Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
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Agradecemos al IISER Pune Microscopy Facility por el acceso a equipos e infraestructura y el apoyo para los experimentos. Este estudio fue apoyado por una subvención del Departamento de Biotecnología (DBT), el Gobierno de la India (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013), la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERB), el Gobierno de la India (EMR / 2016 / 001974) y en parte por IISER, Pune Core financiamiento. A. K. fue financiado por la beca CSIR-SRF, L.A. fue financiado a través de la beca DST-INSPIRE, V.C fue financiado por DBT (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013).

1. Siembra de células MCF10A en lrECM
<ol><li>Mantener las células MCF10A (células epiteliales mamarias adherentes) en el medio de crecimiento. Pasar las células cada 4 días. NOTA: Composición del medio de crecimiento: DMEM de glucosa alta sin piruvato de sodio que contiene suero de caballo (5%), insulina (10 μg/ml), hidrocortisona (0,5 μg/ml), factor de crecimiento epidérmico, EGF (20 ng/ml), de la toxina del cólera (100 ng/ml) y penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml) (ver Ta...

Los modelos establecidos basados en líneas celulares se utilizan ampliamente para estudiar el proceso de carcinogénesis. Los cultivos monocapa de células continúan proporcionando información sobre las diversas vías de señalización molecular que median los cambios característicos en las células cancerosas32. Los estudios sobre el papel de oncogenes bien conocidos como Ras, Myc y p53 mutado se informaron por primera vez utilizando cultivos monocapa como sistema modelo33,3...

Una miríada de modelos están disponibles para estudiar la progresión del cáncer, cada uno de ellos es único y representa un subtipo de esta compleja enfermedad. Cada modelo proporciona información única y valiosa sobre la biología del cáncer y ha mejorado los medios para imitar la condición real de la enfermedad. Las líneas celulares establecidas cultivadas como una monocapa han proporcionado información valiosa sobre procesos vitales in vitro, como la proliferación, la invasividad, la migración y la apoptosis1. Aunque el cultivo celular bidimensional (2D) ha sido la herramienta tradicional para investigar la respuesta de las células de mamíferos a varias perturbaciones ambientales, la extrapolación de estos hallazgos para predecir las respuestas a nivel tisular no parece lo suficientemente convincente. La principal limitación de los cultivos 2D es que el microambiente creado difiere en gran medida del tejido mamario en sí2. El cultivo 2D carece de la interacción de las células con la matriz extracelular, que es vital para el crecimiento de cualquier tejido. Además, las fuerzas de tracción experimentadas por la célula en cultivos monocapa dificultan la polaridad de esas células, alterando así la señalización celular y el comportamiento 3,4,5. Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) han abierto una nueva vía en el campo de la investigación del cáncer con su capacidad para imitar las condiciones in vivo in vitro. Muchas señales microambientales cruciales que se pierden en el cultivo celular 2D podrían restablecerse utilizando cultivos 3D de matriz extracelular rica en laminina (lrECM)6.
Diversos estudios han identificado la importancia del microambiente tumoral en la carcinogénesis 7,8. Los factores asociados a la inflamación son una parte importante del microambiente. El factor activador plaquetario (PAF) es un mediador fosfolípido secretado por varias células inmunes que media múltiples respuestas inmunes 9,10. Los altos niveles de PAF son secretados por diferentes líneas celulares de cáncer de mama y están asociados con una mayor proliferación11. Estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la presencia prolongada de PAF en cultivos acinares conduce a la transformación de las células epiteliales de mama12. PAF activa el receptor PAF (PAFR), activando el eje de señalización PI3K/Akt13. También se informa que el FAP está asociado con EMT, invasión y metástasis14.
El presente protocolo demuestra un sistema modelo para estudiar la transformación inducida por PAF, utilizando cultivos 3D de células epiteliales de mama, como ha sido descrito previamente por Chakravarty et al.12. Las células epiteliales mamarias cultivadas en la matriz extracelular (cultivos 3D) tienden a formar esferoides polarizados con crecimiento detenido. Estos son llamados acinos y se asemejan mucho a los acinos del tejido mamario, la unidad funcional más pequeña de la glándula mamaria, in vivo15. Estos esferoides (Figura 1A, B) consisten en una monocapa de células epiteliales polarizadas estrechamente empaquetadas que rodean una luz hueca y están unidas a la membrana basal (Figura 1C). Este proceso de morfogénesis ha sido bien descrito en la literatura16. Cuando se siembran en lrECM, las células se dividen y diferencian para formar un grupo de células, que luego se polarizan desde el día 4 en adelante. Para el día 8, los acinos consisten en un grupo de células polarizadas que están en contacto directo con la matriz extracelular y un grupo de células no polarizadas encerradas dentro de las células polarizadas externas, sin contacto con la matriz. Se sabe que estas células no polarizadas sufren apoptosis en el día 12 de cultivo, formando una luz hueca. Para el día 16, se forman estructuras con crecimiento detenido16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> Figura 1: Núcleos de células en acinos teñidos con una tinción nuclear . (A) Construcción 3D de los acinos. (B) Imagen de contraste de fase de acinos MCF10A cultivados en Matrigel durante 20 días. (C) La sección central muestra la presencia de un lumen hueco. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A diferencia de los cultivos 2D, los cultivos acinares ayudan a distinguir las células normales y transformadas a través de cambios morfológicos aparentes. Las células epiteliales mamarias no transformadas forman acinos con una luz hueca, imitando los acinos normales de la mama humana. Estos esferoides, tras la transformación, muestran una morfología alterada caracterizada por una pérdida importante de polaridad (una de las características del cáncer), ausencia de una luz o interrupción de la luz hueca (debido a la evasión de la apoptosis) que puede ser inducida debido a la desregulación de varios genes17,18,19,20 . Estas transformaciones se pueden estudiar utilizando técnicas de uso común como la inmunofluorescencia. Por lo tanto, el modelo de cultivo celular 3D puede funcionar como un método simple para investigar el proceso de morfogénesis acinar mamaria y carcinogénesis mamaria. El establecimiento de un sistema de cultivo 3D para comprender el efecto de un mediador fosfolípido, PAF, ayudará en la detección preclínica de fármacos de alto rendimiento.
Este trabajo ha adaptado el protocolo de cultivo 3D 'on top'16,21 para estudiar la transformación inducida por PAF 22. Los cambios fenotípicos inducidos por la exposición de los acinos al mediador fosfolípido se estudiaron mediante inmunofluorescencia. En el estudio se utilizaron varios marcadores de polaridad y transición epitelial-mesenquimal (EMT)12,16. La Tabla 1 menciona su localización normal y su fenotipo esperado tras la transformación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Anticuerpos</td>
			<td>Marcas</td>
			<td>Localización normal</td>
			<td>Fenotipo transformado</td>
		</tr><tr><td>α6-Integrina</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Basal con tinción lateral débil</td>
			<td>Fuerte tinción lateral / apical</td>
		</tr><tr><td>β-Catenin</td>
			<td>Unión célula-célula</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Localización anormal / nuclear o citoplasmática</td>
		</tr><tr><td>Vimentina</td>
			<td>Emt</td>
			<td>Presencia ausente / débil</td>
			<td>Regulación positiva</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Marcadores utilizados en el estudio. Diferentes marcadores utilizados con su localización en presencia y ausencia de tratamiento con FAP.
Este método se puede utilizar mejor para estudiar / detectar medicamentos plausibles y genes objetivo para varios subtipos de cáncer de mama. Esto puede proporcionar datos de respuesta a medicamentos más cercanos al escenario in vivo , ayudando a un desarrollo de medicamentos más rápido y confiable. Además, este sistema se puede utilizar para estudiar la señalización molecular asociada con la respuesta a los medicamentos y la resistencia a los medicamentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

Se han desarrollado varios modelos para estudiar el cáncer, como modelos de roedores y líneas celulares establecidas. Los estudios que utilizan estos modelos han proporcionado información valiosa sobre la carcinogénesis. Las líneas celulares han proporcionado una comprensión de la desregulación de la señalización molecular asociada con la tumorigénesis de mama, mientras que los modelos de roedores se utilizan ampliamente para estudiar las características celulares y moleculares del cáncer de mama in vivo. El establecimiento de cultivos 3D de células epiteliales y cancerosas de mama ayuda a cerrar la brecha entre los modelos in vivo e in vitro al imitar las condiciones in vivo in vitro. Este modelo se puede utilizar para comprender la desregulación de eventos complejos de señalización molecular y las características celulares durante la carcinogénesis mamaria. Aquí, se modifica un sistema de cultivo 3D para estudiar una transformación inducida por un mediador fosfolípido (factor activador plaquetario, PAF). Los inmunomoduladores y otras moléculas secretadas juegan un papel importante en la iniciación y progresión del tumor en la mama. En el presente estudio, los cultivos acinares 3D de células epiteliales mamarias se exponen a características de transformación exhibidas por PAF, como pérdida de polaridad y características celulares alteradas. Este sistema de cultivo 3D ayudará a arrojar luz sobre las perturbaciones genéticas y / o epigenéticas inducidas por varias entidades de moléculas pequeñas en el microambiente tumoral. Además, este sistema también proporcionará una plataforma para la identificación de genes nuevos y conocidos que pueden estar involucrados en el proceso de transformación.

Las células MCF10A, tras la exposición al tratamiento con PAF, forman estructuras acinares con fenotipos muy distintos. Se encontró que la α6-integrina estaba mal localizada con más tinción apical. Algunos acinos también mostraron tinción discontinua (Figura 2A). Ambos fenotipos indican la pérdida de polaridad basal, como lo demuestra la literatura24,25. Informes anteriores indican el controvertido papel de la α6-integrina ...

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Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

El presente protocolo describe la creación de cultivos 3D "en la parte superior " de una línea celular epitelial de mama no transformada, MCF10A, que se ha modificado para estudiar la transformación inducida por el factor activador plaquetario (PAF). La inmunofluorescencia se ha utilizado para evaluar la transformación y se discute en detalle.

Transformación inducida por mediadores fosfolípidos en cultivos tridimensionales

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Nuestros cultivos de ensayo 3D modificados se pueden utilizar para investigar el papel de varios componentes en un microambiente de cáncer, lo que lleva a la identificación de nuevos biomarcadores y objetivos farmacológicos. Este método permite estudiar los cambios en el fenotipo celular y la señalización molecular que se asemejan mucho al sistema inmune. También se puede modificar para cumplir con los requisitos específicos de un estudio.Este método puede ayudar a identificar nuevos biomarcadores que pueden ayudar en la detección temprana del cáncer de mama. Además, los conocimientos moleculares se pueden utilizar para identificar nuevos objetivos farmacológicos. Este método se puede utilizar para estudiar tanto la tumorigénesis como la morfogénesis después de la perturbación del gen o genes que pueden proporcionar información sobre el papel desempeñado por el gen o los genes.Para comenzar, tripsinizar las células aspirando el medio y lavando con 2 mililitros de PBS. Agregue 900 microlitros de 0.05% de tripsina-EDTA e incube a 37 grados centígrados durante unos 15 minutos o hasta que las células estén completamente tripsinizadas. Prepare un lecho de lrECM en ocho pocillos de un portaobjetos de vidrio de cubierta con cámara cubriendo cada pocillo con 60 microlitros de lrECM.Colóquelo en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados centígrados durante un máximo de 15 minutos. Para preparar la suspensión celular, agregue 5 mililitros de medio de resuspensión para apagar la actividad de tripsina y gire las células a 112 veces g durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Aspirar el medio gastado y volver a suspender las células en 2 mililitros de medio de ensayo.Mezcle bien la suspensión para asegurar la formación de una suspensión de una sola célula. Cuente las células usando un hemocitómetro y calcule el volumen de suspensión celular necesario para sembrar 6, 000 células en cada pocillo. De acuerdo con el número de pocillos requeridos, diluya la suspensión celular en el medio de superposición.Agregue 400 microlitros de la suspensión de celda diluida a las camas lrECM preparadas, asegurándose cuidadosamente de no perturbar la cama lrECM. Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Después de 3 horas, agregue 200 nanomoles de PAF a cada pozo.Agregue la misma concentración de PAF durante cada cambio de medio y reponga las células con medio fresco cada 4 días. Después de 20 días de cultivo, pipetear cuidadosamente el medio de cada pocillo y lavar los pocillos con 400 microlitros de PBS precalentado. Fijar las estructuras acinares añadiendo 400 microlitros de paraformaldehído al 4% recién preparado e incubando durante 20 min a temperatura ambiente.Enjuague los pozos una vez con PBS helado y permeabilice con PBS que contiene 0.5% Triton X-100 durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Después de 10 minutos, pipetear la solución Triton X-100 con cuidado y enjuagar con 400 microlitros de glicina PBS recién preparada. Añadir 400 microlitros de la solución bloqueante primaria que comprende 10% de suero de cabra en tampón de inmunofluorescencia e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.Retire la solución de bloqueo primaria, agregue 200 microlitros de anticuerpo de bloqueo secundario al 2% preparado en la solución de bloqueo primario y déjelo a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos. Preparar el anticuerpo primario en solución de anticuerpos bloqueadores secundarios al 2% en una dilución 1:100. Retire la solución de bloqueo secundaria, agregue el anticuerpo recién preparado e incube durante la noche a 4 grados centígrados.Pipetear cuidadosamente la solución de anticuerpos primarios y lavarla tres veces con 400 microlitros de tampón de inmunofluorescencia. A continuación, prepare una dilución 1:200 del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos en la solución de bloqueo primario e incube los portaobjetos en la solución de anticuerpos secundarios durante 40 a 60 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos con 400 microlitros de tampón de inmunofluorescencia durante 20 minutos, seguido de dos lavados con PBS durante 10 minutos cada uno.Contra-teñir los núcleos con PBS que contienen 0,5 nanogramos por mililitro de tinción nuclear durante 5 a 6 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos tres veces con 400 microlitros de PBS para eliminar el exceso de manchas. Pipetear cuidadosamente todo el PBS y asegurar la eliminación de la solución residual.Luego agregue una gota de reactivo de montaje en cada pocillo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante la noche. Finalmente, tome imágenes de las diapositivas con un aumento de 40x o 63x en un microscopio confocal, tomando secciones Z ópticas de 0.6 milímetros de tamaño de paso. Las imágenes representan los núcleos de células en acinos teñidos con una tinción nuclear.Aquí se muestra la construcción 3D de los acinos y la imagen de contraste de fase de los acinos MCF10A cultivados en lrECM durante 20 días. La sección central muestra la presencia de un lumen hueco. PAF interrumpe la polaridad e induce cambios similares a EMT en los acinos mamarios MCF10A.Las células MCF10A se cultivaron como 3D en cultivos superiores en lrECM. Los cultivos fueron tratados con PAF los días 0, 4, 8, 12 y 16. Los cultivos se mantuvieron durante 20 días y luego se inmunotiñeron para alfa6-integrina y tinción nuclear, GM130, un marcador de polaridad apical, y Vimentina, un marcador EMT.La pila central de los acinos respectivos se ha mostrado aquí. Los datos representativos son para 40-50 acinos de tres experimentos biológicamente independientes. La cama lrECM debe hacerse con cuidado de modo que se distribuya uniformemente sin burbujas de aire.Además, la suspensión celular debe mezclarse uniformemente y agregarse lentamente para evitar la formación de grumos. Se puede obtener proteínas y ARN de los cultivos 3D que luego se pueden utilizar para investigar las diferentes vías moleculares.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

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