Name: phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

IISER Pune Mikroskopi Tesisi'ne ekipman ve altyapıya erişim ve deneylere destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Biyoteknoloji Bölümü (DBT), Hindistan Hükümeti (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (SERB), Hindistan Hükümeti (EMR / 2016 / 001974) ve kısmen IISER, Pune Core fonu tarafından desteklenmiştir. A.K. CSIR-SIR bursu tarafından, L.A. DST-INSPIRE bursu tarafından, V.C DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018 / 2013) tarafından finanse edildi.

1. MCF10A hücrelerinin lrECM'de tohumlanması
<ol><li>MCF10A hücrelerini (yapışkan meme epitel hücreleri) büyüme ortamında tutun. Hücreleri her 4 günde bir geçirin. NOT: Büyüme ortamının bileşimi: at serumu (% 5), insülin (10 μg / mL), hidrokortizon (0.5 μg / mL), epidermal büyüme faktörü, EGF (20 ng / mL), kolera toksini (100 ng / mL) ve penisilin-streptomisin (100 birim / mL) içeren sodyum piruvat içermeyen yüksek glikozlu DMEM (bkz.</li>
	<li>Den...

Yerleşik hücre hattı tabanlı modeller, karsinogenez sürecini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hücrelerin tek katmanlı kültürleri, kanser hücrelerindeki karakteristik değişikliklere aracılık eden çeşitli moleküler sinyal yolları hakkında fikir vermeye devam etmektedir32. Ras, Myc ve mutasyona uğramış p53 gibi iyi bilinen onkogenlerin rolü üzerine yapılan çalışmalar ilk olarak 33,34,35,36 model sistemi...

Kanserin ilerlemesini incelemek için sayısız model mevcuttur, bunların her biri benzersizdir ve bu karmaşık hastalığın bir alt tipini temsil etmektedir. Her model, kanser biyolojisine benzersiz ve değerli bilgiler sağlar ve gerçek hastalık durumunu taklit etme araçlarını geliştirmiştir. Tek katmanlı olarak yetiştirilen yerleşik hücre hatları, proliferasyon, invazivlik, göç ve apoptoz1 gibi in vitro hayati süreçler hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. İki boyutlu (2D) hücre kültürü, memeli hücrelerinin çeşitli çevresel karışıklıklara tepkisini araştırmak için geleneksel bir araç olmasına rağmen, doku düzeyindeki yanıtları tahmin etmek için bu bulguların ekstrapolasyonu yeterince ikna edici görünmemektedir. 2D kültürlerin en büyük sınırlaması, yaratılan mikro çevrenin meme dokusunun kendisinden büyük ölçüde farklı olmasıdır2. 2D kültür, hücrelerin herhangi bir dokunun büyümesi için hayati önem taşıyan hücre dışı matris ile etkileşiminden yoksundur. Ayrıca, tek katmanlı kültürlerde hücrenin yaşadığı gerilme kuvvetleri, bu hücrelerin polaritesini engeller, böylece hücre sinyalini ve davranışını değiştirir 3,4,5. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri, in vivo koşulları in vitro olarak taklit etme yetenekleriyle kanser araştırmaları alanında yeni bir yol açmıştır. 2B hücre kültüründe kaybolan birçok önemli mikroçevresel ipucu, laminin bakımından zengin hücre dışı matrisin (lrECM)6 3B kültürleri kullanılarak yeniden oluşturulabilir.
Çeşitli çalışmalar karsinogenezde tümör mikroçevresinin önemini belirlemiştir 7,8. Enflamasyonla ilişkili faktörler mikro çevrenin önemli bir parçasıdır. Trombosit Aktive Edici Faktör (PAF), çeşitli immün hücreler tarafından salgılanan ve çoklu immün yanıtlara aracılık eden bir fosfolipid mediatörüdür 9,10. Yüksek PAF seviyeleri farklı meme kanseri hücre hatları tarafından salgılanır ve artmış proliferasyon ile ilişkilidir11. Laboratuvarımızdan yapılan çalışmalar, asiner kültürlerde PAF'ın uzun süreli varlığının meme epitel hücrelerinin transformasyonuna yol açtığını göstermiştir12. PAF, PAF reseptörünü (PAFR) aktive ederek PI3K/Akt sinyal ekseni13'ü aktive eder. PAFR'nin ayrıca EMT, invazyon ve metastaz14 ile ilişkili olduğu bildirilmiştir.
Mevcut protokol, daha önce Chakravarty ve ark.12 tarafından tanımlandığı gibi, meme epitel hücrelerinin 3D kültürlerini kullanarak, PAF kaynaklı transformasyonu incelemek için bir model sistemi göstermektedir. Hücre dışı matriste (3D kültürler) yetiştirilen meme epitel hücreleri, polarize büyüme ile tutuklanan sferoidler oluşturma eğilimindedir. Bunlara acini denir ve meme bezinin en küçük fonksiyonel birimi olan meme dokusunun akinisine in vivo 15'e çok benzer. Bu sferoidler (Şekil 1A,B), içi boş bir lümeni çevreleyen ve bazal membrana tutturulmuş, sıkıca paketlenmiş polarize epitel hücrelerinden oluşan bir tek katmandan oluşur (Şekil 1C). Bu morfogenez süreci literatür16'da iyi tanımlanmıştır. LrECM üzerine tohumlandığında, hücreler bir hücre kümesi oluşturmak için bölünme ve farklılaşmaya uğrar ve daha sonra 4. Gün'den itibaren polarize olurlar. 8. Günde, acini, hücre dışı matrisle doğrudan temas halinde olan bir grup polarize hücreden ve dış polarize hücrelerin içine kapatılmış, matrise temas etmeyen polarize edilmemiş bir hücre kümesinden oluşur. Bu polarize olmayan hücrelerin, kültürün 12. Gününe kadar apoptoza uğradığı ve içi boş bir lümen oluşturduğu bilinmektedir. 16. Gün'e gelindiğinde, büyümeyi durduran yapılar16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg"> Şekil 1: Acini'deki hücrelerin çekirdekleri nükleer bir leke ile boyanmıştır . (A) Acini'nin 3D yapısı. (B) Matrigel'de 20 gün boyunca yetiştirilen MCF10A acini'nin Faz Kontrastı görüntüsü. (C) En ortadaki bölüm içi boş bir lümenin varlığını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2D kültürlerin aksine, acinar kültürler normal ve dönüştürülmüş hücreleri görünür morfoloji değişiklikleri yoluyla ayırt etmeye yardımcı olur. Transforme olmayan meme epitel hücreleri, normal insan meme acinisini taklit eden içi boş bir lümen ile acini oluşturur. Bu sferoidler, transformasyon üzerine, çeşitli genlerin deregülasyonuna bağlı olarak indüklenebilecek büyük bir polarite kaybı (kanserin ayırt edici özelliklerinden biri), bir lümen yokluğu veya içi boş lümenin bozulması (apoptozun kaçması nedeniyle) ile karakterize bozulmuş bir morfoloji göstermektedir17,18,19,20 . Bu dönüşümler, immünofloresan gibi yaygın olarak kullanılan teknikler kullanılarak incelenebilir. Böylece, 3D hücre kültürü modeli, meme asinar morfogenezi ve meme kanserogenezi sürecini araştırmak için basit bir yöntem olarak işlev görebilir. Bir fosfolipit mediyatörü olan PAF'ın etkisini anlamak için bir 3D kültür sistemi kurmak, yüksek verimli preklinik ilaç taramasına yardımcı olacaktır.
Bu çalışma, PAF 22 tarafından indüklenen dönüşümü incelemek için 3D 'üstte' kültür protokolü 16,21'i uyarladı. Acının fosfolipid mediatöre maruz kalmasıyla indüklenen fenotipik değişiklikler immünofloresan kullanılarak incelendi. Çalışmada çeşitli polarite ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) belirteçleri 12,16 kullanıldı. Tablo 1'de normal lokalizasyonlarından ve transformasyon üzerine beklenen fenotiplerinden bahsedilmektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Antikor</td>
			<td>Işaret</td>
			<td>Normal lokalizasyon</td>
			<td>Dönüştürülmüş fenotip</td>
		</tr><tr><td>α6-İntegrin</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Zayıf yanal lekeli bazal</td>
			<td>Güçlü yanal / apikal leke</td>
		</tr><tr><td>β-Katenin</td>
			<td>Hücre-hücre bağlantısı</td>
			<td>Basolateral</td>
			<td>Anormal / nükleer veya sitoplazmik lokalizasyon</td>
		</tr><tr><td>Arjantin</td>
			<td>Emt</td>
			<td>Eksik / zayıf mevcudiyet</td>
			<td>Yukarı düzenleme</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Çalışmada kullanılan belirteçler. PAF tedavisinin varlığında ve yokluğunda lokalizasyonları ile kullanılan farklı belirteçler.
Bu yöntem, makul ilaçları incelemek / taramak ve çeşitli meme kanseri alt tipleri için genleri hedeflemek için en iyi şekilde kullanılabilir. Bu, in vivo senaryoya daha yakın bir ilaç yanıt verisi sağlayarak daha hızlı ve daha güvenilir ilaç geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, bu sistem ilaç yanıtı ve ilaç direnci ile ilişkili moleküler sinyalizasyonu incelemek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Flour 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Coverglass</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>1 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644-0.2MG</td>
			<td>100 mg/mL in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>1 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>10 mg/mL stock dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lrECM (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain&#160; (Hoechst)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAF</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>91575-58-5</td>
			<td>Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-integrin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospholipid mediator induced transformation in three-dimensional cultures

Kemirgen modelleri ve yerleşik hücre hatları gibi kanseri incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Karsinogenez ile ilgili değerli bilgiler bu modelleri kullanan çalışmalarla sağlanmıştır. Hücre hatları, meme tümörigenezi ile ilişkili moleküler sinyalleşmenin serbestleştirilmesinin anlaşılmasını sağlarken, kemirgen modelleri, meme kanserinin in vivo hücresel ve moleküler özelliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Meme epitel ve kanserli hücrelerin 3D kültürlerinin oluşturulması, in vivo ve in vitro modeller arasındaki boşluğu in vitro olarak in vivo koşulları taklit ederek köprülemeye yardımcı olur. Bu model, meme kanserogenezi sırasında karmaşık moleküler sinyal olaylarının ve hücresel özelliklerin serbestleştirilmesini anlamak için kullanılabilir. Burada, fosfolipid meditor kaynaklı (Trombosit Aktive Edici Faktör, PAF) bir dönüşümü incelemek için bir 3D kültür sistemi modifiye edilmiştir. İmmünomodülatörler ve diğer salgılanan moleküller memede tümör başlangıcında ve ilerlemesinde önemli rol oynar. Bu çalışmada, meme epitel hücrelerinin 3D asinar kültürleri, polarite kaybı ve değişmiş hücresel özellikler gibi PAF transformasyon özelliklerine maruz bırakılmıştır. Bu 3B kültür sistemi, tümör mikro ortamındaki çeşitli küçük moleküllü varlıklar tarafından indüklenen genetik ve / veya epigenetik pertürbasyonlara ışık tutmaya yardımcı olacaktır. Ek olarak, bu sistem aynı zamanda dönüşüm sürecine dahil olabilecek yeni ve bilinen genlerin tanımlanması için bir platform sağlayacaktır.

MCF10A hücreleri, PAF tedavisine maruz kaldıktan sonra, çok farklı fenotiplere sahip asinar yapılar oluşturur. α6-integrinin daha apikal boyama ile yanlış lokalize olduğu bulundu. Birkaç acini de süreksiz boyama gösterdi (Şekil 2A). Her iki fenotip, literatür24,25'ten de kanıtlandığı gibi, bazal polarite kaybını göstermektedir. Daha önceki raporlar, α6-integrinin kanser metastazındaki tartışmalı rolünü g...

Watch this Scientific Journal Video about Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures at JoVE.com

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Mevcut protokol, Trombosit Aktive Edici Faktör (PAF) kaynaklı transformasyonu incelemek için modifiye edilmiş, dönüştürülmemiş bir meme epitel hücre hattı olan MCF10A'nın 3D 'üstte' kültürlerinin kurulmasını açıklamaktadır. İmmüno-floresan transformasyonu değerlendirmek için kullanılmış ve ayrıntılı olarak tartışılmıştır.

Üç Boyutlu Kültürlerde Fosfolipid Aracısı İndüklenmiş Transformasyon

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Modifiye edilmiş 3D tahlil kültürlerimiz, kanser mikro ortamındaki çeşitli bileşenlerin rolünü araştırmak için kullanılabilir ve bu da yeni biyobelirteçlerin ve ilaç hedeflerinin tanımlanmasına yol açar. Bu yöntem, bağışıklık sistemine çok benzeyen hücresel fenotipteki ve moleküler sinyallemedeki değişiklikleri incelemeyi sağlar. Bir etüdün özel gereksinimlerini karşılamak için de değiştirilebilir.Bu yöntem, meme kanserinin erken teşhisine yardımcı olabilecek yeni biyobelirteçlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, moleküler içgörüler yeni ilaç hedeflerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem, gen veya genlerin oynadığı rol hakkında fikir verebilecek gen veya genlerin pertürbasyonundan sonra hem tümörigenezi hem de morfogenezi incelemek için kullanılabilir.Başlamak için, ortamı aspire ederek ve 2 mililitre PBS ile yıkayarak hücreleri tripsinize edin. 900 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve yaklaşık 15 dakika boyunca veya hücreler tamamen tripsinize olana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Her bir kuyucuğu 60 mikrolitre lrECM ile kaplayarak odacıklı bir kapak camı kaydırağının sekiz kuyucuğunda bir lrECM yatağı hazırlayın.En fazla 15 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için, tripsin aktivitesini söndürmek için 5 mililitre yeniden süspansiyon ortamı ekleyin ve hücreleri 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 112 kez g'de döndürün. Harcanan ortamı aspire edin ve hücreleri 2 mililitre tahlil ortamında yeniden askıya alın.Tek hücreli bir süspansiyonun oluşumunu sağlamak için süspansiyonu iyice karıştırın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve her bir kuyucukta 6.000 hücreyi tohumlamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. Gerekli kuyu sayısına göre, hücre süspansiyonunu kaplama ortamında seyreltin.Hazırlanan lrECM yataklarına 400 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin ve lrECM yatağını rahatsız etmediğinizden emin olun. Nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 3 saat sonra, her bir kuyucuğa 200 nanomol PAF ekleyin.Her ortam değişikliği sırasında aynı PAF konsantrasyonunu ekleyin ve hücreleri her 4 günde bir taze ortamla doldurun. 20 günlük kültürlemeden sonra, ortamı her bir kuyucuktan dikkatlice pipetleyin ve kuyucukları 400 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Acinar yapıları, 400 mikrolitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ekleyerek ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ederek sabitleyin.Kuyucukları buz gibi soğuk PBS ile bir kez durulayın ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca% 0.5Triton X-100 içeren PBS ile geçirgenleştirin. 10 dakika sonra, Triton X-100 çözeltisini dikkatlice pipetleyin ve 400 mikrolitre taze hazırlanmış PBS glisin ile durulayın. İmmünofloresan tamponunda% 10 keçi serumu içeren birincil bloke edici çözeltinin 400 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.Birincil blokaj çözeltisini çıkarın, birincil blokaj çözeltisinde hazırlanan 200 mikrolitre% 2 ikincil bloke edici antikor ekleyin ve 45 ila 60 dakika oda sıcaklığında bırakın. Primer antikoru %2 sekonder bloke edici antikor çözeltisinde 1:100 seyreltmede hazırlayın. İkincil blokaj çözeltisini çıkarın, taze hazırlanmış antikoru ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.Birincil antikor çözeltisini dikkatlice pipetleyin ve 400 mikrolitre immünofloresan tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, birincil blokaj çözeltisinde florofor konjuge sekonjuge sekonder antikorun 1:200 seyreltilmesini hazırlayın ve slaytları ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika inkübe edin. Slaytları 400 mikrolitre immünofloresan tamponu ile 20 dakika boyunca durulayın, ardından her biri 10 dakika boyunca PBS ile iki yıkama yapın.Çekirdekleri, oda sıcaklığında 5 ila 6 dakika boyunca mililitre nükleer leke başına 0.5 nanogram içeren PBS ile karşı boyayın. Fazla lekeyi çıkarmak için slaytları üç kez 400 mikrolitre PBS ile yıkayın. Tüm PBS'yi dikkatlice pipetle çıkarın ve artık çözeltinin çıkarılmasını sağlayın.Daha sonra her bir kuyucuğa bir damla montaj reaktifi ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin. Son olarak, slaytları konfokal mikroskopta 40x veya 63x büyütme altında görüntüleyerek 0,6 milimetre adım boyutunda optik Z-kesitleri alın. Görüntüler, nükleer bir leke ile boyanmış acini'deki hücrelerin çekirdeklerini temsil ediyor.Acini'nin 3D yapısı ve 20 gün boyunca lrECM'de yetiştirilen MCF10A acini'nin faz kontrast görüntüsü burada gösterilmiştir. En ortadaki bölüm içi boş bir lümenin varlığını göstermektedir. PAF polariteyi bozar ve MCF10A meme akinisinde EMT benzeri değişikliklere neden olur.MCF10A hücreleri, lrECM'de üst kültürlerde 3D olarak yetiştirildi. Kültürler 0, 4, 8, 12 ve 16. günlerde PAF ile tedavi edildi. Kültürler 20 gün boyunca korundu ve daha sonra alfa6-integrin ve nükleer boya, apikal polarite için bir belirteç olan GM130 ve bir EMT belirteci olan Vimentin için immünoboyalandı.İlgili acini'nin en ortadaki yığını burada gösterilmiştir. Temsili veriler, biyolojik olarak bağımsız üç deneyden 40-50 acini içindir. LRCCM yatağının, herhangi bir hava kabarcığı olmadan eşit şekilde yayılacak şekilde dikkatlice yapılması gerekir.Ayrıca, hücre süspansiyonu eşit şekilde karıştırılmalı ve kümelenmeyi önlemek için yavaşça eklenmelidir. Daha sonra farklı moleküler yolları araştırmak için kullanılabilecek 3B kültürlerden protein ve RNA elde edilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...