Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

يشكر المؤلفون البروفيسور سيجيانغ هي والدكتور فو جيا على رؤيتهم في عزل الخلايا البطانية للفئران ويشكرون البروفيسور مون زيدي على توفير الفئرانالمستأصلة والمناقشات القيمة. يود المؤلفون أيضا أن يعربوا عن تقديرهم ل Microscopy CORE في كلية Icahn للطب في Mount Sinai والموظفين على التوجيه الذي تلقيناه. تم دعم هذا العمل من خلال منح من منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK097253 ومنحة وزارة الدفاع CDMRP E01 W81XWH2010836 إلى I.S.D.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا من قبل IACUC في كلية إيكان للطب في جبل سيناء. استخدمنا ثلاثة فئران ذكور (H-2Kb-tsA58 الفئران المعدلة وراثيا مع الميتوكوندريا القابلة للتنشيط الضوئي [PhAM]) تم شراؤها من مختبر جاكسون وحافظنا على نظام غذائي طبيعي للتشاو.
1. ظروف ?...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

الميتوكوندريا ضرورية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، والتوازن ، واستجابات الإجهاد ، ويرتبط اختلالها الوظيفي بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض الكلى. الميتوكوندريا لها دور في التوليد المرضي لأنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS) ، وتنظيم مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، ومسارات موت ا...

الكبيبة ضرورية لترشيح الدم عن طريق تقييد مرور الجزيئات الكبيرة عبر حاجز الترشيح الكبيبي 1,2. تحتوي الكبيبة على أربعة أنواع من الخلايا: الخلايا الظهارية الجدارية ، والخلايا الظهارية (الخلايا الظهارية الحشوية) ، والخلايا البطانية الكبيبية (GEC) ، والخلايا المتوسطة3. تتميز البطانة الكبيبية ببنية وعائية فريدة من نوعها ، وفقا لوجود fenestrae المطلوبة لأحجام الترشيح الكبيرة4. السطح القمي للبطانة الكبيبية مغطى بطبقة جليكوكاليكس سالبة الشحنة وطبقة تسمى الطبقة السطحية البطانية التي تخلق مسافة بين البطانة والدم. يوفر هذا الهيكل انتقائية عالية الشحنة تقيد مرور الجزيئات سالبة الشحنة مثل الألبومين وتمنع التصاق الكريات البيض والصفائح الدموية5.
GECs حساسة للغاية للتغيرات الأيضية ، مثل ارتفاع السكر في الدم المرتبط ببيئة السكري. في الواقع ، يؤدي مرض السكري إلى زيادة الدورة الدموية للمواد الضارة ، وتشبع مسارات استقلاب الجلوكوز ، وتوازن الأكسدة والاختزال الخلويالمضطرب 3,6. علاوة على ذلك ، فإن الزيادة في أنواع الأكسجين التفاعلية تؤدي إلى خلل في الميتوكوندريا ، مما يؤثر على وظيفة البطانة7.
الهدف العام للبروتوكول الحالي هو عزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة مع ميزات الميتوكوندريا الفلورية. في الواقع ، فإن زراعة الخلايا في GECs الأولية لها دورة تكاثرية محدودة وشيخوخة مبكرة8. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد وجود الميتوكوندريا الفلورية في فحص أحداث الانشطار والاندماج استجابة لارتفاع السكر في الدم أو أي علاج آخر. كطريقة بديلة ، استخدمت مختبرات أخرى h-TERT لتخليد الخلايا في المختبر9.
تسمح الطريقة الموضحة هنا بعزل الخلايا البطانية الكبيبية mitoDendra2 الخالدة بشكل مشروط من الحيوانات التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع (الشكل 1). يصف هذا البروتوكول المفصل استخدام الفئران المعدلة وراثيا (H-2K b-tsA58) التي تؤوي فيروس سيميان 40 مستضد الورم الكبير (SV40 TAg) الجين10,11 لتوليد خلايا خلدة مشروطة حراريا. يعمل منتج الجين tsA58 TAg عند درجة حرارة متساهلة تبلغ 33 درجة مئوية تحت سيطرة المروج الجانبي 5 'للفأر H-2Kb ، والذي يزداد فوق المستويات القاعدية عند التعرض لإنترفيرون جاما (IFNγ) ، وبالتالي الحفاظ على النمط الظاهريللانتشار الشرطي 12. يتحلل H-2Kb بسرعة عند درجة حرارة غير متساهلة تبلغ 37 درجة مئوية في غياب IFNγ ، مما يزيل وظيفة تخليد tsA58Tag في الخلايا ويسمح للخلايا بتطوير نمط ظاهري أكثر تمايزا13،14،15. يسمح العبور الاختياري للفئران المعدلة وراثيا H-2Kb-tsA58 مع فئران PhAM ، والتي تعبر عن ميتوكوندريا خاصة (الوحدة الفرعية الثامنة من السيتوكروم ج أوكسيديز) Dendra2-green ، بالكشف الحي عن الميتوكوندرياالفلورية 16. يتحول مضان Dendra2 الأخضر إلى مضان أحمر بعد التعرض لليزر 405 نانومتر16. عندما تندمج الميتوكوندريا بعد تبديل الصور ، فإنها تشكل أشكالا ممدودة تظهر صفراء من تبادل المواد الخضراء والصفراء أو تظهر حمراء عندما تخضع للانشطار 7,17. تعد mitoDendra2-GECs أداة رائعة لدراسة الاستجابات الخلوية للميتوكوندريا GEC للمحفزات المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

يمكن أن يؤدي خلل الخلايا البطانية الكبيبية (GEC) إلى انهيار حاجز الترشيح الكبيبي والمساهمة فيه. تم اقتراح زيادة الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا كآلية تؤدي إلى خلل وظيفي في GEC في التسبب في بعض أمراض الكبيبات. تاريخيا ، كانت عزلة GECs من النماذج الحية صعبة للغاية بسبب الصعوبات في عزل الثقافات النقية عن الكبيبات. GECs لديها متطلبات نمو معقدة في المختبر وعمر محدود للغاية. هنا ، نصف الإجراء الخاص بعزل وزراعة GECs الخالدة المشروطة بالميتوكوندريا الفلورية ، مما يتيح تتبع أحداث انشطار الميتوكوندريا والاندماج. تم عزل GECs من كليتي فأر مزدوج معدل وراثيا يعبر عن thermolabile SV40 TAg (من Immortomouse) ، مما يعزز الانتشار المشروط وقمع تمايز الخلايا ، وبروتين فلوري قابل للتحويل الضوئي (Dendra2) في جميع الميتوكوندريا (من فأر الميتوكوندريا القابل للتنشيط الضوئي [PhAMexcised]). يسمح خط الخلية المستقر الذي تم إنشاؤه بتمايز الخلايا بعد تعطيل جين SV40 TAg التخليدي والتنشيط الضوئي لمجموعة فرعية من الميتوكوندريا مما يتسبب في تحول التألق من الأخضر إلى الأحمر. يسمح استخدام mitoDendra2-GECs بالتصوير المباشر لتوزيع الميتوكوندريا الفلورية والاندماج وأحداث الانشطار دون تلطيخ الخلايا.

في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة المشروطة مع الميتوكوندريا الفلورية المستقرة (mitoDendra2-GECs) (الشكل 1). يعد استخدام الفئران الصغيرة التي تتراوح أعمارها بين 6 و 10 أسابيع أمرا ضروريا للحصول على عدد كبير من الخلايا السليمة. بعد 3 أيام من ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

تصف المقالة طريقة عزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة المشروطة من كليتي الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن فيروس thermolabile simian 40 والميتوكوندريا القابلة للتنشيط الضوئي ، PhAMالمستأصلة. نصف إجراء عزل الكبيبات من الكلى الكاملة باستخدام الخرز وخطوات الهضم والبذر واستزراع GECs-CD31 الإيجابي.

عزل الخلايا البطانية الكبيبية للفأر الخالدة المشروطة مع الميتوكوندريا الفلورية

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

تعد الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة ذات الميتوكوندريا الفلورية المستقرة أداة رائعة لفحص تأثير المحفزات المختلفة على بنية الميتوكوندريا في المختبر. الطريقة الموصوفة في المقالة الحالية تنتج عددا كبيرا من الخلايا البطانية الكبيبية. من خلال اختبار جزيئات صغيرة على GEC ، يمكننا فحص العلاج الأحادي لمرض الكلى السكري حيث تتأثر GECs.الطريقة الموصوفة سهلة التنفيذ ولا تتطلب معدات محددة. ومع ذلك ، من المهم اتباع الخطوات الموضحة وتعقيم المعدات لتجنب التلوث. للبدء ، ضع مواد التروية والعزل المطلوبة لعزل الخلايا الكبيبية في الكلى في مساحة العمل.قم بتصفية محلول الملح المتوازن من هانكس الطازج ، أو HBSS ، بفلتر 0.2 ميكرون ، واحتفظ به تحت الغطاء لتجنب التلوث. ثم امزج 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي مع 20 ملليلتر من HBSS. قم بتسخين RPMI باستخدام 10٪ FCS ووسط زراعة الخلايا البطانية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.بعد ذلك ، قم بتغطية بئرين من صفيحة من ستة آبار مسبقا بمليلين من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر كولاجين IV لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS لإزالة حمض الأسيتيك المستخدم لتخفيف الكولاجين. استخدم الألواح المطلية على الفور ، أو قم بتخزينها في درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.نظف الأدوات الجراحية ومساحة العمل باستخدام 70٪ إيثانول. في وقت لاحق ، الأوتوكلاف الأدوات الجراحية لمدة 30 دقيقة. بعد فتح بطن فأر مخدر ، أدخل إبرة فراشة في البطين الأيسر.لحقن 100 ميكرولتر من محلول الخرزة لتوسيع الدورة الدموية ، قم بكسر الوريد الأجوف السفلي أسفل الكلى بعناية بإبرة قياس 19 واستمر في نضح محلول الخرزة. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية برفق باستخدام ملاقط ، واستأصل كلتا الكليتين بمقص جراحي رفيع C ، وضعها على طبق مع ملليلتر واحد من HBSS على الجليد. اللحم المفروم الكلى مع مشرط معقم إلى قطع صغيرة ملليمتر واحد.احتضان الكلى المفرومة مع ملليمتر واحد من كولاجيناز من النوع الثاني الطازج لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع إمالة لطيفة على شاكر أفقي. بعد الهضم ، أضف أربعة ملليلتر من RPMI مع 10٪ FBS لتحييد الكولاجيناز. قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية معقمة 100 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر.استخدم الجزء السفلي من أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر لتحريك الأنسجة المهضومة ضد المصفاة ، مما يسمح للكبيبات بالمرور. شطف مصفاة الخلية مع 15 ملليلتر من HBSS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتدفق بسرعة 200 XG لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.في هذه المرحلة ، يحتوي الأنبوب على ثلاث طبقات. تحتوي الطبقة العليا على هياكل أصغر مثل الأنابيب ، والطبقة الوسطى عبارة عن خرز به كبيبات ، والطبقة السفلية تحتوي على حطام. يستنشق بعناية الطاف والطبقة البيضاء العليا.بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على حبات تحمل الكبيبات والحطام في 1.5 ملليلتر من HBSS وانقلها إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر. ضع الأنبوب في مكثف مغناطيسي واستنشق المادة الطافية قبل غسل الخرز مرتين باستخدام ملليلتر واحد من HBSS. ضع 20 ميكرولتر من معلق الخلية على شريحة.ثم راقب الشريحة تحت المجهر لوجود الكبيبات. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في وسط نمو الخلايا البطانية وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر. أضف ميكرولترا واحدا من إنترفيرون جاما لكل ثلاثة ملليلتر من الوسط ، وضع الخلايا في صفيحة من ستة آبار للحضانة عند 33 درجة مئوية.بعد ثلاثة أيام من الثقافة ، استبدل بعناية وسط ملليلتر واحد بوسط جديد. في هذه المرحلة ، تكون الخلايا غير متجانسة مع مزيج من الخلايا الكبيبية. بعد سبعة أيام ، استبدل الوسط بمليلين من وسط نمو الخلايا البطانية الطازجة ، مع استكماله بإنترفيرون جاما لبدء تكاثر الخلايا.بعد 10 أيام ، عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بتمريرها باستخدام التربسين ونقلها إلى قارورة T-25 مغلفة بالكولاجين IV.بعد 21 يوما من الثقافة ، انقل الخلايا إلى قارورة T-75. أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تربسين إلى دورق T-75 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتحييد التربسين بثلاثة ملليلتر من وسط النمو البطاني ونقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر للطرد المركزي عند 200 XG لمدة خمس دقائق.نضح المادة الطافية وغسل الخلايا في ملليلتر واحد من PBS تحتوي على 1٪ BSA ، EDTA اثنين مليمولار ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الخرز المطلي بالأجسام المضادة CD31 و 800 ميكرولتر من PBS. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة مع الاهتزاز المستمر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد ذلك ، ضع الأنبوب في المكثف المغناطيسي واغسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS الذي يحتوي على BSA و EDTA والبنسلين / الستربتومايسين. بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط النمو البطاني ، مع استكمال إنترفيرون جاما. لوحة 1.5 ملليلتر من الخلايا لكل بئر في الآبار المغلفة بالكولاجين IV على لوحة من ستة آبار واستزراع في ظل ظروف متساهلة عند 33 درجة مئوية.بعد أربعة أيام ، استبدل 750 ميكرولتر من الوسط بوسط نمو بطاني جديد ، مع استكمال إنترفيرون جاما. بعد 10 إلى 14 يوما من الثقافة ، باستخدام مجهر فوق الفلور مع مرشح 488 نانومتر ، راقب نمو الخلايا البطانية الكبيبية الإيجابية CD31 ، أو GECs ، المستعمرات التي تعبر عن الميتوكوندريا الفلورية. بعد 21 يوما ، أو عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء ، قم بنقلها إلى قارورة T-25.حافظ على الثقافة باستخدام وسيط نمو RPMI يحتوي على 10٪ FCS. بدلا من ذلك ، يمكن حفظ الخلايا بالتبريد. خلايا المرور باستخدام التربسين ، كما هو موضح سابقا.ثم, الطرد المركزي الخلايا وإعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من وسط التجميد. احصل على الخلايا في أنابيب التبريد وتخزينها في النيتروجين السائل ، درجة حرارة البخار. وصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا البطانية الكبيبية.من الكبيبات المعزولة ، بدأت الخلايا تنمو ببطء بعد ثلاثة أيام من الثقافة. بعد سبعة أيام ، بدت الخلايا غير متجانسة وأظهرت أنواعا أخرى من الخلايا الكبيبية ، مثل الخلايا البودية ، والخلايا الجدارية ، والظهارية ، والخلايا المتوسطة. بعد الوصول إلى 70 إلى 80٪ من الالتقاء ، تمت إزالة الخلايا الكبيبية الأخرى باستخدام مجموعة إيجابية من الخلايا البطانية.عبرت MitoDendra2 GECs عن CD31 وكانت سلبية لعلامة podocyte ، كما هو موضح في تلطيخ synaptopodin السلبي. تم فحص تأثير تركيز الجلوكوز على بنية الميتوكوندريا. بالمقارنة مع الميتوكوندريا الممدودة المرئية في الخلايا تحت الجلوكوز الطبيعي ، فإن ارتفاع الجلوكوز الناجم عن تجزئة أو انشطار الميتوكوندريا ، كما لوحظ من قبل الميتوكوندريا البارزة على شكل كروي.علاوة على ذلك ، تم استخدام ليزر 405 نانومتر لتحويل مجموعة فرعية مختارة من الميتوكوندريا في MitoDendra2 GEC حي واحد. يظهر تبديل ضوئي ناجح للميتوكوندريا من الأخضر إلى الأحمر في المنطقة المحددة للخلايا المعالجة بتركيز الجلوكوز الطبيعي والعالي. سمح هذا التبديل بمشاهدة أحداث الاندماج في MitoDendra2 GECs.تحت الجلوكوز الطبيعي ، لوحظ مضان أصفر مدمج أخضر وأحمر بسبب اندماج مصفوفة الميتوكوندريا. في المقابل ، في GECs المعالجة بالجلوكوز العالي ، كانت الميتوكوندريا مجزأة بشكل أساسي. يعد وضع الخلايا في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار ذات حجم صغير من وسط النمو أمرا ضروريا للسماح للخلايا بالالتصاق بالطبق.يمكن استخدام الخلايا البطانية المعزولة لأداء وظيفة الميتوكوندريا والدراسات الهيكلية. إن استخدام الخلايا البطانية الخالدة مع ميزات الميتوكوندريا الفلورية سيمهد الطريق نحو اكتشاف الأدوية. يمكن اختبار الجزيئات الصغيرة على الخلايا ، ويتم إجراء التصوير الحي لفحص تأثيرها على وظيفة الميتوكوندريا.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...