Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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IISERプネー顕微鏡施設が機器とインフラストラクチャにアクセスし、実験をサポートしてくれたことに感謝します。この研究は、インド政府バイオテクノロジー省(DBT)(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)、インド政府科学技術研究委員会(SERB)(EMR/2016/001974)、および一部はIISER、プネーコア資金による助成金によって支援されました。A. K.はCSIR-SRFフェローシップ、L.A.はDST-INSPIREフェローシップ、V.C.はDBTから資金提供を受けた(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)。

1. MCF10A細胞の播種
<ol><li>MCF10A細胞(接着性乳房上皮細胞)を増殖培地に維持する。4日ごとに細胞を継代する。 注:増殖培地の組成:馬血清(5%)、インスリン(10μg / mL)、ヒドロコルチゾン(0.5μg / mL)、上皮成長因子、EGF(20 ng / mL)、コレラ毒素(100 ng / mL)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(100単位/ mL)を含むピルビン酸ナトリウムを含まない高グルコースDMEM( 材料の表を...

確立された細胞株ベースのモデルは、発がんのプロセスを研究するために広く使用されています。細胞の単層培養は、癌細胞32における特徴的な変化を媒介する様々な分子シグナル伝達経路への洞察を提供し続けている。Ras、Myc、変異p53などのよく知られた癌遺伝子の役割に関する研究は、単層培養をモデルシステムとして使用して最初に報告されました33、34<...

癌の進行を研究するために無数のモデルが利用可能であり、それらのそれぞれは独特であり、この複雑な疾患のサブタイプを表しています。各モデルは、がん生物学に関するユニークで貴重な洞察を提供し、実際の病状を模倣する手段を改善しました。単層として増殖した確立された細胞株は、増殖、侵襲性、遊走、アポトーシスなどのin vitroでの重要なプロセスに関する貴重な洞察を提供しました1。2次元(2D)細胞培養は、いくつかの環境摂動に対する哺乳類細胞の応答を調べるための従来のツールでしたが、組織レベルの応答を予測するためのこれらの発見の外挿は十分に説得力がないようです。2D培養の主な制限は、作成される微小環境が乳房組織自体の微小環境と大きく異なることです2。2D培養は、あらゆる組織の成長に不可欠な細胞外マトリックスとの細胞との相互作用を欠いています。また、単層培養で細胞が受ける引張力は、これらの細胞の極性を妨げ、したがって細胞のシグナル伝達と挙動を変化させます3,4,5。3次元(3D)培養システムは、in vitroでin vivo条件を模倣する能力により、癌研究の分野に新しい道を開きました。2D細胞培養で失われる多くの重要な微小環境手がかりは、ラミニンリッチ細胞外マトリックス(lrECM)6の3D培養を使用して再確立できます。
さまざまな研究により、発がんにおける腫瘍微小環境の重要性が確認されています7,8。炎症関連因子は微小環境の主要な部分です。血小板活性化因子(PAF)は、複数の免疫応答を媒介する様々な免疫細胞によって分泌されるリン脂質メディエーターである9,10。高レベルのPAFは、異なる乳癌細胞株によって分泌され、増殖の亢進と関連している11。私たちの研究室の研究は、腺房培養におけるPAFの長期存在が乳房上皮細胞の形質転換につながることを示しています12。PAFはPAF受容体(PAFR)を活性化し、PI3K/Aktシグナル伝達軸13を活性化します。PAFRはまた、EMT、浸潤、および転移に関連していると報告されています14。
本プロトコルは、Chakravartyらによって以前に記載されているように、乳房上皮細胞の3D培養物を使用して、PAF誘導形質転換を研究するためのモデルシステムを実証する12。細胞外マトリックス(3D培養)上で増殖した乳房上皮細胞は、分極成長停止スフェロイドを形成する傾向があります。これらは腺房と呼ばれ、in vivo15で乳腺の最小機能単位である乳房組織の腺房によく似ています。これらのスフェロイド(図1A、B)は、中空の内腔を取り囲み、基底膜に付着した密集した分極上皮細胞の単層で構成されています(図1C)。この形態形成の過程は文献16によく記載されている。lrECMに播種すると、細胞は分裂と分化を受けて細胞のクラスターを形成し、4日目以降に分極します。8日目までに、腺房は、細胞外マトリックスと直接接触している分極細胞のグループと、マトリックスに接触しない外側の分極細胞内に囲まれている非分極細胞のクラスターで構成されています。これらの非分極細胞は、培養12日目までにアポトーシスを起こし、中空の内腔を形成することが知られている。16日目までに、成長停止構造が形成されます16。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> 図1:核染色で染色された腺房内の細胞の核。 (A)腺房の3D構築。(B)マトリゲル上で20日間生育させたMCF10A腺房の位相差像。(C)最も中央のセクションは、中空の内腔の存在を示しています。スケールバー= 20μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2D培養とは異なり、腺房培養は、明らかな形態変化を通じて正常細胞と形質転換細胞を区別するのに役立ちます。形質転換されていない乳房上皮細胞は、正常なヒト乳房腺房を模倣して、中空の内腔を有する腺房を形成する。これらのスフェロイドは、形質転換時に、極性の大きな喪失(癌の特徴の1つ)、内腔の欠如、または様々な遺伝子の調節解除のために誘発され得る中空管腔の破壊(アポトーシスの回避による)を特徴とする破壊された形態を示す17,18,19,20。.これらの形質転換は、免疫蛍光法などの一般的に使用される技術を用いて研究することができる。したがって、3D細胞培養モデルは、乳房腺房形態形成および乳房発がんの過程を調査するための簡便な方法として機能することができる。リン脂質メディエーターであるPAFの効果を理解するための3D培養システムを確立することで、ハイスループットの前臨床薬物スクリーニングに役立ちます。
この研究は、PAF22によって誘発される形質転換を研究するために、3D「オントップ」培養プロトコル16,21を適応させた。リン脂質メディエーターへの腺房の曝露によって誘発される表現型の変化を免疫蛍光を用いて研究した。さまざまな極性および上皮間葉転換(EMT)マーカー12,16が研究に使用されました。表1は、それらの正常な局在と形質転換時に予想される表現型について言及しています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>抗体</td>
			<td>マーク</td>
			<td>通常のローカリゼーション</td>
			<td>形質転換表現型</td>
		</tr><tr><td>α6-インテグリン</td>
			<td>基底外側</td>
			<td>弱い横方向の汚れを伴う基礎</td>
			<td>強い横方向/頂端染色</td>
		</tr><tr><td>β-カテニン</td>
			<td>細胞間接合</td>
			<td>基底外側</td>
			<td>異常/核または細胞質の局在</td>
		</tr><tr><td>ビメンチン</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>不在/弱い存在</td>
			<td>アップレギュレーション</td>
		</tr></tbody></table>表1:研究で使用されたマーカー。 PAF治療の存在下および非存在下でのそれらの局在化と共に使用される異なるマーカー。
この方法は、さまざまな乳がんサブタイプのもっともらしい薬や標的遺伝子の研究/スクリーニングに最適です。これにより、 in vivo シナリオに近い薬物応答データが提供され、より迅速で信頼性の高い医薬品開発に役立ちます。また、このシステムは、薬物応答および薬剤耐性に関連する分子シグナル伝達の研究に使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

げっ歯類モデルや確立された細胞株など、癌を研究するためにいくつかのモデルが開発されています。発がんに関する貴重な洞察は、これらのモデルを使用した研究によって提供されています。細胞株は、乳房腫瘍形成に関連する分子シグナル伝達の調節解除の理解を提供し、げっ歯類モデルはin vivoでの乳がんの細胞および分子特性を研究するために広く使用されています。乳房上皮細胞と癌細胞の3D培養の確立は、in vitroでのin vivo条件を模倣することにより、in vivoモデルとin vitroモデルの間のギャップを埋めるのに役立ちます。このモデルは、複雑な分子シグナル伝達イベントの調節解除と乳房発がん中の細胞特性を理解するために使用できます。ここでは、リン脂質メディエーター誘発性(血小板活性化因子、PAF)形質転換を研究するために、3D培養システムを変更しています。免疫調節剤および他の分泌分子は、乳房における腫瘍の開始および進行において主要な役割を果たす。本研究では、乳房上皮細胞をPAFに曝露した3D腺房培養物は、極性の喪失や細胞特性の変化などの形質転換特性を示しました。この3D培養システムは、腫瘍微小環境における様々な低分子実体によって誘発される遺伝的および/またはエピジェネティックな摂動に光を当てるのに役立ちます。さらに、このシステムは、形質転換の過程に関与する可能性のある新規および既知の遺伝子を同定するためのプラットフォームも提供します。

MCF10A細胞は、PAF処理に曝露されると、非常に異なる表現型を有する腺房構造を形成する。α6-インテグリンは、より頂端染色で誤局在することがわかった。いくつかの腺房も不連続染色を示した(図2A)。これらの表現型は両方とも、文献24,25から証明されるように、基底極性の喪失を示しています。以前の報告は、癌転移におけ?...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

本プロトコルは、血小板活性化因子(PAF)誘導形質転換を研究するために改変された非形質転換乳房上皮細胞株MCF10Aの3D 「オントップ」培養のセットアップについて説明しています。免疫蛍光は形質転換を評価するために使用されており、詳細に議論されています。

三次元培養におけるリン脂質メディエーター誘導形質転換

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

当社の改変3Dアッセイ培養は、がん微小環境におけるさまざまな成分の役割を調べるために使用でき、新しいバイオマーカーや創薬標的の同定につながります。この方法により、免疫系によく似た細胞表現型と分子シグナル伝達の変化を研究することができます。また、試験の特定の要件を満たすように変更することもできます。この方法は、乳がんの早期発見に役立つ新しいバイオマーカーを特定するのに役立ちます。また、分子の洞察は、新規創薬標的の同定に活用できます。この方法は、遺伝子または遺伝子が果たす役割についての洞察を提供できる遺伝子の摂動後の腫瘍形成および形態形成の両方を研究するために使用することができる。はじめに、培地を吸引し、2ミリリットルのPBSで洗浄することにより、細胞をトリプシン処理します。900マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加え、摂氏37度で約15分間、または細胞が完全にトリプシン処理されるまでインキュベートします。各ウェルを60マイクロリットルのlrECMでコーティングすることにより、チャンバー付きカバーガラススライドの8つのウェルにlrECMのベッドを準備します。摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに最大15分間入れます。細胞懸濁液を調製するには、5ミリリットルの再懸濁培地を加えてトリプシン活性を消光し、細胞を112倍gで摂氏25度で10分間回転させます。使用済みの培地を吸引し、細胞を2ミリリットルのアッセイ培地に再懸濁します。懸濁液をよく混合して、単一細胞懸濁液を確実に形成する。血球計算盤を使用して細胞を数え、各ウェルに6, 000個の細胞を播種するのに必要な細胞懸濁液の量を計算します。必要なウェルの数に応じて、細胞懸濁液をオーバーレイ培地で希釈します。調製したlrECM床に400マイクロリットルの希釈細胞懸濁液を加え、lrECM床を乱さないように注意します。加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。3時間後、各ウェルに200ナノモルのPAFを加えます。培地交換のたびに同じ濃度のPAFを加え、4日ごとに細胞に新しい培地を補充します。20日間の培養後、各ウェルから培地を注意深くピペットで取り出し、400マイクロリットルの予熱PBSでウェルを洗浄します。新たに調製した4%パラホルムアルデヒド400マイクロリットルを加え、室温で20分間インキュベートすることにより、腺房構造を修正します。氷冷したPBSでウェルを一度すすぎ、0.5%Triton X-100を含むPBSで摂氏4度で10分間透過処理します。10分後、Triton X-100溶液を注意深くピペットで取り出し、400マイクロリットルの新たに調製したPBSグリシンですすいでください。10%ヤギ血清を含む一次ブロッキング溶液400マイクロリットルを免疫蛍光バッファーに加え、室温で60分間インキュベートします。一次ブロッキング溶液を除去し、一次ブロッキング溶液に調製した2%二次ブロッキング抗体を200マイクロリットル加え、室温で45〜60分間放置します。一次抗体を1:100希釈の2%二次ブロッキング抗体溶液で調製します。二次ブロッキング溶液を除去し、新たに調製した抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体溶液を慎重にピペットでピペットし、400マイクロリットルの免疫蛍光バッファーで3回洗浄します。次に、一次ブロッキング溶液中の蛍光色素標識二次抗体の1:200希釈液を調製し、二次抗体溶液中でスライドを室温で40〜60分間インキュベートします。スライドを400マイクロリットルの免疫蛍光バッファーで20分間すすぎ、続いてPBSでそれぞれ10分間2回洗浄します。核染色液1ミリリットルあたり0.5ナノグラムを含むPBSで、室温で5〜6分間、核を対比染色します。スライドを400マイクロリットルのPBSで3回洗浄して、余分な汚れを取り除きます。PBS全体を慎重にピペットで取り出し、残留溶液を確実に除去します。次に、各ウェルに1滴の封入試薬を加え、室温で一晩放置します。最後に、共焦点顕微鏡で40倍または63倍の倍率でスライドを画像化し、0.6ミリメートルステップサイズの光学Zセクションを撮影します。画像は、核染色で染色された腺房内の細胞の核を表しています。ここでは、アシニの3D構築と、lrECM上で20日間成長させたMCF10Aアシニの位相差画像を示します。最も中央のセクションは、中空の内腔の存在を示しています。PAFは極性を破壊し、MCF10A乳房腺房にEMT様変化を誘発します。MCF10A細胞は、lrECMで3Dオントップの培養物として増殖させた。培養物を0、4、8、12、および16日目にPAFで処理した。培養物を20日間維持した後、α6-インテグリンおよび核染色、頂端極性のマーカーであるGM130、およびEMTマーカーであるビメンチンについて免疫染色しました。それぞれの腺房の一番中心のスタックがここに示されています。代表的なデータは、3つの生物学的に独立した実験からの40〜50 aciniに関するものである。lrECMベッドは、気泡なしで均等に広がるように慎重に作成する必要があります。また、細胞懸濁液は均一に混合し、凝集を避けるためにゆっくりと添加する必要があります。3D培養からタンパク質とRNAを取得し、それを使用してさまざまな分子経路を調べることができます。

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