة الهند (EMR / 2016 / 001974) وجزئيا من قبل IISER، تمويل Pune Core. تم تمويل A. K. من قبل زمالة CSIR-SRF ، وتم تمويل لوس أنجلوس من خلال زمالة DST-INSPIRE ، وتم تمويل V.C بواسطة DBT (BT / PR8699 / MED/30/1018/2013).

1. بذر خلايا MCF10A في lrECM
<ol><li>الحفاظ على خلايا MCF10A (الخلايا الظهارية الملتصقة بالثدي) في وسط النمو. مرور الخلايا كل 4 أيام. ملاحظة: تكوين وسط النمو: DMEM عالي الجلوكوز بدون بيروفات الصوديوم التي تحتوي على مصل الحصان (5٪) ، الأنسولين (10 ميكروغرام / مل) ، الهيدروكورتيزون (0.5 ميكروغرام / مل) ،...

تستخدم النماذج القائمة على خط الخلايا على نطاق واسع لدراسة عملية التسرطن. تستمر مزارع الخلايا أحادية الطبقة في تقديم رؤى ثاقبة حول مسارات الإشارات الجزيئية المختلفة التي تتوسط التغيرات المميزة في الخلايا السرطانية32. تم الإبلاغ لأول مرة عن دراسات حول دور الجينات السرطانية ا?...

يتوفر عدد لا يحصى من النماذج لدراسة تطور السرطان ، كل منها فريد من نوعه ويمثل نوعا فرعيا من هذا المرض المعقد. يوفر كل نموذج رؤى فريدة وقيمة في بيولوجيا السرطان وقد حسن الوسائل لمحاكاة حالة المرض الفعلية. قدمت خطوط الخلايا الراسخة التي نمت كطبقة أحادية رؤى قيمة في العمليات الحيوية في المختبر ، مثل الانتشار والغزو والهجرة وموت الخلايا المبرمج1. على الرغم من أن زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) كانت الأداة التقليدية للتحقيق في استجابة خلايا الثدييات للعديد من الاضطرابات البيئية ، إلا أن استقراء هذه النتائج للتنبؤ بالاستجابات على مستوى الأنسجة لا يبدو مقنعا بما فيه الكفاية. القيد الرئيسي للثقافات ثنائية الأبعاد هو أن البيئة الدقيقة التي تم إنشاؤها تختلف إلى حد كبير عن تلك الموجودة في أنسجة الثدي نفسها2. تفتقر ثقافة 2D إلى تفاعل الخلايا مع المصفوفة خارج الخلية ، وهو أمر حيوي لنمو أي أنسجة. أيضا ، فإن قوى الشد التي تعاني منها الخلية في مزارع الطبقة الأحادية تعيق قطبية هذه الخلايا ، وبالتالي تغير إشارات الخلية وسلوكها3،4،5. فتحت أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) طريقا جديدا في مجال أبحاث السرطان مع قدرتها على محاكاة الظروف في الجسم الحي في المختبر. يمكن إعادة إنشاء العديد من الإشارات البيئية الدقيقة الحاسمة التي تضيع في زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد باستخدام ثقافات ثلاثية الأبعاد من المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين (lrECM)6.
حددت دراسات مختلفة أهمية البيئة الدقيقة للورم في التسرطن 7,8. العوامل المرتبطة بالالتهاب هي جزء رئيسي من البيئة الدقيقة. عامل تنشيط الصفائح الدموية (PAF) هو وسيط فوسفوليبيد تفرزه خلايا مناعية مختلفة تتوسط استجابات مناعية متعددة 9,10. يتم إفراز مستويات عالية من PAF بواسطة خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة وترتبط بالانتشار المعزز11. أظهرت الدراسات التي أجريت في مختبرنا أن الوجود المطول ل PAF في الثقافات الأسينارية يؤدي إلى تحول الخلايا الظهارية للثدي12. يقوم PAF بتنشيط مستقبل PAF (PAFR) ، وتنشيط محور الإشارة PI3K / Akt13. وتفيد التقارير أيضا أن PAFR مرتبط ب EMT والغزو والانبثاث14.
يوضح هذا البروتوكول نظاما نموذجيا لدراسة التحول الناجم عن PAF ، باستخدام ثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الظهارية للثدي ، كما وصفها سابقا Chakravarty et al.12. تميل الخلايا الظهارية للثدي التي تنمو على المصفوفة خارج الخلية (ثقافات 3D) إلى تشكيل كرويات مستقطبة توقف النمو. وتسمى هذه الأسيني وتشبه إلى حد كبير الأسيني من أنسجة الثدي ، أصغر وحدة وظيفية في الغدة الثديية ، في الجسم الحي15. تتكون هذه الكرويات (الشكل 1A ، B) من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية المستقطبة المعبأة بشكل وثيق حول تجويف مجوف ومتصلة بالغشاء السفلي (الشكل 1C). تم وصف عملية التشكل هذه بشكل جيد في الأدب16. عند زرعها على lrECM ، تخضع الخلايا للانقسام والتمايز لتشكيل مجموعة من الخلايا ، والتي تستقطب بعد ذلك من اليوم 4 فصاعدا. بحلول اليوم 8 ، يتكون الأسيني من مجموعة من الخلايا المستقطبة التي تكون على اتصال مباشر مع المصفوفة خارج الخلية ومجموعة من الخلايا غير المستقطبة المغلقة داخل الخلايا المستقطبة الخارجية ، مع عدم وجود اتصال بالمصفوفة . من المعروف أن هذه الخلايا غير المستقطبة تخضع لموت الخلايا المبرمج بحلول اليوم 12 من الثقافة ، مما يشكل تجويفا مجوفا. بحلول اليوم 16 ، يتم تشكيل الهياكل المتوقفة عن النمو16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> الشكل 1: نوى الخلايا في الأسيني الملطخة ببقعة نووية . (A) بناء 3D من الأسيني. (ب) صورة تباين الطور ل MCF10A acini المزروعة في Matrigel لمدة 20 يوما. (ج) يظهر القسم الأوسط وجود تجويف مجوف. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
على عكس ثقافات 2D ، تساعد ثقافات acinar في تمييز الخلايا الطبيعية والمحولة من خلال التغيرات المورفولوجية الواضحة. تشكل الخلايا الظهارية غير المتحولة في الثدي الأسيني مع تجويف مجوف ، يحاكي أسيني الثدي البشري الطبيعي. تظهر هذه الكرويات ، عند التحول ، مورفولوجيا معطلة تتميز بفقدان كبير للقطبية (واحدة من السمات المميزة للسرطان) ، أو عدم وجود تجويف ، أو اضطراب في التجويف المجوف (بسبب التهرب من موت الخلايا المبرمج) الذي قد يحدث بسبب تحرير الجينات المختلفة17،18،19،20 . يمكن دراسة هذه التحولات باستخدام تقنيات شائعة الاستخدام مثل التألق المناعي. وبالتالي ، يمكن أن يعمل نموذج زراعة الخلايا 3D كطريقة بسيطة للتحقيق في عملية تكوين الثدي وسرطان الثدي. إن إنشاء نظام ثقافة 3D لفهم تأثير وسيط الدهون الفوسفاتية ، PAF ، سيساعد في فحص الأدوية قبل السريرية عالي الإنتاجية.
قام هذا العمل بتكييف بروتوكول الثقافة ثلاثية الأبعاد "على القمة"16,21 لدراسة التحول الناجم عن PAF 22. تمت دراسة التغيرات المظهرية الناجمة عن تعرض الأسيني لوسيط الدهون الفوسفاتية باستخدام التألق المناعي. تم استخدام العديد من علامات القطبية والظهارية إلى الانتقال الوسيط (EMT) 12,16 في الدراسة. ويذكر الجدول 1 توطينها الطبيعي ونمطها الظاهري المتوقع عند التحول.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>الاجسام المضاده</td>
			<td>علامات</td>
			<td>التوطين العادي</td>
			<td>النمط الظاهري المحول</td>
		</tr><tr><td>α6-إنتيغرين</td>
			<td>القاعدية</td>
			<td>القاعدية مع وصمة عار جانبية ضعيفة</td>
			<td>وصمة عار جانبية / قمية قوية</td>
		</tr><tr><td>β كاتينين</td>
			<td>تقاطع الخلية والخلية</td>
			<td>القاعدية</td>
			<td>توطين غير طبيعي / نووي أو سيتوبلازمي</td>
		</tr><tr><td>فيمنتين</td>
			<td>EMT</td>
			<td>غياب / ضعف الحضور</td>
			<td>التنظيم المرتفع</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: العلامات المستخدمة في الدراسة. علامات مختلفة تستخدم مع توطينها في وجود وغياب علاج PAF.
يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل أفضل لدراسة / فحص الأدوية المعقولة والجينات المستهدفة لمختلف الأنواع الفرعية لسرطان الثدي. وهذا يمكن أن يوفر بيانات استجابة للأدوية أقرب إلى سيناريو في الجسم الحي ، مما يساعد في تطوير الأدوية بشكل أسرع وأكثر موثوقية. أيضا ، يمكن استخدام هذا النظام لدراسة الإشارات الجزيئية المرتبطة بالاستجابة للأدوية ومقاومة الأدوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

تم تطوير العديد من النماذج لدراسة السرطان ، مثل نماذج القوارض وخطوط الخلايا الثابتة. تم توفير رؤى قيمة حول التسرطن من خلال الدراسات التي تستخدم هذه النماذج. وقد وفرت خطوط الخلايا فهما لإزالة القيود التنظيمية من الإشارات الجزيئية المرتبطة بتكوين أورام الثدي، في حين تستخدم نماذج القوارض على نطاق واسع لدراسة الخصائص الخلوية والجزيئية لسرطان الثدي في الجسم الحي. إنشاء ثقافات 3D من الخلايا الظهارية والسرطانية الثدي يساعد في سد الفجوة بين في الجسم الحي والنماذج في المختبر من خلال محاكاة الظروف في الجسم الحي في المختبر. يمكن استخدام هذا النموذج لفهم تحرير أحداث الإشارات الجزيئية المعقدة والخصائص الخلوية أثناء تسرطن الثدي. هنا ، يتم تعديل نظام ثقافة 3D لدراسة التحول الناجم عن وسيط الدهون الفوسفاتية (عامل تنشيط الصفائح الدموية ، PAF). تلعب أجهزة المناعة والجزيئات المفرزة الأخرى دورا رئيسيا في بدء الورم وتقدمه في الثدي. في هذه الدراسة ، تتعرض ثقافات 3D acinar للخلايا الظهارية للثدي لخصائص التحول PAF المعروضة مثل فقدان القطبية والخصائص الخلوية المتغيرة. سيساعد نظام زراعة 3D هذا في إلقاء الضوء على الاضطرابات الجينية و / أو اللاجينية التي تسببها مختلف كيانات الجزيئات الصغيرة في البيئة الدقيقة للورم. بالإضافة إلى ذلك ، سيوفر هذا النظام أيضا منصة لتحديد الجينات الجديدة والمعروفة التي قد تشارك في عملية التحول.

خلايا MCF10A ، عند التعرض لعلاج PAF ، تشكل هياكل أسينار ذات أنماط ظاهرية متميزة للغاية. تم العثور على α6-integrin ليكون موضعيا بشكل خاطئ مع تلطيخ أكثر قمي. كما أظهر عدد قليل من الأسيني تلطيخا متقطعا (الشكل 2 أ). يشير كل من هذين النوعين الظاهريين إلى فقدان القطبية القاعدية ، كما يتضح من ...

Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

يصف البروتوكول الحالي إنشاء ثقافات ثلاثية الأبعاد "على القمة " لخط الخلايا الظهارية غير المتحولة للثدي ، MCF10A ، الذي تم تعديله لدراسة التحول الناجم عن عامل تنشيط الصفائح الدموية (PAF). تم استخدام التألق المناعي لتقييم التحول ويتم مناقشته بالتفصيل.

وسيط الفوسفوليبيد الناجم عن التحول في الثقافات ثلاثية الأبعاد

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

يمكن استخدام ثقافات الفحص 3D المعدلة لدينا للتحقيق في دور المكونات المختلفة في البيئة الدقيقة للسرطان ، مما يؤدي إلى تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة وأهداف الأدوية. تمكن هذه الطريقة المرء من دراسة التغيرات في النمط الظاهري الخلوي والإشارات الجزيئية التي تشبه إلى حد كبير الجهاز المناعي. ويمكن أيضا تعديله لتلبية المتطلبات المحددة للدراسة.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة التي يمكن أن تساعد في الكشف المبكر عن سرطان الثدي. أيضا ، يمكن استخدام الرؤى الجزيئية لتحديد أهداف الدواء الجديدة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة كل من تكوين الورم وتكوين التشكل بعد اضطراب الجينات أو الجينات التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الدور الذي يلعبه الجين أو الجينات.للبدء ، التربسين الخلايا عن طريق شفط الوسط والغسيل مع 2 ملليلتر من PBS. أضف 900 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا أو حتى يتم تربسين الخلايا بالكامل. قم بإعداد سرير من lrECM في ثمانية آبار من شريحة زجاجية مغطاة بغرف عن طريق طلاء كل بئر ب 60 ميكرولتر من lrECM.ضعه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية لمدة أقصاها 15 دقيقة. لتحضير تعليق الخلية ، أضف 5 ملليلتر من وسط إعادة التعليق لإخماد نشاط التربسين وتدوير الخلايا عند 112 مرة جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. استنشاق الوسط المستنفد وإعادة تعليق الخلايا في 2 ملليلتر من وسط الفحص.امزج التعليق جيدا لضمان تكوين تعليق خلية واحدة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم واحسب حجم تعليق الخلايا اللازم لزرع 6000 خلية في كل بئر. وفقا لعدد الآبار المطلوبة ، قم بتخفيف تعليق الخلية في وسط التراكب.أضف 400 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخفف إلى أسرة lrECM المعدة بعناية ، مما يضمن بعناية عدم إزعاج سرير lrECM. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 3 ساعات ، أضف 200 نانومول من PAF إلى كل بئر.أضف نفس تركيز PAF أثناء كل تغيير في الوسائط ، وقم بتجديد الخلايا بوسط طازج كل 4 أيام. بعد 20 يوما من الزراعة ، قم بإخراج الوسط بعناية من كل بئر واغسل الآبار ب 400 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا. إصلاح هياكل acinar عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد الطازجة واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.شطف الآبار مرة واحدة مع PBS الباردة الجليد وتتخلل مع PBS تحتوي على 0.5٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد 10 دقائق ، قم بإخراج محلول Triton X-100 بعناية وشطفه ب 400 ميكرولتر من جليسين PBS الطازج. أضف 400 ميكرولتر من محلول الحجب الأساسي الذي يتكون من مصل الماعز بنسبة 10٪ في مخزن مؤقت للتألق المناعي واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.قم بإزالة محلول الحجب الأولي ، وأضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المانعة الثانوية بنسبة 2٪ المحضرة في محلول الحجب الأولي ، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة. تحضير الجسم المضاد الأولي في محلول الأجسام المضادة المانعة الثانوية بنسبة 2٪ في تخفيف 1:100. قم بإزالة محلول الحجب الثانوي ، وأضف الجسم المضاد المحضر حديثا ، واحتضنه بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.ماصة بعناية محلول الأجسام المضادة الأولية وغسله ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتألق المناعي. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف 1:200 للجسم المضاد الثانوي المترافق مع الفلوروفور في محلول الحجب الأولي واحتضان الشرائح في محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف الشرائح ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتألق المناعي لمدة 20 دقيقة ، يليه غسلتان باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما.قم بتلطيخ النوى باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.5 نانوغرام لكل ملليلتر من البقعة النووية لمدة 5 إلى 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 400 ميكرولتر من PBS لإزالة البقعة الزائدة. قم بإخراج PBS بالكامل بعناية وتأكد من إزالة المحلول المتبقي.ثم أضف قطرة واحدة من كاشف التركيب في كل بئر واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. وأخيرا، قم بتصوير الشرائح تحت تكبير 40x أو 63x على مجهر متحد البؤرة، مع أخذ مقاطع Z بصرية بحجم خطوة 0.6 ملليمتر. تمثل الصور نوى الخلايا في الأسيني الملطخة ببقعة نووية.يتم عرض البناء ثلاثي الأبعاد للأسيني وصورة تباين المرحلة ل MCF10A acini المزروعة على lrECM لمدة 20 يوما هنا. يظهر القسم الأوسط وجود تجويف مجوف. PAF يعطل القطبية ويحفز التغيرات الشبيهة ب EMT في MCF10A الثدي acini.نمت خلايا MCF10A كخلايا ثلاثية الأبعاد في الثقافات العليا في lrECM. تم التعامل مع الثقافات مع PAF في اليوم 0 و 4 و 8 و 12 و 16. تم الحفاظ على الثقافات لمدة 20 يوما ثم تم تلطيخ مناعيتها ل alpha6-integrin والبقع النووية ، GM130 ، وهي علامة للقطبية القمية ، و Vimentin ، علامة EMT.تم عرض المكدس المركزي لل acini المعني هنا. البيانات التمثيلية هي ل 40-50 acini من ثلاث تجارب مستقلة بيولوجيا. يجب أن يكون سرير lrECM مصنوعا بعناية بحيث ينتشر بالتساوي دون أي فقاعات هواء.أيضا ، يجب خلط تعليق الخلية بالتساوي وإضافته ببطء لتجنب التكتل. يمكن للمرء الحصول على البروتين والحمض النووي الريبي من ثقافات 3D التي يمكن استخدامها بعد ذلك للتحقيق في المسارات الجزيئية المختلفة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

نظام ثقافة ثيميك ثلاثي الأبعاد لتوليد المهاجرين الثيمة المضادة للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

في المختبر تقييم التحول Oncogenic في الخلايا الظهارية ماماري الإنسان

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

نموذج محاكاة حيوية ثلاثي الأبعاد في المختبر للورم الأرومي العصبي باستخدام السقالات القائمة على الكولاجين

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...