Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

Agradecemos ao IISER Pune Microscopy Facility pelo acesso a equipamentos e infraestrutura e suporte para os experimentos. Este estudo foi apoiado por uma bolsa do Departamento de Biotecnologia (DBT), Govt. da Índia (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB), Govt. of India (EMR/2016/001974) e em parte pelo IISER, fundo Pune Core. A. K. foi financiada pela bolsa CSIR-SRF, L.A. foi financiada através de bolsa DST-INSPIRE, V.C foi financiada pela DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

1. Semeando células MCF10A em lrECM
<ol><li>Manter as células MCF10A (células epiteliais mamárias aderentes) no meio de crescimento. Passagem pelas celas a cada 4 dias. NOTA: Composição do meio de crescimento: DMEM de alta glicose sem piruvato de sódio contendo soro de cavalo (5%), insulina (10 μg/mL), hidrocortisona (0,5 μg/mL), fator de crescimento epidérmico, EGF (20 ng/mL), de toxina de cólera (100 ng/mL) e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL) (ver Tabela de Materiais</...

Modelos baseados em linhas celulares estabelecidos são amplamente utilizados para estudar o processo de carcinogênese. As culturas monocamadas das células continuam a fornecer insights sobre as várias vias de sinalização molecular que mediam mudanças características nas célulascancerosas 32. Estudos sobre o papel de oncogenes conhecidos como Ras, Myc e p53 mutado foram relatados pela primeira vez usando culturas monocamadas como o sistema modelo 33,34,35,36.</...

Uma miríade de modelos estão disponíveis para estudar a progressão do câncer, sendo cada um deles único e representando um subtipo dessa doença complexa. Cada modelo fornece insights únicos e valiosos sobre a biologia do câncer e melhorou os meios para imitar a condição real da doença. Linhas celulares estabelecidas cultivadas como monocamadas forneceram insights valiosos sobre processos vitais in vitro, como proliferação, invasividade, migração e apoptose1. Embora a cultura celular bidimensional (2D) tenha sido a ferramenta tradicional para investigar a resposta das células mamíferas a várias perturbações ambientais, a extrapolação desses achados para prever respostas em nível tecidual não parece suficientemente convincente. A maior limitação das culturas 2D é que o microambiente criado difere em grande parte do do próprio tecido mamário2. A cultura 2D carece da interação das células com a matriz extracelular, que é vital para o crescimento de qualquer tecido. Além disso, as forças de tração experimentadas pela célula nas culturas de monocamadas dificultam a polaridade dessas células, alterando assim a sinalização celular e o comportamento 3,4,5. Sistemas de cultura tridimensionais (3D) abriram uma nova avenida no campo da pesquisa sobre câncer com sua capacidade de imitar as condições in vivo in vitro. Muitas pistas microambientais cruciais que são perdidas na cultura celular 2D poderiam ser restabelecidas usando culturas 3D de matriz extracelular rica em laminino (lrECM)6.
Vários estudos identificaram a importância do microambiente tumoral na carcinogênese 7,8. Fatores associados à inflamação são uma parte importante do microambiente. O Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) é um mediador fosfolipídide secretado por várias células imunes que media múltiplas respostas imunes 9,10. Altos níveis de PAF são secretados por diferentes linhas de células cancerígenas de mama e estão associados à maior proliferação11. Estudos do nosso laboratório mostraram que a presença prolongada de PAF em culturas acinar leva à transformação das células epiteliaismamárias 12. O PAF ativa o receptor PAF (PAFR), ativando o eixo de sinalização PI3K/Akt13. O PAFR também está associado ao EMT, invasão e metástase14.
O presente protocolo demonstra um sistema modelo para estudar a transformação induzida pelo PAF, utilizando culturas 3D de células epiteliais mamárias, como foi descrito anteriormente por Chakravarty et al.12. As células epiteliais mamárias cultivadas na matriz extracelular (culturas 3D) tendem a formar esferoides polarizados presos pelo crescimento. Estes são chamados de acini e se assemelham muito ao acini do tecido mamário, a menor unidade funcional da glândula mamária, in vivo15. Estes esferoides (Figura 1A,B) consistem em uma monocamada de células epiteliais polarizadas estreitamente embaladas em torno de um lúmen oco e anexadas à membrana do porão (Figura 1C). Este processo de morfogênese foi bem descrito na literatura16. Quando semeadas no LrECM, as células passam por divisão e diferenciação para formar um aglomerado de células, que então polarizam a partir do dia 4. Até o dia 8, o acini consiste em um grupo de células polarizadas que estão em contato direto com a matriz extracelular e um aglomerado de células não polarizadas dentro das células externas polarizadas, sem contato com a matriz. Essas células não polidas são conhecidas por serem submetidas à apoptose até o dia 12 da cultura, formando um lúmen oco. Até o dia 16, as estruturas presas pelo crescimento são formadasem 16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> Figura 1: Núcleos de células em acini manchadas com uma mancha nuclear. (A) construção 3D do acini. (B) Imagem de contraste de fase do acini MCF10A cultivada em Matrigel por 20 dias. (C) A seção mais central mostra a presença de um lúmen oco. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ao contrário das culturas 2D, as culturas acinar ajudam a distinguir células normais e transformadas através de mudanças aparentes de morfologia. Células epiteliais de mama não transformadas formam acini com um lúmen oco, imitando o acini mamário humano normal. Esses esferoides, após a transformação, mostram uma morfologia interrompida caracterizada por uma grande perda de polaridade (uma das marcas do câncer), ausência de lúmen, ou interrupção do lúmen oco (devido à evasão da apoptose) que pode ser induzida devido à desregulamentação de vários genes 17,18,19,20 . Essas transformações podem ser estudadas utilizando técnicas comumente utilizadas, como a imunofluorescência. Assim, o modelo de cultura celular 3D pode funcionar como um método simples para investigar o processo de morfogênese acinar mama e carcinogênese mamária. A criação de um sistema de cultura 3D para entender o efeito de um mediador fosfolipídico, PAF, ajudará na triagem de medicamentos pré-clínicos de alto rendimento.
Este trabalho adaptou o protocolo de cultura 3D 'no topo'16,21 para estudar a transformação induzida pelo PAF22. As alterações fenotípicas induzidas pela exposição do acini ao mediador fosfolipídico foram estudadas por meio da imunofluorescência. Vários marcadores de polaridade e epitelial para transição mesenquimal (EMT)foram utilizados no estudo. A Tabela 1 menciona sua localização normal e seu fenótipo esperado após a transformação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Anticorpos</td>
			<td>Marcas</td>
			<td>Localização normal</td>
			<td>Fenótipo transformado</td>
		</tr><tr><td>α6-Integrin</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Basal com mancha lateral fraca</td>
			<td>Mancha lateral forte / Apical</td>
		</tr><tr><td>β-Catenin</td>
			<td>Junção celular</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Localização anormal / nuclear ou citoplasmática</td>
		</tr><tr><td>Vimentina</td>
			<td>Emt</td>
			<td>Presença ausente/fraca</td>
			<td>Up-regulation</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Marcadores utilizados no estudo. Diferentes marcadores utilizados com sua localização na presença e ausência de tratamento paf.
Este método pode ser melhor utilizado para estudar/testar drogas plausíveis e genes-alvo para vários subtipos de câncer de mama. Isso pode fornecer um dado de resposta a medicamentos mais próximo do cenário in vivo , auxiliando no desenvolvimento mais rápido e confiável de medicamentos. Além disso, este sistema pode ser usado para estudar a sinalização molecular associada à resposta a drogas e resistência a drogas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

Vários modelos foram desenvolvidos para estudar o câncer, como modelos de roedores e linhas celulares estabelecidas. Insights valiosos sobre carcinogênese foram fornecidos por estudos que utilizam esses modelos. As linhas celulares têm proporcionado uma compreensão da desregulamentação da sinalização molecular associada à tumorigênese mamária, enquanto modelos de roedores são amplamente utilizados para estudar características celulares e moleculares do câncer de mama in vivo. O estabelecimento de culturas 3D de células epiteliais e cancerosas mamárias auxilia na ponte entre modelos in vivo e in vitro , imitando as condições in vivo in vitro. Este modelo pode ser usado para entender a desregulamentação de eventos complexos de sinalização molecular e as características celulares durante a carcinogênese mamária. Aqui, um sistema de cultura 3D é modificado para estudar uma transformação induzida por mediadores fosfolipídides (Fator de Ativação de Plaquetas, PAF). Os imunomoduladores e outras moléculas secretadas desempenham um papel importante na iniciação e progressão do tumor na mama. No presente estudo, culturas acinadoras 3D de células epiteliais mamárias são expostas a características de transformação expostas ao PAF, como perda de polaridade e características celulares alteradas. Este sistema de cultura 3D ajudará a lançar luz sobre perturbações genéticas e/ou epigenéticas induzidas por várias pequenas entidades de moléculas no microambiente tumoral. Além disso, este sistema também fornecerá uma plataforma para a identificação de novos, bem como genes conhecidos que podem estar envolvidos no processo de transformação.

As células MCF10A, após a exposição ao tratamento de PAF, formam estruturas acinar com fenótipos muito distintos. α6-integrin foi encontrado como deslocalizado com manchas mais apical. Alguns acini também mostraram manchas descontínuas (Figura 2A). Ambos os fenótipos indicam a perda da polaridade basal, evidenciada pela literatura24,25. Relatórios anteriores indicam o controverso papel do α6-integrin na metástase do cânc...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

O presente protocolo descreve a criação de culturas 3D 'no topo' de uma linha celular epitelial de mama não transformada, MCF10A, que foi modificada para estudar a transformação induzida pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF). A imuno-fluorescência tem sido usada para avaliar a transformação e é discutida em detalhes.

Mediadora fosfolipídida induzida transformação em culturas tridimensionais

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Nossas culturas modificadas de ensaio 3D podem ser usadas para investigar o papel de vários componentes em um microambiente de câncer, levando à identificação de novos biomarcadores e alvos de drogas. Este método permite estudar mudanças no fenótipo celular e sinalização molecular que se assemelham muito ao sistema imunológico. Também pode ser modificado para atender a requisitos específicos de um estudo.Este método pode ajudar a identificar novos biomarcadores que podem ajudar na detecção precoce do câncer de mama. Além disso, insights moleculares podem ser utilizados para identificar novos alvos de drogas. Este método pode ser usado para estudar tanto a tumorigênese quanto a morfogênese após perturbação de genes ou genes que podem fornecer insights sobre o papel desempenhado pelo gene ou genes.Para começar, tentepsinizar as células aspirando o meio e lavando com 2 mililitros de PBS. Adicione 900 microliters de 0,05% Trypsin-EDTA e incubar a 37 graus Celsius por cerca de 15 minutos ou até que as células sejam completamente experimentadas. Prepare uma cama de lrECM em oito poços de um escorregador de vidro de cobertura de câmara, revestindo cada poço com 60 microliters de lrECM.Coloque-o em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus por um máximo de 15 minutos. Para preparar a suspensão da célula, adicione 5 mililitros de meio de suspensão para saciar a atividade de trippsina e gire as células a 112 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius. Aspire o meio gasto e suspenda as células em 2 mililitros de meio de ensaio.Misture bem a suspensão para garantir a formação de uma única suspensão celular. Conte as células usando um hemótmetro e calcule o volume de suspensão celular necessária para semear 6.000 células em cada poço. De acordo com o número de poços necessários, diluir a suspensão celular no meio de sobreposição.Adicione 400 microliters da suspensão celular diluída aos leitos LrECM preparados, garantindo cuidadosamente não perturbar a cama lrECM. Incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada de 5%. Depois de 3 horas, adicione 200 nanomoles de PAF a cada poço.Adicione a mesma concentração de PAF durante cada mudança de mídia, e reponha as células com meio fresco a cada 4 dias. Após 20 dias de cultivo, cuidadosamente pipeta o meio de cada poço e lave os poços com 400 microliters de PBS pré-aquecido. Fixar as estruturas acinar adicionando 400 microlitadores de 4% de paraformaldeído recém-preparado e incubando por 20 minutos à temperatura ambiente.Enxágüe os poços uma vez com PBS gelado e permeabilize com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 10 minutos a 4 graus Celsius. Após 10 minutos, pipete a solução Triton X-100 cuidadosamente e enxágue com 400 microliters de glicina PBS recém-preparada. Adicione 400 microliters da solução de bloqueio primário que compreende 10% soro de cabra no tampão de imunofluorescência e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos.Remova a solução de bloqueio primário, adicione 200 microlitadores de anticorpo de bloqueio secundário de 2% preparado na solução de bloqueio primário e deixe-o em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos. Prepare o anticorpo primário em solução de anticorpos de bloqueio secundário de 2% em uma diluição de 1:100. Remova a solução de bloqueio secundário, adicione o anticorpo recém-preparado e incuba durante a noite a 4 graus Celsius.Pipete cuidadosamente a solução de anticorpos primários e lave-a três vezes com 400 microlitres de tampão de imunofluorescência. Em seguida, prepare uma diluição de 1:200 do anticorpo secundário conjugado por fluorohore na solução de bloqueio primário e incubar os slides na solução de anticorpos secundários por 40 a 60 minutos à temperatura ambiente. Enxágüe os slides com 400 microliters de tampão de imunofluorescência por 20 minutos, seguido por duas lavagens com PBS por 10 minutos cada.Contra-colori a contrapernadeira dos núcleos com PBS contendo 0,5 nanogramas por mililitro de mancha nuclear por 5 a 6 minutos em temperatura ambiente. Lave os slides três vezes com 400 microliters de PBS para remover o excesso de mancha. Pipeta cuidadosamente toda a PBS e garanta a remoção da solução residual.Em seguida, adicione uma gota de reagente de montagem em cada poço e deixe-o ficar em temperatura ambiente durante a noite. Finalmente, imagem os slides sob ampliação de 40x ou 63x em um microscópio confocal, tomando seções ópticas Z de tamanho de passo de 0,6 milímetros. As imagens representam os núcleos de células em acini manchadas com uma mancha nuclear.A construção 3D do acini e a imagem de contraste de fase do MCF10A acini cultivada na LrECM por 20 dias são mostradas aqui. A seção mais central mostra a presença de um lúmen oco. O PAF interrompe a polaridade e induz alterações semelhantes ao EMT no acini mamário MCF10A.As células MCF10A foram cultivadas como 3D nas culturas superiores no IrECM. As culturas foram tratadas com PAF nos dias 0, 4, 8, 12 e 16. As culturas foram mantidas por 20 dias e, em seguida, imunossuídas para alfa6-integrin e mancha nuclear, GM130, um marcador para polaridade apical, e Vimentin, um marcador DET.A pilha mais central do respectivo acini foi mostrada aqui. Os dados representativos são de 40-50 acini de três experimentos biologicamente independentes. A cama LrECM precisa ser feita com cuidado para que seja uniformemente espalhada sem bolhas de ar.Além disso, a suspensão da célula deve ser misturada uniformemente e adicionada lentamente para evitar a aglomeração. Pode-se obter proteína e RNA das culturas 3D que podem então ser usadas para investigar as diferentes vias moleculares.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

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Pesquisa do câncer

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