Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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장비 및 인프라에 대한 접근과 실험 지원에 대해 IISER Pune 현미경 시설에 감사드립니다. 이 연구는 생명 공학부 (DBT), 인도 정부 (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013), 과학 및 공학 연구위원회 (SERB), 인도 정부 (EMR / 2016 / 001974) 및 부분적으로 IISER, Pune Core 자금. AK는 CSIR-SRF 펠로우십, LA는 DST-INSPIRE 펠로우십, V.C.는 DBT(BT/PR8699/MED/30/1018/2013)에서 자금을 지원받았습니다.

1. lrECM에 MCF10A 세포 파종
<ol><li>MCF10A 세포(부착성 유방 상피 세포)를 성장 배지에 유지합니다. 4 일마다 세포를 계대하십시오. 참고: 성장 배지의 구성: 말 혈청(5%), 인슐린(10μg/mL), 하이드로코르티손(0.5μg/mL), 표피 성장 인자, EGF(20ng/mL), 콜레라 독소(100ng/mL) 및 페니실린-스트렙토마이신(100단위/mL)을 포함하는 나트륨 피루브산이 없는 고포도당 DMEM( 재료 표 참조).</li>
	<li>...

확립 된 세포주 기반 모델은 발암 과정을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 세포의 단일층 배양은 암세포의 특징적인 변화를 매개하는 다양한 분자 신호전달 경로에 대한 통찰력을 지속적으로 제공한다32. Ras, Myc 및 돌연변이 된 p53과 같은 잘 알려진 종양 유전자의 역할에 대한 연구는 단층 배양을 모델 시스템33,34,35,36<sup class="xref...

암의 진행을 연구하기 위해 수많은 모델을 사용할 수 있으며, 각 모델은 고유하며이 복잡한 질병의 하위 유형을 나타냅니다. 각 모델은 암 생물학에 대한 독특하고 가치 있는 통찰력을 제공하며 실제 질병 상태를 모방하는 수단을 개선했습니다. 단일층으로 성장한 확립된 세포주는 증식, 침습성, 이동 및 세포자멸사와 같은 시험관 내 중요한 과정에 대한 귀중한 통찰력을제공했습니다1. 2차원(2D) 세포 배양이 여러 환경 섭동에 대한 포유류 세포의 반응을 조사하는 전통적인 도구였지만 조직 수준 반응을 예측하기 위한 이러한 발견의 외삽은 충분히 설득력이 없어 보입니다. 2D 배양의 주요 한계는 생성 된 미세 환경이 유방 조직 자체의 미세 환경과 크게 다르다는 것입니다2. 2D 배양은 세포와 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하며, 이는 모든 조직의 성장에 필수적입니다. 또한 단층 배양에서 세포가 경험하는 인장력은 이러한 세포의 극성을 방해하여 세포 신호 전달 및 거동 3,4,5를 변경합니다. 3차원(3D) 배양 시스템은 체외 조건을 모방할 수 있는 능력으로 암 연구 분야의 새로운 길을 열었습니다. 2D 세포 배양에서 손실되는 많은 중요한 미세환경 신호는 라미닌이 풍부한 세포외 기질(lrECM)의 3D 배양을 사용하여 재설정할 수 있습니다6.
다양한 연구에서 발암 7,8에서 종양 미세 환경의 중요성이 확인되었습니다. 염증 관련 요인은 미세 환경의 주요 부분입니다. 혈소판 활성화 인자 (PAF)는 다중 면역 반응 9,10을 매개하는 다양한 면역 세포에 의해 분비되는 인지질 매개체입니다. 높은 수준의 PAF는 상이한 유방암 세포주에 의해 분비되며 향상된 증식과 관련이 있습니다11. 우리 연구실의 연구에 따르면 아시나 배양에서 PAF가 장기간 존재하면 유방 상피 세포가 변형되는 것으로 나타났습니다12. PAF는 PAF 수용체 (PAFR)를 활성화시켜 PI3K / Akt 신호 전달 축13을 활성화시킵니다. PAFR은 또한 EMT, 침습 및 전이14와 관련이있는 것으로보고되었습니다.
본 프로토콜은 Chakravarty et al.12에 의해 이전에 기술된 바와 같이, 유방 상피 세포의 3D 배양을 사용하여 PAF-유도된 형질전환을 연구하기 위한 모델 시스템을 입증한다. 세포외 기질(3D 배양)에서 성장한 유방 상피 세포는 편광된 성장 정지 스페로이드를 형성하는 경향이 있습니다. 이들은 acini라고 불리며 생체내 15에서 유선의 가장 작은 기능 단위 인 유방 조직의 acini와 매우 유사합니다. 이러한 스페로이드(그림 1A,B)는 속이 빈 내강을 둘러싸고 기저막에 부착된 밀접하게 채워진 편광 상피 세포의 단층으로 구성됩니다(그림 1C). 이러한 형태 형성 과정은 문헌16에 잘 설명되어 있습니다. lrECM에 파종하면 세포가 분열과 분화를 거쳐 세포 클러스터를 형성한 다음 4일째부터 분극화됩니다. 8일차까지 acini는 세포외 기질과 직접 접촉하는 편광 세포 그룹과 기질에 접촉하지 않고 외부 편광 세포 내에 둘러싸인 분극되지 않은 세포 클러스터로 구성됩니다. 이러한 분극되지 않은 세포는 배양 12일째까지 세포사멸을 거쳐 속이 빈 내강을 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 16 일째까지, 성장 정지 구조가 형성됩니다16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> 그림 1: 핵 염색으로 염색된 acini의 세포핵 . (A) acini의 3D 구성. (B) 20일 동안 마트리겔에서 성장한 MCF10A 아시니의 위상차 이미지. (C) 가장 중앙 부분은 중공 루멘의 존재를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2D 배양과 달리 acinar 배양은 명백한 형태 변화를 통해 정상 세포와 형질전환 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다. 형질전환되지 않은 유방 상피 세포는 속이 빈 내강을 가진 acini를 형성하여 정상적인 인간 유방 acini를 모방합니다. 이러한 스페로이드는 변형시 다양한 유전자의 조절 완화로 인해 유도 될 수있는 극성의 주요 손실 (암의 특징 중 하나), 내강의 부재 또는 중공 내강의 파괴 (세포 사멸의 회피로 인한)를 특징으로하는 분열 된 형태를 보여줍니다17,18,19,20 . 이러한 형질전환은 면역형광법과 같이 일반적으로 사용되는 기술을 사용하여 연구할 수 있습니다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 유방 무시나르 형태형성 및 유방 발암 과정을 조사하는 간단한 방법으로 기능할 수 있다. 인지질 매개체인 PAF의 효과를 이해하기 위한 3D 배양 시스템을 구축하면 고처리량 전임상 약물 스크리닝에 도움이 됩니다.
이 연구는 PAF 22에 의해 유도 된 형질 전환을 연구하기 위해 3D '상단'배양 프로토콜16,21을 채택했습니다. 인지질 매개체에 대한 acini의 노출에 의해 유도 된 표현형 변화는 면역 형광법을 사용하여 연구되었다. 다양한 극성 및 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT) 마커12,16이 연구에 사용되었습니다. 표 1은 이들의 정상적인 국소화와 형질전환 시 예상되는 표현형을 언급한다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>항 체</td>
			<td>표시</td>
			<td>일반 현지화</td>
			<td>형질 전환 된 표현형</td>
		</tr><tr><td>α6-인테그린</td>
			<td>기저측</td>
			<td>약한 측면 얼룩이있는 기초</td>
			<td>강한 측면 / 정점 얼룩</td>
		</tr><tr><td>β-카테닌</td>
			<td>세포-세포 접합</td>
			<td>기저측</td>
			<td>비정상/핵 또는 세포질 국소화</td>
		</tr><tr><td>비 멘틴</td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>부재 / 약한 존재</td>
			<td>상향 규제</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 연구에 사용된 마커. PAF 치료의 유무에 따라 국소화와 함께 사용되는 다른 마커.
이 방법은 다양한 유방암 아형에 대한 그럴듯한 약물 및 표적 유전자를 연구/스크리닝하는 데 가장 잘 활용될 수 있습니다. 이는 생체 내 시나리오에 더 가까운 약물 반응 데이터를 제공하여 더 빠르고 신뢰할 수 있는 약물 개발을 지원할 수 있습니다. 또한이 시스템은 약물 반응 및 약물 내성과 관련된 분자 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

설치류 모델 및 확립 된 세포주와 같은 암을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 발암에 대한 귀중한 통찰력은 이러한 모델을 사용한 연구에 의해 제공되었습니다. 세포주는 유방 종양 발생과 관련된 분자 신호 전달의 조절 완화에 대한 이해를 제공하는 반면, 설치류 모델은 생체 내에서 유방암의 세포 및 분자 특성을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 유방 상피 및 암세포의 3D 배양의 확립은 in vivo 조건을 모방하여 in vivo 모델과 in vitro 모델 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 이 모델은 복잡한 분자 신호 전달 이벤트의 조절 완화와 유방 발암 중 세포 특성을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 인지질 매개체-유도(혈소판 활성화 인자, PAF) 형질전환을 연구하기 위해 3D 배양 시스템을 변형한다. 면역 조절제 및 기타 분비 된 분자는 유방에서 종양 시작 및 진행에 중요한 역할을합니다. 본 연구에서, PAF에 노출된 유방 상피 세포의 3D acinar 배양물은 극성 손실 및 변경된 세포 특성과 같은 형질전환 특성을 나타내었다. 이 3D 배양 시스템은 종양 미세 환경에서 다양한 소분자 개체에 의해 유도된 유전적 및/또는 후성유전학적 섭동을 밝히는 데 도움이 됩니다. 또한, 이 시스템은 또한 형질전환 과정에 관여할 수 있는 신규한 유전자뿐만 아니라 알려진 유전자의 식별을 위한 플랫폼을 제공할 것이다.

MCF10A 세포는 PAF 치료에 노출되면 매우 뚜렷한 표현형을 가진 아시나 구조를 형성합니다. α6-인테그린은 더 많은 정점 염색으로 잘못 국소화된 것으로 밝혀졌습니다. 몇몇 acini는 또한 불연속 염색을 나타내었다 (도 2A). 이 두 표현형은 문헌24,25에서 입증 된 바와 같이 기저 극성의 상실을 나타냅니다. 이전 보고서는 암 전이에서 α6-...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.

인지질 매개체는 3차원 배양에서 형질전환을 유도했습니다.

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

자사의 변형된 3D 분석 배양은 암 미세 환경에서 다양한 구성 요소의 역할을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 이는 새로운 바이오마커 및 약물 표적의 식별로 이어집니다. 이 방법을 사용하면 면역 체계와 매우 유사한 세포 표현형 및 분자 신호 전달의 변화를 연구 할 수 있습니다. 또한 연구의 특정 요구 사항을 충족하도록 수정할 수도 있습니다.이 방법은 유방암의 조기 발견을 도울 수있는 새로운 바이오 마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 분자 통찰력을 활용하여 새로운 약물 표적을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 또는 유전자가 수행하는 역할에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 유전자 또는 유전자의 섭동 후 종양 형성 및 형태 형성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면 배지를 흡인하고 2 밀리리터의 PBS로 세척하여 세포를 트립신 화하십시오. 900 마이크로 리터의 0.05 % 트립신 -EDTA를 추가하고 섭씨 37도에서 약 15 분 동안 또는 세포가 완전히 트립신 화 될 때까지 배양합니다. 각 웰을 60 마이크로리터의 lrECM으로 코팅하여 챔버 커버 유리 슬라이드의 8개 웰에 lrECM 베드를 준비한다.섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 최대 15분 동안 두십시오. 세포 현탁액을 준비하려면 5ml의 재 현탁 배지를 추가하여 트립신 활성을 소멸시키고 섭씨 25도에서 10 분 동안 112 회 g으로 세포를 회전시킵니다. 사용한 배지를 흡인하고 2 밀리리터의 분석 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.단일 세포 현탁액의 형성을 보장하기 위해 현탁액을 잘 혼합하십시오. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 각 웰에 6, 000 개의 세포를 파종하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하십시오. 필요한 웰의 수에 따라, 세포 현탁액을 오버레이 배지에서 희석한다.준비된 lrECM 베드에 400마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 추가하여 lrECM 베드를 방해하지 않도록 조심스럽게 확인합니다. 가습 된 37 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 5도에서 배양하십시오. 3시간 후, 200 나노몰의 PAF를 각각의 웰에 첨가한다.모든 배지 교체 중에 동일한 농도의 PAF를 추가하고 4일마다 새로운 배지로 세포를 보충합니다. 배양 20일 후, 각 웰에서 배지를 조심스럽게 피펫팅하고 400마이크로리터의 예열된 PBS로 웰을 세척합니다. 새로 준비된 4 % 파라 포름 알데히드 400 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양하여 acinar 구조를 고정하십시오.얼음처럼 차가운 PBS로 웰을 한 번 헹구고 섭씨 4도에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100을 함유 한 PBS로 투과시킵니다. 10분 후 Triton X-100 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 새로 준비한 PBS 글리신 400마이크로리터로 헹굽니다. 면역 형광 완충액에 10 % 염소 혈청을 포함하는 400 마이크로 리터의 1 차 차단 용액을 추가하고 실온에서 60 분 동안 배양합니다.1차 블로킹 용액을 제거하고 1차 블로킹 용액에서 준비한 2% 2차 블로킹 항체 200마이크로리터를 넣고 실온에서 45-60분 동안 방치합니다. 1차 항체를 1:100 희석액의 2%2차 차단 항체 용액에 준비합니다. 2차 블로킹 용액을 제거하고 새로 준비한 항체를 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.1차 항체 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 400마이크로리터의 면역형광 완충액으로 세 번 세척합니다. 다음으로, 형광단이 접합된 2차 항체를 1차 블로킹 용액에 1:200으로 희석하여 준비하고, 슬라이드를 2차 항체 용액에서 실온에서 40 내지 60분 동안 배양한다. 슬라이드를 400 마이크로리터의 면역형광 완충액으로 20분 동안 헹구고, 이어서 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한다.핵 염색 밀리리터당 0.5 나노그램을 함유하는 PBS로 핵을 실온에서 5 내지 6분 동안 대조염색한다. 슬라이드를 400마이크로리터의 PBS로 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다. 전체 PBS를 조심스럽게 피펫팅하고 잔류 용액을 제거하십시오.그런 다음 각 웰에 장착 시약 한 방울을 넣고 실온에서 밤새 방치합니다. 마지막으로 컨포칼 현미경에서 40x 또는 63x 배율로 슬라이드를 이미지화하여 0.6mm 스텝 크기의 광학 Z 섹션을 촬영합니다. 이미지는 핵 염색으로 염색 된 acini의 세포핵을 나타냅니다.acini의 3D 구성과 20일 동안 lrECM에서 성장한 MCF10A acini의 위상차 이미지가 여기에 표시됩니다. 가장 중앙 섹션은 중공 루멘의 존재를 보여줍니다. PAF는 극성을 방해하고 MCF10A 유방 아시니에서 EMT와 유사한 변화를 유도합니다.MCF10A 세포는 lrECM에서 탑배양물 상에서 3D로서 성장시켰다. 배양물을 0, 4, 8, 12, 및 16일에 PAF로 처리하였다. 배양물을 20일 동안 유지한 다음, 알파6-인테그린 및 핵 염색, 정점 극성에 대한 마커인 GM130 및 EMT 마커인 비멘틴에 대해 면역염색하였다.각 acini의 가장 중앙 스택이 여기에 표시되었습니다. 대표적인 데이터는 생물학적으로 독립적 인 3 가지 실험에서 40-50 acini에 대한 것입니다. lrECM 베드는 기포 없이 고르게 퍼지도록 조심스럽게 만들어야 합니다.또한 세포 현탁액을 고르게 혼합하고 응집을 피하기 위해 천천히 첨가해야 합니다. 3D 배양에서 단백질과 RNA를 얻은 다음 다양한 분자 경로를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

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