Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

Мы благодарим Центр микроскопии IISER в Пуне за доступ к оборудованию и инфраструктуре и поддержку экспериментов. Это исследование было поддержано грантом Департамента биотехнологии (DBT), правительства Индии (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB), правительства Индии (EMR/2016/001974) и частично финансированием IISER, Pune Core. A.K. финансировался стипендией CSIR-SRF, L.A. финансировался через стипендию DST-INSPIRE, V.C финансировался DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

1. Посев клеток MCF10A в lrECM
<ol><li>Поддерживать клетки MCF10A (адгезивные эпителиальные клетки молочной железы) в питательной среде. Проходите клетки каждые 4 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: Состав питательной среды: высокая глюкоза DMEM без пирувата натрия, содержащая конскую сыворотку (5%), инсулин (10...

Установленные модели на основе клеточных линий широко используются для изучения процесса канцерогенеза. Однослойные культуры клеток продолжают давать представление о различных молекулярных сигнальных путях, которые опосредуют характерные изменения в раковых клетках32....

Для изучения прогрессирования рака доступно множество моделей, каждая из которых уникальна и представляет собой подтип этого сложного заболевания. Каждая модель предоставляет уникальную и ценную информацию о биологии рака и улучшает средства для имитации фактического состояния заболевания. Установленные клеточные линии, выращенные как монослой, предоставили ценную информацию о жизненно важных процессах in vitro, таких как пролиферация, инвазивность, миграция и апоптоз1. Хотя двумерная (2D) клеточная культура была традиционным инструментом для исследования реакции клеток млекопитающих на несколько возмущений окружающей среды, экстраполяция этих результатов для прогнозирования реакций на тканевом уровне не кажется достаточно убедительной. Основным ограничением 2D-культур является то, что создаваемая микросреда в значительной степени отличается от микросреды самой ткани молочной железы2. 2D культуре не хватает взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, что жизненно важно для роста любой ткани. Кроме того, силы растяжения, испытываемые клеткой в монослойных культурах, препятствуют полярности этих клеток, тем самым изменяя передачу сигналов и поведение клеток 3,4,5. Трехмерные (3D) системы культур открыли новый путь в области исследований рака с их способностью имитировать условия in vivo in vitro. Многие важные микроокружательные сигналы, которые теряются в 2D-культуре клеток, могут быть восстановлены с использованием 3D-культур богатого ламинином внеклеточного матрикса (lrECM)6.
Различные исследования выявили значение микроокружения опухоли в канцерогенезе 7,8. Факторы, связанные с воспалением, являются основной частью микросреды. Активирующий фактор тромбоцитов (PAF) является фосфолипидным медиатором, секретируемым различными иммунными клетками, который опосредует множественные иммунные реакции 9,10. Высокие уровни PAF секретируются различными клеточными линиями рака молочной железы и связаны с усиленной пролиферацией11. Исследования из нашей лаборатории показали, что длительное присутствие PAF в ацинарных культурах приводит к трансформации эпителиальных клеток молочной железы12. PAF активирует PAF-рецептор (PAFR), активируя сигнальную ось13 PI3K/Akt. Также сообщается, что PAFR связан с EMT, инвазией и метастазированием14.
Настоящий протокол демонстрирует модельную систему для изучения PAF-индуцированной трансформации с использованием 3D-культур эпителиальных клеток молочной железы, как было ранее описано Chakravarty et al.12. Эпителиальные клетки молочной железы, выращенные на внеклеточном матриксе (3D-культуры), имеют тенденцию образовывать поляризованные сфероиды, остановленные ростом. Они называются ацинами и очень напоминают ацины ткани молочной железы, наименьшую функциональную единицу молочной железы, in vivo15. Эти сфероиды (фиг.1А,В) состоят из монослоя плотно упакованных поляризованных эпителиальных клеток, окружающих полый просвет и прикрепленных к базальной мембране (фиг.1С). Этот процесс морфогенеза хорошо описан в литературе16. При посеве на lrECM клетки подвергаются делению и дифференцировке, образуя кластер клеток, которые затем поляризуются с 4-го дня. К 8-му дню ацины состоят из группы поляризованных клеток, которые находятся в прямом контакте с внеклеточным матриксом и скопления неполяризованных клеток, заключенных во внешние поляризованные клетки, без контакта с матрицей. Известно, что эти неполяризованные клетки подвергаются апоптозу на 12-й день культуры, образуя полый просвет. К 16-му дню формируется16 структур, остановленных ростом.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> Рисунок 1: Ядра клеток в ацини, окрашенные ядерным пятном. (А) 3D конструкция ацини. (B) Фазоконтрастное изображение ацини MCF10A, выращенное на Matrigel в течение 20 дней. (C) Самая центральная секция показывает наличие полого просвета. Шкала = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
В отличие от 2D-культур, ацинарные культуры помогают различать нормальные и трансформированные клетки через очевидные изменения морфологии. Нетрансформированные эпителиальные клетки молочной железы образуют ацинус с полым просветом, имитируя нормальные ацины молочной железы человека. Эти сфероиды при трансформации показывают нарушенную морфологию, характеризующуюся значительной потерей полярности (одним из признаков рака), отсутствием просвета или нарушением полого просвета (из-за уклонения от апоптоза), что может быть вызвано дерегуляцией различных генов 17,18,19,20 . Эти превращения могут быть изучены с использованием широко используемых методов, таких как иммунофлуоресценция. Таким образом, модель 3D-культуры клеток может функционировать как простой метод исследования процесса ацинарного морфогенеза молочной железы и канцерогенеза молочной железы. Создание системы 3D-культур для понимания эффекта медиатора фосфолипидов, PAF, поможет в высокопроизводительном доклиническом скрининге лекарств.
Эта работа адаптировала протокол 3D «на вершине» культуры 16,21 для изучения трансформации, вызванной PAF22. Фенотипические изменения, вызванные воздействием ацинумов на медиатор фосфолипидов, изучали с использованием иммунофлуоресценции. В исследовании использовались различные маркеры полярности и эпителиального перехода в мезенхимальный переход (ЭМТ) 12,16. В таблице 1 упоминается их нормальная локализация и ожидаемый фенотип при трансформации.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Антитела</td>
			<td>Знаки</td>
			<td>Нормальная локализация</td>
			<td>Трансформированный фенотип</td>
		</tr><tr><td>α6-Интегрин</td>
			<td>Базолатераль</td>
			<td>Базальный со слабым боковым пятном</td>
			<td>Сильное боковое / апикальное пятно</td>
		</tr><tr><td>β-Катенин</td>
			<td>Клеточно-клеточный переход</td>
			<td>Базолатераль</td>
			<td>Аномальная / ядерная или цитоплазматическая локализация</td>
		</tr><tr><td>Виментин</td>
			<td>ЭМТ</td>
			<td>Отсутствующее/слабое присутствие</td>
			<td>Ап-регулирование</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Маркеры, использованные в исследовании. Используются различные маркеры с их локализацией при наличии и отсутствии лечения ПАФ.
Этот метод может быть наилучшим образом использован для изучения / скрининга правдоподобных лекарств и генов-мишеней для различных подтипов рака молочной железы. Это может обеспечить данные о реакции на лекарства ближе к сценарию in vivo , помогая в более быстрой и надежной разработке лекарств. Также эта система может быть использована для изучения молекулярной сигнализации, связанной с лекарственной реакцией и лекарственной устойчивостью.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

Для изучения рака было разработано несколько моделей, таких как модели грызунов и установленные клеточные линии. Ценная информация о канцерогенезе была получена в результате исследований с использованием этих моделей. Клеточные линии обеспечили понимание дерегуляции молекулярной сигнализации, связанной с опухолевым генезом молочной железы, в то время как модели грызунов широко используются для изучения клеточных и молекулярных характеристик рака молочной железы in vivo. Создание 3D-культур эпителиальных и раковых клеток молочной железы помогает преодолеть разрыв между моделями in vivo и in vitro , имитируя условия in vivo in vitro. Эта модель может быть использована для понимания дерегуляции сложных молекулярных сигнальных событий и клеточных характеристик во время канцерогенеза молочной железы. Здесь система 3D-культур модифицируется для изучения фосфолипидной медиатор-индуцированной (активирующий фактор тромбоцитов, PAF) трансформации. Иммуномодуляторы и другие секретируемые молекулы играют важную роль в инициации и прогрессировании опухоли в молочной железе. В настоящем исследовании 3D-ацинарные культуры эпителиальных клеток молочной железы подвергаются воздействию проявленных характеристик трансформации PAF, таких как потеря полярности и измененные клеточные характеристики. Эта система 3D-культур поможет пролить свет на генетические и / или эпигенетические возмущения, вызванные различными мелкомолекулярными образованиями в микроокружении опухоли. Кроме того, эта система также обеспечит платформу для идентификации новых, а также известных генов, которые могут быть вовлечены в процесс трансформации.

Клетки MCF10A при воздействии лечения PAF образуют ацинарные структуры с очень отчетливыми фенотипами. Было обнаружено, что α6-интегрин неправильно локализован с более апикальным окрашиванием. Некоторые ацины также показали прерывистое окрашивание (рисунок 2А). Оба этих фе?...

Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Настоящий протокол описывает создание 3D-культур «сверху» нетрансформированной эпителиальной клеточной линии молочной железы MCF10A, которая была модифицирована для изучения трансформации, вызванной активирующим фактором тромбоцитов (PAF). Иммунофлуоресценция была использована для оценки трансформации и подробно обсуждается.

Фосфолипидный медиатор индуцированная трансформация в трехмерных культурах

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Наши модифицированные 3D-культуры анализа могут быть использованы для исследования роли различных компонентов в микроокружении рака, что приводит к идентификации новых биомаркеров и мишеней лекарств. Этот метод позволяет изучать изменения в клеточном фенотипе и молекулярной сигнализации, которые очень похожи на иммунную систему. Он также может быть изменен в соответствии с конкретными требованиями исследования.Этот метод может помочь идентифицировать новые биомаркеры, которые могут помочь в раннем выявлении рака молочной железы. Кроме того, молекулярные идеи могут быть использованы для выявления новых мишеней лекарств. Этот метод может быть использован для изучения как опухолевого, так и морфогенеза после возмущения гена или генов, которые могут дать представление о роли, которую играет ген или гены.Для начала попробуйте клетки, аспирируя среду и промывая 2 миллилитрами PBS. Добавьте 900 микролитров 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение примерно 15 минут или до тех пор, пока клетки не будут полностью трипсинизированы. Подготовьте слой lrECM в восьми скважинах камерного покровного стекла, покрыв каждую скважину 60 микролитрами lrECM.Поместите его в инкубатор углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия максимум на 15 минут. Чтобы приготовить клеточную суспензию, добавьте 5 миллилитров среды повторной суспензии, чтобы погасить активность трипсина и раскрутить клетки в 112 раз в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. Аспирируйте отработанную среду и повторно подвешивайте клетки в 2 миллилитрах пробирной среды.Хорошо перемешайте суспензию, чтобы обеспечить образование одноклеточной суспензии. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для посева 6000 клеток в каждую лунку. В зависимости от количества необходимых лунок разбавляют клеточную суспензию в накладной среде.Добавьте 400 микролитров разбавленной клеточной суспензии к подготовленным слоям lrECM, тщательно следя за тем, чтобы не нарушить слой lrECM. Инкубировать при температуре 37 градусов цельсия в увлажненном 5% инкубаторе углекислого газа. Через 3 часа добавьте 200 наномолей PAF в каждую лунку.Добавляйте одинаковую концентрацию PAF во время каждого изменения среды и пополняйте клетки свежей средой каждые 4 дня. После 20 дней культивирования тщательно вытрите среду из каждой скважины и промыте скважины 400 микролитрами предварительно нагретого ПБС. Зафиксируйте ацинарные структуры, добавив 400 микролитров свежеприготовленного 4%-ного параформальдегида и инкубируя в течение 20 мин при комнатной температуре.Промыть лунки один раз ледяным PBS и пермеабилизировать PBS, содержащим 0,5% Triton X-100 в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Через 10 минут аккуратно вылейте раствор Triton X-100 и промойте 400 микролитрами свежеприготовленного глицина PBS. Добавьте 400 микролитров первичного блокирующего раствора, содержащего 10% козью сыворотку, в иммунофлуоресцентный буфер и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут.Удалить первичный блокирующий раствор, добавить 200 микролитров 2% вторичного блокирующего антитела, приготовленного в первичном блокирующем растворе, и оставить его при комнатной температуре на 45-60 минут. Готовят первичное антитело в 2%-ном растворе вторичного блокирующего антитела в разведении 1:100. Удалите вторичный блокирующий раствор, добавьте свежеприготовленное антитело и инкубируйте в течение ночи при 4 градусах Цельсия.Осторожно пипетку раствора первичного антитела и трижды промыть его 400 микролитрами иммунофлуоресцентного буфера. Затем готовят разведение флуорофорно-конъюгированного вторичного антитела в 1:200 в первичном блокирующем растворе и инкубируют слайды в растворе вторичного антитела в течение 40-60 минут при комнатной температуре. Промойте слайды 400 микролитрами иммунофлуоресцентного буфера в течение 20 минут, затем две промывки PBS в течение 10 минут каждая.Противопоставьте ядра PBS, содержащим 0,5 нанограмма на миллилитр ядерного пятна, в течение 5-6 минут при комнатной температуре. Трижды вымойте слайды 400 микролитрами PBS, чтобы удалить лишнее пятно. Аккуратно выложите всю PBS и обеспечьте удаление остаточного раствора.Затем добавьте по одной капле монтажного реагента в каждую лунку и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение ночи. Наконец, изобразите слайды под 40-кратным или 63-кратным увеличением на конфокальном микроскопе, взяв оптические Z-сечения размером шага 0,6 миллиметра. Изображения представляют собой ядра клеток в ацинусах, окрашенных ядерным пятном.3D-конструкция ацини и фазоконтрастное изображение MCF10A acini, выращенное на lrECM в течение 20 дней, показаны здесь. Самый центральный участок показывает наличие полого просвета. PAF нарушает полярность и индуцирует EMT-подобные изменения в MCF10A ацинусах молочной железы.Клетки MCF10A выращивали в виде 3D на верхних культурах в lrECM. Культуры обрабатывали PAF на 0, 4, 8, 12 и 16 день. Культуры поддерживали в течение 20 дней, а затем иммуноокрашивали для альфа6-интегрина и ядерного пятна, GM130, маркера апикальной полярности, и виментина, маркера EMT.Здесь показан самый центральный стек соответствующих ацин. Репрезентативные данные относятся к 40-50 ацини из трех биологически независимых экспериментов. Кровать lrECM должна быть сделана аккуратно, чтобы она равномерно распределялась без каких-либо пузырьков воздуха.Кроме того, клеточную суспензию следует смешивать равномерно и добавлять медленно, чтобы избежать слипания. Можно получить белок и РНК из 3D-культур, которые затем могут быть использованы для исследования различных молекулярных путей.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Продольные морфологических и физиологических мониторинг сфероидов трехмерной опухоли с помощью оптическая когерентная томография

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Трехмерная модель сфероидов для изучения стволовых клеток рака толстой кишки

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Трехмерная биомиметическая модель нейробластомы in vitro с использованием скаффолдов на основе коллагена

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...