Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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我们感谢IISER浦那显微镜设施提供设备和基础设施以及实验支持。这项研究得到了印度政府生物技术部（DBT）（BT / PR8699 / MED/30 / 1018 / 2013），印度政府科学与工程研究委员会（SERB）（EMR / 2016 / 001974）的资助，部分资金来自IISER，浦那核心资金。A.K.由CSIR-SRF奖学金资助，洛杉矶由DST-INSPIRE奖学金资助，V.C由DBT资助（BT / PR8699 / MED/30 / 1018 / 2013）。

1. 在 lrECM 中接种 MCF10A 细胞
<ol><li>将MCF10A细胞（贴壁性乳腺上皮细胞）维持在生长培养基中。每4天传代一次细胞。 注意：生长培养基的组成：不含丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM含马血清（5%），胰岛素（10μg/ mL），氢化可的松（0.5μg/ mL），表皮生长因子EGF（20ng / mL），霍乱毒素（100ng / mL）和青霉素 - 链霉素（100单位/ mL）（见 材料表）。</li>
	<li>在实验开始前20分钟在冰上...

已建立的基于细胞系的模型被广泛用于研究致癌过程。细胞的单层培养继续提供对介导癌细胞特征变化的各种分子信号通路的见解32。关于众所周知的癌基因（如Ras，Myc和突变p53）的作用的研究首先使用单层培养物作为模型系统33，34，35，36。然而，2D培养模型缺乏体内存在的?...

有无数的模型可用于研究癌症的进展，每个模型都是独一无二的，代表了这种复杂疾病的一种亚型。每个模型都为癌症生物学提供了独特而有价值的见解，并改进了模拟实际疾病状况的方法。作为单层生长的已建立细胞系为体外重要过程提供了宝贵的见解，例如增殖，侵袭性，迁移和凋亡1。尽管二维（2D）细胞培养一直是研究哺乳动物细胞对几种环境扰动的反应的传统工具，但推断这些发现以预测组织水平的反应似乎不够令人信服。2D培养的主要局限性在于产生的微环境与乳腺组织本身的微环境有很大不同2。2D培养缺乏细胞与细胞外基质的相互作用，这对于任何组织的生长都至关重要。此外，细胞在单层培养物中经历的拉力会阻碍这些细胞的极性，从而改变细胞信号传导和行为3，4，5。三维（3D）培养系统具有模拟体外体内条件的能力，为癌症研究领域开辟了一条新途径。 在2D细胞培养中丢失的许多关键微环境线索可以使用富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）的3D培养物重新建立6。
各种研究已经确定了肿瘤微环境在致癌中的重要性7，8。炎症相关因素是微环境的主要部分。血小板活化因子（PAF）是由各种免疫细胞分泌的磷脂介质，介导多种免疫反应9，10。高水平的PAF由不同的乳腺癌细胞系分泌，并与增殖增强有关11。我们实验室的研究表明，腺泡培养物中PAF的长期存在导致乳腺上皮细胞的转化12。PAF激活PAF受体（PAFR），激活PI3K/Akt信号轴13。据报道，PAFR 也与 EMT、侵袭和转移有关14。
本协议展示了一个模型系统来研究PAF诱导的转化，使用乳腺上皮细胞的3D培养物，如Chakravarty等人之前所描述的那样12。在细胞外基质（3D培养物）上生长的乳腺上皮细胞倾向于形成极化生长停滞球状体。这些被称为腺泡，与乳腺组织的腺泡非常相似，乳腺是乳腺最小的功能单位，在 体内15。 这些球体（图1A，B）由单层紧密堆积的极化上皮细胞组成，围绕空心腔并附着在基底膜上（图1C）。这种形态发生过程已在文献16中得到了很好的描述。当接种在lrECM上时，细胞经历分裂和分化以形成细胞簇，然后从第4天开始极化。到第8天，腺泡由一组与细胞外基质直接接触的极化细胞和封闭在外极化细胞内的一簇非极化细胞组成，与基质没有接触。已知这些未极化的细胞在培养的第12天发生凋亡，形成空心腔。到第16天，形成生长停滞的结构16。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> 图1：用核染色的腺泡中的细胞核 。 （A）腺泡的3D构造。（B）在基质胶上生长20天的MCF10A腺泡的相衬图像。（C）最中间的部分显示了空心腔的存在。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
与2D培养不同，腺泡培养有助于通过明显的形态变化区分正常细胞和转化细胞。未转化的乳腺上皮细胞形成具有空腔的腺泡，模仿正常人乳腺腺泡。这些球体在转化时显示出破坏的形态，其特征是极性严重丧失（癌症的标志之一），没有管腔或空腔的破坏（由于细胞凋亡的逃避），这可能是由于各种基因的失调引起的17，18，19，20.这些转化可以使用常用的技术（如免疫荧光）进行研究。因此，3D细胞培养模型可以作为研究乳腺腺泡形态发生和乳腺癌发生的过程的简单方法。建立3D培养系统以了解磷脂介质PAF的作用将有助于高通量临床前药物筛选。
这项工作采用了3D“顶部”培养协议16，21，以研究PAF22诱导的转化。使用免疫荧光研究了腺泡暴露于磷脂介质引起的表型变化。研究中使用了各种极性和上皮到间充质转化（EMT）标记12，16。表1提到了它们的正常定位和转化时的预期表型。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>抗体</td>
			<td>标志着</td>
			<td>正常本地化</td>
			<td>转化表型</td>
		</tr><tr><td>α6-整合素</td>
			<td>基底外侧</td>
			<td>基底侧染色较弱</td>
			<td>强烈的横向/顶端染色</td>
		</tr><tr><td>β-连环蛋白</td>
			<td>细胞-细胞连接</td>
			<td>基底外侧</td>
			<td>异常/核或细胞质定位</td>
		</tr><tr><td>维门汀</td>
			<td>EMT</td>
			<td>不存在/弱存在</td>
			<td>上调</td>
		</tr></tbody></table>表1：研究中使用的标记物。 在存在和不存在PAF治疗的情况下，使用不同的标记物进行定位。
该方法可以最好地用于研究/筛选各种乳腺癌亚型的合理药物和靶基因。这可以提供更接近 体内 情景的药物反应数据，有助于更快、更可靠的药物开发。此外，该系统可用于研究与药物反应和耐药性相关的分子信号传导。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

已经开发了几种模型来研究癌症，例如啮齿动物模型和已建立的细胞系。使用这些模型的研究提供了对致癌作用的宝贵见解。细胞系提供了与乳腺肿瘤发生相关的分子信号传导失调的理解，而啮齿动物模型广泛用于研究体内乳腺癌的细胞和分子特征。 乳腺上皮细胞和癌细胞的3D培养物的建立有助于通过模拟体内体外条件来弥合体内和体外模型之间的差距。该模型可用于了解复杂分子信号传导事件的失调和乳腺癌变过程中的细胞特征。在这里，修改了3D培养系统以研究磷脂介质诱导的（血小板活化因子，PAF）转化。免疫调节剂和其他分泌分子在乳房肿瘤的发生和进展中起主要作用。在本研究中，暴露于乳腺上皮细胞的3D腺泡培养物暴露于PAF表现出转化特征，例如极性丧失和细胞特征改变。该3D培养系统将有助于揭示由肿瘤微环境中各种小分子实体诱导的遗传和/或表观遗传扰动。此外，该系统还将为鉴定可能参与转化过程的新型和已知基因提供一个平台。

MCF10A细胞在暴露于PAF处理后，形成具有非常明显表型的腺泡结构。发现α6-整合素定位错误，根尖染色较多。一些腺泡也显示出不连续的染色（图2A）。这两种表型都表明基底极性的丧失，如文献24，25所示。早期的报告表明α6-整合素在癌症转移中的作用存在争议。α6-整合素与β1-或β4-整合素以二聚体形式存在。已发现α6β4亚基在上...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

本协议描述了未转化的乳腺上皮细胞系MCF10A的3D “顶部”培养物的建立，该培养物已被修改以研究血小板活化因子（PAF）诱导的转化。免疫荧光已被用于评估转化，并详细讨论。

磷脂介质诱导的三维培养物转化

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

我们改良的3D检测培养物可用于研究各种成分在癌症微环境中的作用，从而鉴定新的生物标志物和药物靶标。这种方法使人们能够研究与免疫系统非常相似的细胞表型和分子信号的变化。也可以对其进行修改以满足研究的特定要求。这种方法可以帮助识别有助于早期发现乳腺癌的新型生物标志物。此外，分子见解可用于识别新的药物靶点。该方法可用于研究一个或多个基因扰动后的肿瘤发生和形态发生，从而深入了解基因或基因所起的作用。首先，通过吸出培养基并用2毫升PBS洗涤来胰蛋白酶消化细胞。加入900微升0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37摄氏度下孵育约15分钟或直到细胞完全胰蛋白酶消化。通过在腔盖玻片的八个孔中制备lrECM床，在每个孔中涂上60微升lrECM。将其放入 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中最多 15 分钟。为了制备细胞悬液，加入5毫升重悬培养基以淬灭胰蛋白酶活性，并在25摄氏度下以112倍g旋转细胞10分钟。吸出用过的培养基并将细胞重新悬浮在2毫升测定培养基中。充分混合悬浮液以确保形成单细胞悬液。使用血细胞计数器计数细胞，并计算在每个孔中接种6， 000个细胞所需的细胞悬液体积。根据所需的孔数，在覆盖介质中稀释细胞悬液。将400微升稀释的细胞悬液添加到准备好的lrECM床中，小心确保不会干扰lrECM床。在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳培养箱中孵育。3小时后，向每个孔中加入200纳摩尔的PAF。在每次更换培养基时加入相同浓度的PAF，并每4天用新鲜培养基补充细胞。培养20天后，小心地从每个孔中移出培养基，并用400微升预热的PBS清洗孔。通过加入400微升新鲜制备的4%多聚甲醛并在室温下孵育20分钟来固定腺泡结构。用冰冷的PBS冲洗孔一次，并用含有0.5%Triton X-100的PBS在4摄氏度下透化10分钟。10分钟后，小心移出Triton X-100溶液，并用400微升新鲜制备的PBS甘氨酸冲洗。在免疫荧光缓冲液中加入400微升含有10%山羊血清的主要封闭溶液，并在室温下孵育60分钟。取出一级封闭溶液，加入在一级封闭溶液中制备的200微升2%二级封闭抗体，并在室温下放置45至60分钟。将一抗制备在 2% 二级封闭抗体溶液中，以 1：100 稀释度制备。取出二级封闭溶液，加入新鲜制备的抗体，并在4摄氏度下孵育过夜。小心移液一抗溶液，并用400微升免疫荧光缓冲液洗涤三次。接下来，在一抗封闭溶液中制备1：200稀释的荧光团偶联二抗，并将载玻片在二抗溶液中在室温下孵育40至60分钟。用400微升免疫荧光缓冲液冲洗载玻片20分钟，然后用PBS洗涤两次，每次10分钟。在室温下用含有每毫升0.5纳克核染色剂的PBS对细胞核进行复染5至6分钟。用400微升PBS清洗载玻片三次，以去除多余的污渍。小心地移出整个PBS，并确保去除残留的溶液。然后在每个孔中加入一滴封片剂，使其在室温下静置过夜。最后，在共聚焦显微镜上以40倍或63倍放大倍率对载玻片进行成像，取0.6毫米步长的光学Z切片。这些图像代表用核染色的腺泡中细胞核。这里显示了腺泡的3D结构和MCF10A腺泡在lrECM上生长20天的相差图像。最中间的部分显示了空心腔的存在。PAF破坏极性并诱导MCF10A乳腺腺泡的EMT样变化。MCF10A细胞在lrECM的顶部培养物上以3D形式生长。培养物在第0、4、8、12和16天用PAF处理。将培养物维持20天，然后免疫染色α6-整合素和核染色，GM130（顶端极性标志物）和Vimentin（EMT标志物）。此处显示了各个腺泡的最中心堆栈。代表性数据是来自三个生物学独立实验的40-50个腺泡。lrECM床需要仔细制作，使其均匀分布，没有任何气泡。此外，细胞悬液应均匀混合并缓慢添加以避免结块。可以从3D培养物中获得蛋白质和RNA，然后可用于研究不同的分子途径。

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