Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Forfatterne takker professor Cijiang He og Dr. Fu Jia for deres indsigt i museendotelcelleisolering og takker professor Mone Zaidi for at givePhAM-udskårne mus og værdifulde diskussioner. Forfatterne vil også gerne anerkende mikroskopi CORE på Icahn School of Medicine på Mount Sinai og personale for den vejledning, vi modtog. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health grant R01DK097253 og Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 til I.S.D.

Alle dyreforsøg beskrevet her blev godkendt af IACUC på Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Vi brugte tre hanmus (H-2Kb-tsA58 transgene mus med fotoaktiverbare mitokondrier [PhAM]) købt fra Jackson lab og holdt på en normal chow-diæt.
1. Arbejdsvilkår og forberedelser
<ol><li>Rengør arbejdsområdet inde i den laminære flowhætte ved hjælp af 70 % ethanol og UV-C-lys.</li>
	<li>Forbered perlens vaskebuffere. Lav buffer-1 ved hjælp af 0,1 M natriumphosphat ved ...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Mitokondrier er kritiske for cellulær metabolisme, homeostase og stressrespons, og deres dysfunktion er forbundet med mange sygdomme, herunder nyresygdom. Mitokondrier har en rolle i den patologiske generering af overdreven reaktiv iltart (ROS), reguleringen af intracellulære calciumniveauer, celledødsveje og cytoskeletal dynamik21,22,23.
Isoleringen af murine GEC'er er udfordrende på grund af der...

Glomerulus er kritisk for blodfiltrering ved at begrænse passagen af store molekyler gennem den glomerulære filtreringsbarriere 1,2. Glomerulus indeholder fire celletyper: parietale epitelceller, podocytter (viscerale epitelceller), glomerulære endotelceller (GEC) og mesangialceller3. Det glomerulære endotel er kendetegnet ved en unik vaskulær struktur i henhold til tilstedeværelsen af fenestrae, der kræves til store filtreringsvolumener4. Den apikale overflade af det glomerulære endotel er dækket af et negativt ladet glycocalyxlag og et lag kaldet endoteloverfladelaget, der skaber et mellemrum mellem endotelet og blodet. Denne struktur tilvejebringer høj ladningsselektivitet, der begrænser passagen af negativt ladede molekyler såsom albumin og forhindrer leukocyt- og blodpladeadhæsion5.
GEC'er er meget følsomme over for metaboliske ændringer, såsom hyperglykæmi forbundet med diabetisk miljø. Faktisk fører diabetes til øget cirkulation af skadelige stoffer, mætning af glukosemetabolismeveje og forstyrret cellulær redoxbalance 3,6. Desuden inducerer stigningen i reaktive iltarter mitokondriel dysfunktion, som påvirker endotelfunktionen7.
Det overordnede mål med den nuværende protokol er at isolere udødeliggjorte glomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondriefunktioner. Faktisk har cellekulturen af primære GEC'er en begrænset proliferativ cyklus og tidlig ældning8. Derudover hjælper tilstedeværelsen af fluorescerende mitokondrier med at undersøge fissions- og fusionshændelser som reaktion på hyperglykæmi eller anden behandling. Som en alternativ metode brugte andre laboratorier h-TERT til at udødeliggøre celler in vitro9.
Metoden beskrevet her tillader isolering af betinget udødeliggjort mitoDendra2 glomerulære endotelceller fra 4-6 uger gamle dyr (figur 1). Denne detaljerede protokol beskriver brugen af transgene mus (H-2K b-tsA58), der huser simianvirus 40 stort tumorantigen (SV40 TAg) gen10,11 til generering af termolabile betinget udødeliggjorte celler. TsA58 TAg-genproduktet er funktionelt ved den tilladte temperatur på 33 °C under kontrol af den inducerbare 5' flankerende promotor af musens H-2Kb-gen, som øges over basale niveauer ved eksponering for interferon gamma (IFNγ), og opretholder derfor den betingede proliferationsfænotype12. H-2Kb nedbrydes hurtigt ved den ikke-tilladte temperatur på 37 °C i fravær af IFNγ, hvilket fjerner den udødeliggørende funktion af tsA58Tag i celler og gør det muligt for cellerne at udvikle en mere differentieret fænotype13,14,15. Valgfri krydsning af H-2Kb-tsA58 transgene mus med PhAM-mus, som udtrykker en mitokondrie-specifik (underenhed VIII af cytokrom c oxidase) Dendra2-grøn, tillader levende påvisning af fluorescerende mitokondrier16. Dendra2 grøn fluorescens skifter til rød fluorescens efter eksponering for en 405 nm laser16. Når mitokondrier smelter sammen efter fotoskift, danner de aflange former, der ser gule ud fra udveksling af grønt og gult materiale eller ser røde ud, når de gennemgår fission 7,17. MitoDendra2-GEC'erne er et godt værktøj til at studere de cellulære reaktioner fra GEC-mitokondrier på forskellige stimuli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Glomerulær endotelcelle (GEC) dysfunktion kan initiere og bidrage til glomerulær filtreringsbarrierenedbrydning. Øget mitokondriel oxidativ stress er blevet foreslået som en mekanisme, der resulterer i GEC-dysfunktion i patogenesen af nogle glomerulære sygdomme. Historisk set har isoleringen af GEC'er fra in vivo-modeller været notorisk udfordrende på grund af vanskeligheder med at isolere rene kulturer fra glomeruli. GEC'er har komplekse vækstkrav in vitro og en meget begrænset levetid. Her beskriver vi proceduren for isolering og dyrkning betinget udødeliggjorte GEC'er med fluorescerende mitokondrier, hvilket muliggør sporing af mitokondriefission og fusionshændelser. GEC'er blev isoleret fra nyrerne hos en dobbelt transgen mus, der udtrykte den termolabile SV40 TAg (fra Immortomouse), betinget fremme proliferation og undertrykkelse af celledifferentiering og et fotokonvertibelt fluorescerende protein (Dendra2) i alle mitokondrier (fra den fotoaktiverbare mitokondrier [PhAMudskåret] mus). Den genererede stabile cellelinje giver mulighed for celledifferentiering efter inaktivering af det udødeliggørende SV40 TAg-gen og fotoaktivering af en delmængde af mitokondrier, der forårsager en skift i fluorescens fra grøn til rød. Brugen af mitoDendra2-GEC'er giver mulighed for levende billeddannelse af fluorescerende mitokondriers fordeling, fusion og fissionshændelser uden at farve cellerne.

I denne artikel beskrives en detaljeret protokol til isolering af betinget udødeliggjorte glomerulære endotelceller med stabile fluorescerende mitokondrier (mitoDendra2-GEC'er) (figur 1). Brugen af unge 6-10 uger gamle mus er afgørende for at opnå et betydeligt antal sunde celler. Efter 3 dages dyrkning begynder cellerne at vokse langsomt fra de isolerede glomeruli, som vist i figur 3G. Efter 7 dage er cellerne heterogene og viser andre glomerulære celletyp...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Artiklen beskriver metoden til isolering af betinget udødeliggjorte glomerulære endotelceller fra nyrerne hos transgene mus, der udtrykker den termolabile simianvirus 40 og fotoaktiverbare mitokondrier, PhAMudskåret. Vi beskriver proceduren for glomeruli-isolering fra hele nyrer ved hjælp af perler, fordøjelsestrin, såning og dyrkning af GECs-CD31-positive.

Isolering af betinget udødeliggjorte museglomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrier

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Udødeliggjorte glomerulære endotelceller med stabile fluorescerende mitokondrier er et godt værktøj til at undersøge effekten af forskellige stimuli på mitokondriestruktur in vitro. Den beskrevne metode i den aktuelle artikel giver et stort antal glomerulære endotelceller. Ved at teste små molekyler på en GEC kunne vi screene for monoterapi for diabetisk nyresygdom, hvor GEC'erne påvirkes.Den beskrevne metode er let at udføre og kræver ikke specifikt udstyr. Det er dog vigtigt at følge de beskrevne trin og sterilisere udstyret for at undgå forurening. Til at begynde med skal du placere de perfusions- og isoleringsmaterialer, der kræves for at isolere nyreglomerulære celler på et arbejdsområde.Filtrer den frisklavede Hanks'Balanced Salt Solution, eller HBSS, med et filter på 0,2 mikron, og hold den under emhætten for at undgå forurening. Bland derefter 200 mikroliter magnetiske perler med 20 ml HBSS. Forvarm RPMI med 10% FCS og endotelcellekulturmedium i et vandbad ved 37 grader Celsius.Derefter forcoat to brønde af en seks-brønd plade med to milliliter 10 mikrogram per milliliter kollagen IV i 45 minutter ved stuetemperatur. Pladen vaskes to gange med PBS for at fjerne eddikesyren, der bruges til at fortynde kollagenet. Brug de overtrukne plader med det samme, eller opbevar dem ved to til otte grader Celsius i op til fire uger.Rengør de kirurgiske instrumenter og arbejdsområdet med 70% ethanol. Derefter autoklaver de kirurgiske instrumenter i 30 minutter. Efter åbning af maven på en bedøvet mus, indsæt en sommerfuglnål i venstre ventrikel.For at injicere 100 mikroliter af perleopløsningen for at udvide blodcirkulationen skal du forsigtigt bryde den ringere vena cava under nyrerne med en 19-gauge nål og fortsætte perfusionen af perleopløsningen. Fjern derefter forsigtigt fedtvævet med pincet, skær begge nyrer med tynd kirurgisk saks C, og læg dem på en tallerken med en milliliter HBSS på is. Hak nyrerne med en steril skalpel i en millimeter små stykker.Inkuber den hakkede nyre med en millimeter frisklavet collagenase type II i 35 minutter ved 37 grader Celsius med blid hældning på en vandret ryster. Efter fordøjelsen tilsættes fire milliliter RPMI med 10% FBS for at neutralisere collagenasen. Filtrer det fordøjede væv gennem en steril 100 mikron celle sil i et 50 milliliter rør.Brug bunden af et sterilt 1,5 milliliter rør til at røre det fordøjede væv mod silen, så glomeruli kan gå igennem. Skyl cellesilen med 15 ml HBSS. Derefter centrifugeres gennemstrømningen ved 200 XG i fem minutter ved stuetemperatur.På dette stadium indeholder røret tre lag. Det øverste lag indeholder mindre strukturer såsom rør, mellemlaget er perler med glomeruli, og bundlaget indeholder snavs. Opsæt forsigtigt supernatanten og det øverste hvide lag.Derefter resuspenderes pelleten indeholdende perler, der bærer glomeruli og snavs i 1,5 ml HBSS, og overfør den til et to milliliter rør. Anbring røret i en magnetisk koncentrator og opsug supernatanten, før du vasker perlerne to gange med en milliliter HBSS. Placer 20 mikroliter cellesuspension på et dias.Overhold derefter diaset under et mikroskop for glomerulis tilstedeværelse. Derefter resuspenderes pelleten i et endotelcellevækstmedium og overfører suspensionen til et to-milliliter rør. Tilsæt en mikroliter interferon gamma for hver tre milliliter medium, og læg cellerne i en seks-brønds plade til inkubation ved 33 grader Celsius.Efter tre dages kultur skal du forsigtigt udskifte det ene milliliter medium med et frisk medium. På dette stadium er cellerne heterogene med en blanding af glomerulære celler. Efter syv dage udskiftes mediet med to milliliter frisk endotelcellevækstmedium suppleret med interferon gamma for at starte cellernes spredning.Efter 10 dage, når cellerne når 80% sammenløb, passage dem ved hjælp af trypsin og overføre dem til en T-25 kolbe belagt med kollagen IV.Efter 21 dages kultur overføres celler til en T-75 kolbe. Tilsæt tre milliliter 0,25% trypsin til en T-75 kolbe og inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i fem minutter. Derefter neutraliseres trypsinen med tre milliliter endotelvækstmedium og overfører suspensionen til et 15 milliliter rør til centrifugering ved 200 XG i fem minutter.Supernatanten aspireres og cellerne vaskes i en milliliter PBS indeholdende 1% BSA, to-millimolar EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Igen centrifugeres og resuspenderes pelleten i 200 mikroliter CD31-antistofbelagte perler og 800 mikroliter PBS. Inkuber cellerne i 45 minutter med kontinuerlig omrystning ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Placer derefter røret i den magnetiske koncentrator og vask cellerne fire gange med PBS indeholdende BSA, EDTA og penicillin / streptomycin. Efter den sidste vask resuspenderes cellerne i tre milliliter endotelvækstmedium suppleret med interferon gamma. Plade 1,5 ml celler pr. brønd i kollagen IV-belagte brønde på en seks-brønds plade og kultur under tilladelige forhold ved 33 grader Celsius.Efter fire dage udskiftes 750 mikroliter af mediet med et frisk endotelvækstmedium suppleret med interferon gamma. Efter 10 til 14 dages kultur, ved hjælp af et epifluorescensmikroskop med et 488-nanometer filter, observeres for dyrkning af CD31-positive glomerulære endotelceller eller GEC'er, kolonier, der udtrykker fluorescerende mitokondrier. Efter 21 dage, eller når cellerne har nået 80 til 90% sammenløb, overføres dem til en T-25 kolbe.Bevar kulturen med et RPMI-vækstmedium, der indeholder 10% FCS. Alternativt kan celler kryopræserveres. Passage celler ved hjælp af trypsin, som vist tidligere.Derefter centrifugeres cellerne, og pelleten resuspenderes i tre milliliter frysemedium. Aliquot cellerne i cryorør og opbevar dem i flydende nitrogen, damptemperatur. Denne protokol beskrev en metode til isolering af glomerulære endotelceller.Fra de isolerede glomeruli begyndte celler at vokse langsomt efter tre dages kultur. Efter syv dage syntes celler heterogene og viste andre glomerulære celletyper, såsom podocytter, parietal-, epitel- og mesangialceller. Efter at have nået 70 til 80% sammenløb blev andre glomerulære celler fjernet ved hjælp af et positivt udvalg af endotelceller.MitoDendra2 GEC'erne udtrykte CD31 og var negative for podocytmarkør, som vist ved synaptopodinnegativ farvning. Effekten af glukosekoncentration på mitokondristrukturen blev undersøgt. Sammenlignet med de aflange mitokondrier, der er synlige i celler under normal glucose, induceret fragmentering med høj glukose eller fission af mitokondrier, som observeret af fremtrædende sfæroideaformede mitokondrier.Desuden blev en 405-nanometer laser brugt til at fotokonvertere en udvalgt delpopulation af mitokondrier i en enkelt levende MitoDendra2 GEC. En vellykket fotoskift af mitokondrier fra grøn til rød i det valgte område for normale og høje glukosekoncentrationsbehandlede celler vises. Dette skift gjorde det muligt at være vidne til fusionsbegivenhederne i MitoDendra2 GEC'er.Under normal glukose blev gul fusioneret grøn og rød fluorescens observeret på grund af mitokondrier matrixfusion. I modsætning hertil var mitokondrierne hovedsageligt fragmenterede i de højt glukosebehandlede GEC'er. Placering af cellerne i en brønd med seks brønde med et lille volumen vækstmedium er afgørende for at lade cellerne fastgøres til skålen.De isolerede endotelceller kunne bruges til at udføre mitokondriefunktion og strukturelle undersøgelser. Brugen af udødeliggjorte endotelceller med fluorescerende mitokondrier vil bane vejen for lægemiddelopdagelse. De små molekyler kunne testes på cellerne, og der udføres levende billeddannelse for at undersøge deres virkning på mitokondriernes funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering af embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering af microvaskulæreendothelial Tubes fra Mouse modstandskar

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolering af mRNA&#39;er associeret med Gær Mitokondrier at studere Mekanismer af lokaliserede Oversættelse

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering og funktionel analyse af mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...