Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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हम उपकरण और बुनियादी ढांचे तक पहुंच और प्रयोगों के लिए समर्थन के लिए आईआईएसईआर पुणे माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी), भारत सरकार (बीटी / पीआर 8699 / एमईडी / 30/1018/2013), विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (एसईआरबी), भारत सरकार (ईएमआर / 2016/001974) और आंशिक रूप से आईआईएसईआर, पुणे कोर फंडिंग द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एके को सीएसआईआर-एसआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था, एलए को डीएसटी-इंस्पायर फैलोशिप के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, वीसी को डीबीटी (बीटी / पीआर 8699 / एमईडी / 30/1018/2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

1. एलआरईसीएम में एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं को बोना
<ol><li>विकास माध्यम में एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं (पक्षपाती स्तन उपकला कोशिकाओं) को बनाए रखें। हर 4 दिनों में कोशिकाओं को पारित करें। नोट: विकास माध्यम की संरचना:...

कार्सिनोजेनेसिस की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए स्थापित सेल लाइन-आधारित मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृतियां विभिन्न आणविक सिग्नलिंग मार्गों में अंतर्दृष्?...

कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए असंख्य मॉडल उपलब्ध हैं, उनमें से प्रत्येक अद्वितीय है और इस जटिल बीमारी के उपप्रकार का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक मॉडल कैंसर जीव विज्ञान में अद्वितीय और मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और वास्तविक बीमारी की स्थिति की नकल करने के साधनों में सुधार किया है। मोनोलेयर के रूप में विकसित स्थापित सेल लाइनों ने इन विट्रो में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जैसे कि प्रसार, आक्रामकता, प्रवासन और एपोप्टोसिस1. यद्यपि दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति कई पर्यावरणीय गड़बड़ी के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए पारंपरिक उपकरण रहा है, ऊतक-स्तरीय प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए इन निष्कर्षों का एक्सट्रपलेशन पर्याप्त रूप से आश्वस्त नहीं लगता है। 2 डी संस्कृतियों की प्रमुख सीमा यह है कि बनाया गया माइक्रोएन्वायरमेंट स्तन ऊतक से काफी हद तक भिन्न होता है2. 2 डी संस्कृति में बाह्य मैट्रिक्स के साथ कोशिकाओं की बातचीत का अभाव है, जो किसी भी ऊतक के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मोनोलेयर संस्कृतियों में सेल द्वारा अनुभव की जाने वाली तन्यता बल इन कोशिकाओं की ध्रुवीयता में बाधा डालती हैं, इस प्रकार सेल सिग्नलिंग और व्यवहार 3,4,5 को बदल देती हैं। त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों ने इन विट्रो में विवो स्थितियों की नकल करने की अपनी क्षमता के साथ कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक नया एवेन्यू खोला है। 2 डी सेल संस्कृति में खो जाने वाले कई महत्वपूर्ण माइक्रोएनवायरनमेंटल संकेतों को लैमिनिन समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स (एलआरईसीएम) 6 की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग करके फिर से स्थापित किया जा सकता है।
विभिन्न अध्ययनों ने कार्सिनोजेनेसिस 7,8 में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के महत्व की पहचान की है। सूजन से जुड़े कारक माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख हिस्सा हैं। प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर (पीएएफ) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ है जो कई प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 9,10 की मध्यस्थता करता है। पीएएफ के उच्च स्तर विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों द्वारा स्रावित होते हैं और बढ़े हुए प्रसार11 से जुड़े होते हैं। हमारी प्रयोगशाला के अध्ययनों से पता चला है कि एसिनार संस्कृतियों में पीएएफ की लंबे समय तक उपस्थिति स्तन उपकला कोशिकाओं के परिवर्तन की ओर ले जाती है12. पीएएफ पीएएफ रिसेप्टर (पीएएफआर) को सक्रिय करता है, पीआई 3 के / एक्ट सिग्नलिंग अक्ष13 को सक्रिय करता है। पीएएफआर को ईएमटी, आक्रमण और मेटास्टेसिस14 से भी जुड़ा होने की सूचना है।
वर्तमान प्रोटोकॉल स्तन उपकला कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग करके पीएएफ-प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली को प्रदर्शित करता है, जैसा कि पहले चक्रवर्ती एट अल द्वारा वर्णित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स (3 डी संस्कृतियों) पर उगाई जाने वाली स्तन उपकला कोशिकाएं ध्रुवीकृत विकास-गिरफ्तार स्फेरॉइड बनाती हैं। इन्हें एसिनी कहा जाता है और विवो15 में स्तन ग्रंथि की सबसे छोटी कार्यात्मक इकाई स्तन ऊतक के एसिनी से मिलता-जुलता है। इन स्फेरॉइड (चित्रा 1 ए, बी) में एक खोखले लुमेन के आसपास बारीकी से पैक ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर होता है और तहखाने झिल्ली (चित्रा 1 सी) से जुड़ा होता है। मॉर्फोजेनेसिस की इस प्रक्रिया को साहित्य16 में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। जब एलआरईसीएम पर वरीयता प्राप्त होती है, तो कोशिकाएं कोशिकाओं का एक समूह बनाने के लिए विभाजन और भेदभाव से गुजरती हैं, जो तब दिन 4 से ध्रुवीकरण करती हैं। दिन 8 तक, एसिनी में ध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक समूह होता है जो बाह्य मैट्रिक्स के सीधे संपर्क में होते हैं और बाहरी ध्रुवीकृत कोशिकाओं के भीतर संलग्न अध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक समूह होता है, जिसमें मैट्रिक्स से कोई संपर्क नहीं होता है। इन अध्रुवीकृत कोशिकाओं को संस्कृति के दिन 12 तक एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए जाना जाता है, जिससे एक खोखला लुमेन बनता है। दिन 16 तक, विकास-गिरफ्तार संरचनाएं16 बनती हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> चित्रा 1: एसीनी में कोशिकाओं के नाभिक एक परमाणु दाग के साथ दाग. (ए) एसिनी का 3 डी निर्माण। (बी) 20 दिनों के लिए मैट्रिगेल पर उगाए गए एमसीएफ 10 ए एसिनी की चरण विपरीत छवि। (सी) केंद्र का सबसे महत्वपूर्ण खंड एक खोखले लुमेन की उपस्थिति को दर्शाता है। स्केल बार = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
2 डी संस्कृतियों के विपरीत, एसिनार संस्कृतियां स्पष्ट आकृति विज्ञान परिवर्तनों के माध्यम से सामान्य और परिवर्तित कोशिकाओं को अलग करने में सहायता करती हैं। गैर-रूपांतरित स्तन उपकला कोशिकाएं एक खोखले लुमेन के साथ एसिनी बनाती हैं, जो सामान्य मानव स्तन एसिनी की नकल करती हैं। ये स्फेरॉइड, परिवर्तन पर, ध्रुवीयता (कैंसर की पहचान में से एक), लुमेन की अनुपस्थिति, या खोखले लुमेन के विघटन (एपोप्टोसिस की चोरी के कारण) के एक बड़े नुकसान की विशेषता वाली एक बाधित आकृति विज्ञान दिखाते हैं जो विभिन्न जीनों के विनियमन के कारण प्रेरित हो सकता है 17,18,19,20 . इन परिवर्तनों का अध्ययन आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया जा सकता है। इस प्रकार, 3 डी सेल संस्कृति मॉडल स्तन एसिनार मॉर्फोजेनेसिस और स्तन कार्सिनोजेनेसिस की प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक सरल विधि के रूप में कार्य कर सकता है। फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ, पीएएफ के प्रभाव को समझने के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली की स्थापना, उच्च थ्रूपुट प्रीक्लिनिकल ड्रग स्क्रीनिंग में सहायता करेगी।
इस काम ने पीएएफ 22 द्वारा प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए 3 डी 'ऑन टॉप' संस्कृति प्रोटोकॉल 16,21 को अनुकूलित किया है। फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ के लिए एसिनी के संपर्क से प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया गया था। अध्ययन में मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) मार्करों12,16 के लिए विभिन्न ध्रुवीयता और उपकला का उपयोग किया गया था। तालिका 1 में परिवर्तन पर उनके सामान्य स्थानीयकरण और उनके अपेक्षित फेनोटाइप का उल्लेख है।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>एंटीबॉडी</td>
			<td>चिह्न</td>
			<td>सामान्य स्थानीयकरण</td>
			<td>रूपांतरित फेनोटाइप</td>
		</tr><tr><td>α6-एकीकृत</td>
			<td>बेसोलेटरल</td>
			<td>कमजोर पार्श्व दाग के साथ बेसल</td>
			<td>मजबूत पार्श्व / एपिकल दाग</td>
		</tr><tr><td>β-कैटेनिन</td>
			<td>सेल-सेल जंक्शन</td>
			<td>बेसोलेटरल</td>
			<td>परमाणु या साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण</td>
		</tr><tr><td>विमेंटिन</td>
			<td>ईएमटी</td>
			<td>अनुपस्थित / कमजोर उपस्थिति</td>
			<td>अप-रेगुलेशन</td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मार्कर। पीएएफ उपचार की उपस्थिति और अनुपस्थिति में उनके स्थानीयकरण के साथ उपयोग किए जाने वाले विभिन्न मार्कर।
इस पद्धति का उपयोग प्रशंसनीय दवाओं का अध्ययन / स्क्रीन करने और विभिन्न स्तन कैंसर उपप्रकारों के लिए जीन को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। यह विवो परिदृश्य के करीब एक दवा प्रतिक्रिया डेटा प्रदान कर सकता है, जो तेजी से और अधिक विश्वसनीय दवा विकास में सहायता करता है। इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग दवा प्रतिक्रिया और दवा प्रतिरोध से जुड़े आणविक सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

कैंसर का अध्ययन करने के लिए कई मॉडल विकसित किए गए हैं, जैसे कृंतक मॉडल और स्थापित सेल लाइनें। इन मॉडलों का उपयोग करके अध्ययन द्वारा कार्सिनोजेनेसिस में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। सेल लाइनों ने स्तन ट्यूमरजेनेसिस से जुड़े आणविक सिग्नलिंग के विनियमन की समझ प्रदान की है, जबकि कृंतक मॉडल का व्यापक रूप से विवो में स्तन कैंसर की सेलुलर और आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। स्तन उपकला और कैंसर कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों की स्थापना इन विट्रो में विवो स्थितियों की नकल करके विवो और इन विट्रो मॉडल के बीच की खाई को पाटने में सहायता करती है। इस मॉडल का उपयोग जटिल आणविक सिग्नलिंग घटनाओं और स्तन कार्सिनोजेनेसिस के दौरान सेलुलर विशेषताओं के विनियमन को समझने के लिए किया जा सकता है। यहां, फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ-प्रेरित (प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर, पीएएफ) परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को संशोधित किया गया है। इम्यूनोमोड्यूलेटर और अन्य स्रावित अणु स्तन में ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। वर्तमान अध्ययन में, स्तन उपकला कोशिकाओं की 3 डी एसिनार संस्कृतियों को पीएएफ के संपर्क में लाया जाता है, जो ध्रुवीयता के नुकसान और परिवर्तित सेलुलर विशेषताओं जैसे परिवर्तन विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। यह 3 डी संस्कृति प्रणाली ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न छोटे अणु संस्थाओं द्वारा प्रेरित आनुवंशिक और / या एपिजेनेटिक गड़बड़ी पर प्रकाश डालने में सहायता करेगी। इसके अतिरिक्त, यह प्रणाली उपन्यास के साथ-साथ ज्ञात जीनों की पहचान के लिए एक मंच भी प्रदान करेगी जो परिवर्तन की प्रक्रिया में शामिल हो सकते हैं।

एमसीएफ 10 ए कोशिकाएं, पीएएफ उपचार के संपर्क में आने पर, बहुत अलग फेनोटाइप के साथ एसीनार संरचनाएं बनाती हैं। α6-इंटीग्रिन को अधिक एपिकल धुंधला होने के साथ गलत पाया गया। कुछ एसिनी ने असंतत धुंधला (चि?...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

वर्तमान प्रोटोकॉल एक गैर-रूपांतरित स्तन उपकला सेल लाइन, एमसीएफ 10 ए की 3 डी 'ऑन टॉप' संस्कृतियों की स्थापना का वर्णन करता है, जिसे प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर (पीएएफ) प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया है। परिवर्तन का आकलन करने के लिए इम्यूनो-प्रतिदीप्ति का उपयोग किया गया है और विस्तार से चर्चा की गई है।

फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ प्रेरित तीन आयामी संस्कृतियों में परिवर्तन

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

हमारे संशोधित 3 डी परख संस्कृतियों का उपयोग कैंसर माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न घटकों की भूमिका की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जिससे उपन्यास बायोमार्कर और दवा लक्ष्यों की पहचान हो सकती है। यह विधि सेलुलर फेनोटाइप और आणविक सिग्नलिंग में परिवर्तन का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है जो प्रतिरक्षा प्रणाली से मिलती-जुलती है। इसे एक अध्ययन की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है।यह विधि उपन्यास बायोमार्कर की पहचान करने में मदद कर सकती है जो स्तन कैंसर का जल्दी पता लगाने में सहायता कर सकती है। इसके अलावा, आणविक अंतर्दृष्टि का उपयोग उपन्यास दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इस पद्धति का उपयोग जीन या जीन की गड़बड़ी के बाद ट्यूमरजेनेसिस और मॉर्फोजेनेसिस दोनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो जीन या जीन द्वारा निभाई गई भूमिका में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।शुरू करने के लिए, माध्यम की आकांक्षा करके और पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ धोने से कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें। 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 900 माइक्रोलीटर जोड़ें और लगभग 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या कोशिकाओं को पूरी तरह से ट्रिप्सिनाइज्ड होने तक सेते हैं। एलआरईसीएम के 60 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कोटिंग करके एक कक्षीय कवर ग्लास स्लाइड के आठ कुओं में एलआरईसीएम का एक बिस्तर तैयार करें।इसे अधिकतम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में रखें। सेल निलंबन तैयार करने के लिए, ट्रिप्सिन गतिविधि को बुझाने के लिए पुन: निलंबन माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 112 गुना जी पर कोशिकाओं को स्पिन करें। खर्च किए गए माध्यम की आकांक्षा करें और परख माध्यम के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।एक एकल सेल निलंबन के गठन को सुनिश्चित करने के लिए निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं। एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और प्रत्येक कुएं में 6, 000 कोशिकाओं को बीज करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें। आवश्यक कुओं की संख्या के अनुसार, ओवरले माध्यम में सेल निलंबन को पतला करें।तैयार एलआरईसीएम बेड में पतला सेल निलंबन के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें, ध्यान से सुनिश्चित करें कि एलआरईसीएम बिस्तर को परेशान न करें। एक आर्द्र 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 3 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में पीएएफ के 200 नैनोमोल जोड़ें।प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के दौरान पीएएफ की एक ही एकाग्रता जोड़ें, और हर 4 दिनों में ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से भरें। संवर्धन के 20 दिनों के बाद, ध्यान से प्रत्येक कुएं से माध्यम को पिपेट करें और पूर्व-गर्म पीबीएस के 400 माइक्रोलीटर के साथ कुओं को धो लें। ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 400 माइक्रोलीटर जोड़कर और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करके एसीनार संरचनाओं को ठीक करें।बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ कुओं को एक बार कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस के साथ पारगम्य करें। 10 मिनट के बाद, ट्राइटन एक्स -100 समाधान को ध्यान से पिपेट करें और ताजा तैयार पीबीएस ग्लाइसिन के 400 माइक्रोलीटर के साथ कुल्ला करें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर में 10% बकरी सीरम वाले प्राथमिक अवरुद्ध समाधान के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।प्राथमिक अवरुद्ध समाधान निकालें, प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में तैयार 2% माध्यमिक अवरुद्ध एंटीबॉडी के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और इसे 45 से 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। 1:100 कमजोर पड़ने में 2% माध्यमिक अवरुद्ध एंटीबॉडी समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। माध्यमिक अवरुद्ध समाधान निकालें, ताजा तैयार एंटीबॉडी जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।ध्यान से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान विंदुक और इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर के 400 माइक्रोलीटर के साथ इसे तीन बार धो लें। अगला, प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का 1: 200 कमजोर पड़ने तैयार करें और कमरे के तापमान पर 40 से 60 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में स्लाइड सेते हैं। 20 मिनट के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस बफर के 400 माइक्रोलीटर के साथ स्लाइड कुल्ला, 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो धोने के बाद।कमरे के तापमान पर 5 से 6 मिनट के लिए परमाणु दाग के 0.5 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर वाले पीबीएस के साथ नाभिक को काउंटर-दाग दें। अतिरिक्त दाग को हटाने के लिए पीबीएस के 400 माइक्रोलीटर के साथ स्लाइड को तीन बार धोएं। ध्यान से पूरे पीबीएस बाहर विंदुक और अवशिष्ट समाधान को हटाने सुनिश्चित करें।फिर प्रत्येक कुएं में बढ़ते अभिकर्मक की एक बूंद जोड़ें और इसे रात भर कमरे के तापमान पर खड़े होने की अनुमति दें। अंत में, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 40x या 63x आवर्धन के तहत स्लाइड्स को छवि दें, 0.6 मिलीमीटर चरण आकार के ऑप्टिकल जेड-सेक्शन लें। छवियां परमाणु दाग के साथ दाग वाले एसिनी में कोशिकाओं के नाभिक का प्रतिनिधित्व करती हैं।एसिनी का 3 डी निर्माण और 20 दिनों के लिए एलआरईसीएम पर उगाए गए एमसीएफ 10 ए एसिनी की चरण विपरीत छवि यहां दिखाई गई है। सबसे केंद्र खंड एक खोखले लुमेन की उपस्थिति को दर्शाता है। पीएएफ ध्रुवीयता को बाधित करता है और एमसीएफ 10 ए स्तन एसिनी में ईएमटी जैसे परिवर्तनों को प्रेरित करता है।एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं को एलआरईसीएम में शीर्ष संस्कृतियों पर 3 डी के रूप में उगाया गया था। संस्कृतियों को दिन 0, 4, 8, 12 और 16 पर पीएएफ के साथ इलाज किया गया था। संस्कृतियों को 20 दिनों के लिए बनाए रखा गया था और फिर अल्फा 6-इंटीग्रिन और परमाणु दाग, जीएम 130, एपिकल ध्रुवीयता के लिए एक मार्कर, और विमेंटिन, एक ईएमटी मार्कर के लिए इम्यूनोस्टेन किया गया था।संबंधित एसिनी का सबसे केंद्र ढेर यहां दिखाया गया है। प्रतिनिधि डेटा तीन जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोगों से 40-50 एसिनी के लिए है। एलआरईसीएम बिस्तर को सावधानीपूर्वक बनाया जाना चाहिए ताकि यह बिना किसी हवा के बुलबुले के समान रूप से फैल जाए।इसके अलावा, सेल निलंबन को समान रूप से मिलाया जाना चाहिए और क्लंपिंग से बचने के लिए धीरे-धीरे जोड़ा जाना चाहिए। कोई 3 डी संस्कृतियों से प्रोटीन और आरएनए प्राप्त कर सकता है जिसका उपयोग विभिन्न आणविक मार्गों की जांच के लिए किया जा सकता है।

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Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रोबायोटिक्स के सेल-फ्री सुपरनेंट का उपयोग करके सेल डेथ का मूल्यांकन करना

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

मानव स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं में ओंकोजेनिक परिवर्तन का विट्रो मूल्यांकन

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

पेट के कैंसर स्टेम सेल का अध्ययन करने के लिए स्फेरॉइड का एक त्रि-आयामी मॉडल

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

कोलेजन-आधारित मचानों का उपयोग करके न्यूरोब्लास्टोमा का त्रि-आयामी इन विट्रो बायोमिमेटिक मॉडल

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...