Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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Wir danken der IISER Pune Microscopy Facility für den Zugang zu Ausrüstung und Infrastruktur und die Unterstützung der Experimente. Diese Studie wurde durch einen Zuschuss des Department of Biotechnology (DBT), der indischen Regierung (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013), des Science and Engineering Research Board (SERB), der indischen Regierung (EMR / 2016 / 001974) und teilweise durch IISER, Pune Core-Finanzierung unterstützt. A. K. wurde durch das CSIR-SRF-Stipendium finanziert, L.A. wurde durch das DST-INSPIRE-Stipendium finanziert, V.C. wurde durch DBT finanziert (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

1. Aussaat von MCF10A-Zellen in lrECM
<ol><li>Halten Sie MCF10A-Zellen (adhärente Brustepithelzellen) im Wachstumsmedium. Durchgang der Zellen alle 4 Tage. HINWEIS: Zusammensetzung des Wachstumsmediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat mit Pferdeserum (5%), Insulin (10 μg/ml), Hydrocortison (0,5 μg/ml), epidermaler Wachstumsfaktor, EGF (20 ng/ml), Choleratoxin (100 ng/ml) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten/ml) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Auftauen vo...

Etablierte Zelllinien-basierte Modelle werden häufig verwendet, um den Prozess der Karzinogenese zu untersuchen. Monoschichtkulturen von Zellen liefern weiterhin Einblicke in die verschiedenen molekularen Signalwege, die charakteristische Veränderungen in Krebszellen vermitteln32. Studien zur Rolle bekannter Onkogene wie Ras, Myc und mutiertem p53 wurden erstmals unter Verwendung von Monoschichtkulturen als Modellsystem33,34,35,36</...

Eine Vielzahl von Modellen steht zur Verfügung, um das Fortschreiten von Krebs zu untersuchen, von denen jedes einzigartig ist und einen Subtyp dieser komplexen Krankheit darstellt. Jedes Modell bietet einzigartige und wertvolle Einblicke in die Krebsbiologie und hat die Mittel verbessert, um den tatsächlichen Krankheitszustand nachzuahmen. Etablierte Zelllinien, die als Monoschicht gezüchtet wurden, haben wertvolle Einblicke in lebenswichtige Prozesse in vitro wie Proliferation, Invasivität, Migration und Apoptosegeliefert 1. Obwohl die zweidimensionale (2D) Zellkultur das traditionelle Werkzeug war, um die Reaktion von Säugetierzellen auf mehrere Umweltstörungen zu untersuchen, scheint die Extrapolation dieser Ergebnisse zur Vorhersage von Reaktionen auf Gewebeebene nicht überzeugend genug zu sein. Die Haupteinschränkung der 2D-Kulturen besteht darin, dass sich die erzeugte Mikroumgebung stark von der des Brustgewebes selbst unterscheidet2. Der 2D-Kultur fehlt die Interaktion der Zellen mit der extrazellulären Matrix, die für das Wachstum jedes Gewebes unerlässlich ist. Auch Zugkräfte, denen die Zelle in Monoschichtkulturen ausgesetzt ist, behindern die Polarität dieser Zellen und verändern so die Zellsignalisierung unddas Verhalten 3,4,5. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme haben mit ihrer Fähigkeit, die in vivo Bedingungen in vitro nachzuahmen, einen neuen Weg im Bereich der Krebsforschung eröffnet. Viele wichtige Hinweise auf die Mikroumgebung, die in der 2D-Zellkultur verloren gehen, könnten mithilfe von 3D-Kulturen der lamininreichen extrazellulären Matrix (lrECM) wiederhergestellt werden6.
Verschiedene Studien haben die Bedeutung der Tumormikroumgebung bei der Karzinogenese identifiziert 7,8. Entzündungsassoziierte Faktoren sind ein wichtiger Teil der Mikroumgebung. Der Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) ist ein von verschiedenen Immunzellen sezernierter Phospholipidmediator, der mehrere Immunantworten vermittelt 9,10. Hohe PAF-Spiegel werden von verschiedenen Brustkrebszelllinien sezerniert und sind mit einer erhöhten Proliferation assoziiert11. Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass die längere Anwesenheit von PAF in Azinuskulturen zur Transformation von Brustepithelzellen führt12. PAF aktiviert den PAF-Rezeptor (PAFR) und aktiviert die PI3K/Akt-Signalachse13. Es wird auch berichtet, dass PAFR mit EMT, Invasion und Metastasierung assoziiert ist14.
Das vorliegende Protokoll zeigt ein Modellsystem zur Untersuchung der PAF-induzierten Transformation unter Verwendung von 3D-Kulturen von Brustepithelzellen, wie sie zuvor von Chakravarty et al.12 beschrieben wurde. Die Brustepithelzellen, die auf der extrazellulären Matrix (3D-Kulturen) wachsen, neigen dazu, polarisierte wachstumshemmende Sphäroide zu bilden. Diese werden Acini genannt und ähneln stark den Acini des Brustgewebes, der kleinsten funktionellen Einheit der Brustdrüse, in vivo15. Diese Sphäroide (Abbildung 1A,B) bestehen aus einer Monoschicht dicht gepackter polarisierter Epithelzellen, die ein hohles Lumen umgeben und an der Basalmembran befestigt sind (Abbildung 1C). Dieser Prozess der Morphogenese wurde in Literatur16 gut beschrieben. Wenn sie auf lrECM ausgesät werden, durchlaufen die Zellen eine Teilung und Differenzierung, um einen Zellhaufen zu bilden, der dann ab Tag 4 polarisiert. Am Tag 8 bestehen die Acini aus einer Gruppe polarisierter Zellen, die in direktem Kontakt mit der extrazellulären Matrix stehen, und einem Cluster von unpolarisierten Zellen, die in den äußeren polarisierten Zellen eingeschlossen sind, ohne Kontakt zur Matrix. Es ist bekannt, dass diese unpolarisierten Zellen am 12. Tag der Kultur Apoptose durchlaufen und ein hohles Lumen bilden. Am Tag 16 bilden sich wachstumshemmende Strukturen16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> Abbildung 1: Zellkerne in Acini, die mit einer Kernfärbung gefärbt sind . (A) 3D-Konstruktion der Acini. (B) Phasenkontrastbild von MCF10A acini, das 20 Tage lang auf Matrigel gezüchtet wurde. (C) Der mittlere Abschnitt zeigt das Vorhandensein eines hohlen Lumens. Maßstabsbalken = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Im Gegensatz zu 2D-Kulturen helfen Azinuskulturen bei der Unterscheidung normaler und transformierter Zellen durch offensichtliche Morphologieänderungen. Nicht transformierte Brustepithelzellen bilden Acini mit einem hohlen Lumen, das die normalen menschlichen Brustacini nachahmt. Diese Sphäroide zeigen bei der Transformation eine gestörte Morphologie, die durch einen starken Polaritätsverlust (eines der Kennzeichen von Krebs), das Fehlen eines Lumens oder eine Störung des Hohllumens (aufgrund der Umgehung der Apoptose) gekennzeichnet ist, die aufgrund einer Deregulation verschiedener Gene induziert werden kann17,18,19,20 . Diese Transformationen können mit häufig verwendeten Techniken wie Immunfluoreszenz untersucht werden. Somit kann das 3D-Zellkulturmodell als einfache Methode dienen, um den Prozess der Brust-Azinus-Morphogenese und Brustkarzinogenese zu untersuchen. Die Einrichtung eines 3D-Kultursystems, um die Wirkung eines Phospholipidmediators, PAF, zu verstehen, wird das präklinische Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz unterstützen.
Diese Arbeit hat das 3D-On-Top-Kulturprotokoll16,21 für die Untersuchung der durch PAF 22 induzierten Transformation angepasst. Die phänotypischen Veränderungen, die durch die Exposition der Acini gegenüber dem Phospholipidmediator induziert wurden, wurden mittels Immunfluoreszenz untersucht. In der Studie wurden verschiedene Polaritäts- und epitheliale zu mesenchymale Übergangsmarker (EMT)12,16 verwendet. Tabelle 1 erwähnt ihre normale Lokalisation und ihren erwarteten Phänotyp bei der Transformation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Antikörper</td>
			<td>Zeichen</td>
			<td>Normale Lokalisierung</td>
			<td>Transformierter Phänotyp</td>
		</tr><tr><td>α6-Integrin</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Basal mit schwacher lateraler Färbung</td>
			<td>Starker lateraler / apikaler Fleck</td>
		</tr><tr><td>β-Catenin</td>
			<td>Zell-Zell-Übergang</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Abnorme / nukleäre oder zytoplasmatische Lokalisation</td>
		</tr><tr><td>Vimentin</td>
			<td>Emt</td>
			<td>Fehlende / schwache Präsenz</td>
			<td>Hochregulierung</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: In der Studie verwendete Marker. Verschiedene Marker, die mit ihrer Lokalisation in Gegenwart und Abwesenheit einer PAF-Behandlung verwendet werden.
Diese Methode kann am besten verwendet werden, um plausible Medikamente und Zielgene für verschiedene Brustkrebs-Subtypen zu untersuchen / zu screenen. Dies kann Daten zur Arzneimittelreaktion liefern, die näher am In-vivo-Szenario liegen, was zu einer schnelleren und zuverlässigeren Arzneimittelentwicklung beiträgt. Dieses System kann auch verwendet werden, um die molekulare Signalübertragung zu untersuchen, die mit Arzneimittelreaktion und Arzneimittelresistenz verbunden ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

Mehrere Modelle wurden entwickelt, um Krebs zu untersuchen, wie Nagetiermodelle und etablierte Zelllinien. Studien mit diesen Modellen lieferten wertvolle Einblicke in die Karzinogenese. Zelllinien haben ein Verständnis für die Deregulation der molekularen Signalübertragung im Zusammenhang mit der Brusttumorgenese geliefert, während Nagetiermodelle häufig verwendet werden, um zelluläre und molekulare Eigenschaften von Brustkrebs in vivo zu untersuchen. Die Etablierung von 3D-Kulturen von Brustepithel- und Krebszellen hilft, die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Modellen zu schließen, indem die In-vivo-Bedingungen in vitro nachgeahmt werden. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Deregulation komplexer molekularer Signalereignisse und die zellulären Eigenschaften während der Brustkarzinogenese zu verstehen. Hier wird ein 3D-Kultursystem modifiziert, um eine Phospholipid-Mediator-induzierte (Platelet Activating Factor, PAF) Transformation zu untersuchen. Immunmodulatoren und andere sezernierte Moleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression in der Brust. In der vorliegenden Studie werden 3D-Azinuskulturen von Brustepithelzellen PAF-Transformationsmerkmalen wie Polaritätsverlust und veränderten zellulären Eigenschaften ausgesetzt. Dieses 3D-Kultursystem wird dazu beitragen, genetische und / oder epigenetische Störungen zu beleuchten, die durch verschiedene niedermolekulare Einheiten in der Tumormikroumgebung induziert werden. Darüber hinaus wird dieses System auch eine Plattform für die Identifizierung neuer sowie bekannter Gene bieten, die am Transformationsprozess beteiligt sein könnten.

MCF10A-Zellen bilden nach Exposition gegenüber PAF-Behandlung Azinusstrukturen mit sehr unterschiedlichen Phänotypen. Es wurde festgestellt, dass α6-Integrin mit apikaler Färbung fehllokalisiert war. Einige Acini zeigten auch diskontinuierliche Färbungen (Abbildung 2A). Beide Phänotypen weisen auf den Verlust der basalen Polarität hin, wie aus der Literatur24,25 hervorgeht. Frühere Berichte weisen auf die umstrittene Rolle vo...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Das vorliegende Protokoll beschreibt den Aufbau von 3D-On-Top-Kulturen einer nicht transformierten Brustepithelzelllinie, MCF10A, die modifiziert wurde, um die durch den Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) induzierte Transformation zu untersuchen. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Transformation zu bewerten und wird ausführlich diskutiert.

Phospholipid-Mediator-induzierte Transformation in dreidimensionalen Kulturen

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Unsere modifizierten 3D-Assay-Kulturen können verwendet werden, um die Rolle verschiedener Komponenten in einer Krebsmikroumgebung zu untersuchen, was zur Identifizierung neuer Biomarker und Wirkstoffziele führt. Diese Methode ermöglicht es, Veränderungen im zellulären Phänotyp und molekulare Signale zu untersuchen, die dem Immunsystem sehr ähnlich sind. Es kann auch modifiziert werden, um spezifische Anforderungen einer Studie zu erfüllen.Diese Methode kann helfen, neue Biomarker zu identifizieren, die bei der Früherkennung von Brustkrebs helfen können. Molekulare Erkenntnisse können auch zur Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele genutzt werden. Diese Methode kann verwendet werden, um sowohl die Tumorgenese als auch die Morphogenese nach Störungen von Genen oder Genen zu untersuchen, die Aufschluss über die Rolle des Gens oder der Gene geben können.Trypsinisieren Sie zunächst die Zellen, indem Sie das Medium absaugen und mit 2 Milliliter PBS waschen. Fügen Sie 900 Mikroliter 0,05% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für etwa 15 Minuten oder bis die Zellen vollständig trypsinisiert sind. Bereiten Sie ein Bett aus lrECM in acht Vertiefungen eines gekammerten Deckglasobjektträgers vor, indem Sie jede Vertiefung mit 60 Mikrolitern lrECM beschichten.Stellen Sie es für maximal 15 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Kohlendioxid-Inkubator. Um die Zellsuspension vorzubereiten, fügen Sie 5 Milliliter Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu löschen, und drehen Sie die Zellen bei 112 mal g für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Das verbrauchte Medium wird abgesaugt und die Zellen in 2 Milliliter Assaymedium wieder suspendiert.Mischen Sie die Suspension gut, um die Bildung einer einzelligen Suspension sicherzustellen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, die benötigt wird, um 6.000 Zellen in jeder Vertiefung zu säen. Je nach Anzahl der erforderlichen Vertiefungen die Zellsuspension im Overlay-Medium verdünnen.Fügen Sie 400 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in die vorbereiteten lrECM-Betten hinzu und achten Sie darauf, das lrECM-Bett nicht zu stören. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator. Nach 3 Stunden fügen Sie 200 Nanomol PAF zu jeder Vertiefung hinzu.Fügen Sie bei jedem Medienwechsel die gleiche Konzentration an PAF hinzu und füllen Sie die Zellen alle 4 Tage mit frischem Medium auf. Nach 20 Tagen Kultivierung pipetten Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Vertiefungen mit 400 Mikrolitern vorgewärmtem PBS. Fixieren Sie die Azinusstrukturen, indem Sie 400 Mikroliter frisch zubereitetes 4% Paraformaldehyd hinzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Spülen Sie die Vertiefungen einmal mit eiskaltem PBS ab und permeabilisieren Sie mit PBS mit 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach 10 Minuten die Triton X-100-Lösung vorsichtig herauspipetten und mit 400 Mikrolitern frisch zubereitetem PBS-Glycin abspülen. Fügen Sie 400 Mikroliter der primären Blockierungslösung mit 10% Ziegenserum in Immunfluoreszenzpuffer hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 60 Minuten.Entfernen Sie die primäre Blockierungslösung, fügen Sie 200 Mikroliter 2% sekundären blockierenden Antikörper hinzu, der in der primären Blockierungslösung hergestellt wurde, und lassen Sie sie 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Bereiten Sie den primären Antikörper in 2%iger sekundärer blockierender Antikörperlösung in einer Verdünnung von 1:100 vor. Entfernen Sie die sekundäre Blocklösung, fügen Sie den frisch zubereiteten Antikörper hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.Pipetten Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig und waschen Sie sie dreimal mit 400 Mikrolitern Immunfluoreszenzpuffer. Als nächstes wird eine 1:200-Verdünnung des fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpers in der primären Blocklösung hergestellt und die Objektträger in der sekundären Antikörperlösung für 40 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Spülen Sie die Objektträger mit 400 Mikrolitern Immunfluoreszenzpuffer für 20 Minuten, gefolgt von zwei Wäschen mit PBS für jeweils 10 Minuten.Die Kerne mit PBS, das 0,5 Nanogramm pro Milliliter Kernfärbung enthält, für 5 bis 6 Minuten bei Raumtemperatur gegenfärben. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 400 Mikrolitern PBS, um den überschüssigen Fleck zu entfernen. Pipette vorsichtig das gesamte PBS heraus und stelle sicher, dass die Restlösung entfernt wird.Dann einen Tropfen Montagereagenz in jede Vertiefung geben und über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Schließlich bilden Sie die Objektträger unter 40- oder 63-facher Vergrößerung auf einem konfokalen Mikroskop ab und nehmen optische Z-Schnitte von 0,6 Millimetern Schrittgröße auf. Die Bilder zeigen die Zellkerne in Acini, die mit einer Kernfärbung gefärbt sind.Die 3D-Konstruktion der Acini und das Phasenkontrastbild von MCF10A-Acini, die 20 Tage lang auf lrECM gezüchtet wurden, werden hier gezeigt. Der mittlere Abschnitt zeigt das Vorhandensein eines hohlen Lumens. PAF stört die Polarität und induziert EMT-ähnliche Veränderungen in MCF10A Brustacini.MCF10A-Zellen wurden als 3D-on-Top'-Kulturen in lrECM gezüchtet. Die Kulturen wurden am Tag 0, 4, 8, 12 und 16 mit PAF behandelt. Die Kulturen wurden 20 Tage lang gehalten und dann auf alpha6-Integrin und Kernfärbung, GM130, einen Marker für apikale Polarität, und Vimentin, einen EMT-Marker, immungefärbt.Hier ist der mittigste Stapel der jeweiligen Acini dargestellt. Die repräsentativen Daten beziehen sich auf 40-50 Acini aus drei biologisch unabhängigen Experimenten. Das lrECM-Bett muss sorgfältig so gestaltet werden, dass es gleichmäßig und ohne Luftblasen verteilt wird.Außerdem sollte die Zellsuspension gleichmäßig gemischt und langsam hinzugefügt werden, um ein Verklumpen zu vermeiden. Aus den 3D-Kulturen kann man Protein und RNA gewinnen, mit denen dann die verschiedenen molekularen Signalwege untersucht werden können.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Forschung

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Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

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