Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

De auteurs bedanken professor Cijiang He en Dr. Fu Jia voor hun inzichten in muizen endotheelcelisolatie en bedanken professor Mone Zaidi voor het verstrekken van dePhAM-weggesneden muizen en waardevolle discussies. De auteurs willen ook de Microscopie CORE aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en het personeel bedanken voor de begeleiding die we hebben ontvangen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van National Institutes of Health grant R01DK097253 en Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 aan I.S.D.

Alle hier beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. We gebruikten drie mannelijke muizen (H-2Kb-tsA58 transgene muizen met foto-activeerbare mitochondriën [PhAM]) gekocht bij Jackson lab en hielden een normaal chow-dieet.
1. Arbeidsomstandigheden en voorbereidingen
<ol><li>Reinig de werkruimte in de laminaire stromingskap met 70% ethanol en UV-C-licht.</li>
	<li>Bereid de wasbuffers van de kraal voor. Maak bu...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Mitochondriën zijn van cruciaal belang voor cellulair metabolisme, homeostase en stressreacties, en hun disfunctie is gekoppeld aan vele ziekten, waaronder nierziekten. Mitochondriën spelen een rol bij de pathologische generatie van overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS), de regulatie van intracellulaire calciumspiegels, celdoodroutes en cytoskeletale dynamica 21,22,23.
De isolatie van muizengel...

De glomerulus is van cruciaal belang voor bloedfiltratie door de doorgang van grote moleculen door de glomerulaire filtratiebarrièrete beperken 1,2. De glomerulus bevat vier celtypen: pariëtale epitheelcellen, podocyten (viscerale epitheelcellen), glomerulaire endotheelcellen (GEC) en mesangiale cellen3. Het glomerulaire endotheel wordt gekenmerkt door een unieke vasculaire structuur, volgens de aanwezigheid van fenestrae die nodig is voor grote filtratievolumes4. Het apicale oppervlak van het glomerulaire endotheel is bedekt met een negatief geladen glycocalyxlaag en een laag die de endotheeloppervlaklaag wordt genoemd en die een ruimte creëert tussen het endotheel en bloed. Deze structuur biedt een selectiviteit met een hoge lading die de doorgang van negatief geladen moleculen zoals albumine beperkt en leukocyten- en bloedplaatjesadhesievoorkomt 5.
GEC's zijn erg gevoelig voor metabole veranderingen, zoals de hyperglycemie geassocieerd met het diabetische milieu. Inderdaad, diabetes leidt tot een verhoogde circulatie van schadelijke stoffen, de verzadiging van glucosemetabolismeroutes en een verstoorde cellulaire redoxbalans 3,6. Bovendien induceert de toename van reactieve zuurstofsoorten mitochondriale disfunctie, die de endotheelfunctie beïnvloedt7.
Het algemene doel van het huidige protocol is om onsterfelijk gemaakte glomerulaire endotheelcellen te isoleren met fluorescerende mitochondriale kenmerken. Inderdaad, de celcultuur van primaire GEC's heeft een beperkte proliferatieve cyclus en vroege senescentie8. Bovendien helpt de aanwezigheid van fluorescerende mitochondriën bij het onderzoeken van splijtings- en fusiegebeurtenissen als reactie op hyperglykemie of een andere behandeling. Als alternatieve methode gebruikten andere laboratoria h-TERT om cellen in vitro te vereeuwigen 9.
De hier beschreven methode maakt de isolatie mogelijk van voorwaardelijk vereeuwigde mitoDendra2 glomerulaire endotheelcellen van 4-6 weken oude dieren (figuur 1). Dit gedetailleerde protocol beschrijft het gebruik van transgene muizen (H-2K b-tsA58) die het simian virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg) gen10,11 herbergen voor het genereren van thermolabiele voorwaardelijk vereeuwigde cellen. Het tsA58 TAg-genproduct is functioneel bij de permissieve temperatuur van 33 °C onder controle van de induceerbare 5'-flankerende promotor van het H-2Kb-gen van de muis, dat bij blootstelling aan interferongamma (IFNγ) boven basale niveaus wordt verhoogd, waardoor het voorwaardelijke proliferatiefenotype12 behouden blijft. H-2Kb wordt snel afgebroken bij de niet-permissieve temperatuur van 37 °C in afwezigheid van IFNγ, waardoor de onsterfelijkheidsfunctie van de tsA58Tag in cellen wordt verwijderd en de cellen een meer gedifferentieerd fenotype 13,14,15 kunnen ontwikkelen. Optionele kruising van H-2Kb-tsA58 transgene muizen met PhAM-muizen, die een mitochondria-specifieke (subeenheid VIII van cytochroom c-oxidase) Dendra2-green tot expressie brengen, maakt de live detectie van fluorescerende mitochondriënmogelijk 16. Dendra2 groene fluorescentie schakelt over naar rode fluorescentie na blootstelling aan een 405 nm laser16. Wanneer mitochondriën fuseren na het wisselen van foto's, vormen ze langwerpige vormen die geel lijken door de uitwisseling van groen en geel materiaal of rood lijken wanneer ze splijting ondergaan 7,17. De mitoDendra2-GEC's zijn een geweldig hulpmiddel voor het bestuderen van de cellulaire reacties van GEC-mitochondriën op verschillende stimuli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Glomerulaire endotheelcel (GEC) disfunctie kan glomerulaire filtratiebarrièreafbraak initiëren en eraan bijdragen. Verhoogde mitochondriale oxidatieve stress is gesuggereerd als een mechanisme dat resulteert in GEC-disfunctie in de pathogenese van sommige glomerulaire ziekten. Historisch gezien is de isolatie van GEC's van in vivo modellen notoir uitdagend vanwege moeilijkheden bij het isoleren van zuivere culturen uit glomeruli. GEC's hebben complexe groeivereisten in vitro en een zeer beperkte levensduur. Hier beschrijven we de procedure voor het isoleren en cultiveren van voorwaardelijk vereeuwigde GEC's met fluorescerende mitochondriën, waardoor mitochondriale splijting en fusiegebeurtenissen kunnen worden gevolgd. GEC's werden geïsoleerd uit de nieren van een dubbele transgene muis die de thermolabiele SV40 TAg (van de Immortomouse) tot expressie bracht, voorwaardelijk proliferatie bevorderde en celdifferentiatie onderdrukte, en een foto-converteerbaar fluorescerend eiwit (Dendra2) in alle mitochondriën (van de foto-activeerbare mitochondriën [PhAMweggesneden] muis). De gegenereerde stabiele cellijn maakt celdifferentiatie mogelijk na inactivatie van het vereeuwigende SV40 TAg-gen en fotoactivering van een subset van mitochondriën die een omschakeling in fluorescentie van groen naar rood veroorzaken. Het gebruik van mitoDendra2-GEC's maakt live beeldvorming mogelijk van de distributie, fusie en splijting van fluorescerende mitochondriën zonder de cellen te kleuren.

In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de isolatie van voorwaardelijk onsterfelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen met stabiele fluorescerende mitochondriën (mitoDendra2-GEC's) (figuur 1). Het gebruik van jonge muizen van 6-10 weken oud is essentieel om een aanzienlijk aantal gezonde cellen te verkrijgen. Na 3 dagen kweken beginnen cellen langzaam te groeien uit de geïsoleerde glomeruli, zoals weergegeven in figuur 3G. Na 7 da...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Het artikel beschrijft de methode voor het isoleren van voorwaardelijk onsterfelijke glomerulaire endotheelcellen uit de nieren van transgene muizen die het thermolabiele simianvirus 40 en foto-activeerbare mitochondriën tot expressie brengen, PhAMweggesneden. We beschrijven de procedure voor glomeruli-isolatie van hele nieren met behulp van kralen, spijsverteringsstappen, zaaien en kweken van GECs-CD31-positief.

Isolatie van voorwaardelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen van de muis met fluorescerende mitochondriën

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Onsterfelijk gemaakte glomerulaire endotheelcellen met stabiele fluorescerende mitochondriën zijn een geweldig hulpmiddel om het effect van verschillende stimuli op de mitochondriale structuur in vitro te onderzoeken. De beschreven methode in het huidige artikel levert een hoog aantal glomerulaire endotheelcellen op. Door kleine moleculen op een GEC te testen, konden we screenen op monotherapie voor diabetische nierziekte waarbij de GEC's worden aangetast.De beschreven methode is eenvoudig uit te voeren en vereist geen specifieke apparatuur. Het is echter belangrijk om de beschreven stappen te volgen en de apparatuur te steriliseren om besmetting te voorkomen. Plaats om te beginnen de perfusie- en isolatiematerialen die nodig zijn om nierglomerulaire cellen op een werkruimte te isoleren.Filter de vers bereide Hanks'Balanced Salt Solution, of HBSS, met een filter van 0,2 micron en bewaar deze onder de motorkap om besmetting te voorkomen. Meng vervolgens 200 microliter magnetische kralen met 20 milliliter HBSS. Prewarm de RPMI met 10% FCS en endotheelcelkweekmedium in een waterbad bij 37 graden Celsius.Vervolgens, pre-coat twee putten van een zes-well plaat met twee milliliter van 10 microgram per milliliter collageen IV gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was de plaat twee keer met PBS om het azijnzuur te verwijderen dat wordt gebruikt om het collageen te verdunnen. Gebruik de gecoate platen onmiddellijk, of bewaar ze bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal vier weken.Reinig de chirurgische instrumenten en werkruimte met 70% ethanol. Autoclaaf vervolgens de chirurgische instrumenten gedurende 30 minuten. Na het openen van de buik van een verdoofde muis, steekt u een vlindernaald in de linker ventrikel.Om 100 microliter van de kraaloplossing te injecteren om de bloedcirculatie uit te breiden, breekt u voorzichtig de inferieure vena cava onder de nieren met een naald van 19 gauge en zet u de perfusie van de kraaloplossing voort. Verwijder vervolgens voorzichtig het vetweefsel met een pincet, snijd beide nieren weg met een dunne chirurgische schaar C en leg ze op een bord met één milliliter HBSS op ijs. Gehakt de nier met een steriel scalpel in kleine stukjes van een millimeter.Incubeer de gehakte nier met een millimeter vers bereid collagenase type II gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius met zacht kantelen op een horizontale shaker. Voeg na de spijsvertering vier milliliter RPMI toe met 10% FBS om het collagenase te neutraliseren. Filter het verteerde weefsel door een steriele 100-micron celzeef in een buis van 50 milliliter.Gebruik de bodem van een steriele buis van 1,5 milliliter om het verteerde weefsel tegen de zeef te roeren, zodat de glomeruli erdoorheen kunnen. Spoel de celzeef af met 15 milliliter HBSS. Centrifugeer vervolgens de doorstroom op 200 XG gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.In dit stadium bevat de buis drie lagen. De bovenste laag bevat kleinere structuren zoals buisjes, de middelste laag is kralen met glomeruli en de onderste laag bevat puin. Zuig het supernatant en de bovenste witte laag voorzichtig aan.Resuspendeer vervolgens de pellet met kralen die de glomeruli en het puin dragen in 1,5 milliliter HBSS en breng het over in een buis van twee milliliter. Plaats de buis in een magnetische concentrator en aspirateer het supernatant voordat u de kralen twee keer wast met één milliliter HBSS. Plaats 20 microliter celsuspensie op een dia.Observeer vervolgens de dia onder een microscoop voor de aanwezigheid van glomeruli. Resuspendeer vervolgens de pellet in een endotheelcelgroeimedium en breng de suspensie over naar een buis van twee milliliter. Voeg één microliter interferon gamma toe voor elke drie milliliter medium en plaats de cellen in een zes-well plaat voor incubatie bij 33 graden Celsius.Vervang na drie dagen kweken voorzichtig het ene millilitermedium door een vers medium. In dit stadium zijn de cellen heterogeen met een mengsel van glomerulaire cellen. Vervang na zeven dagen het medium door twee milliliter vers endotheelcelgroeimedium, aangevuld met interferon gamma om de proliferatie van cellen te starten.Na 10 dagen, wanneer de cellen 80% confluency bereiken, passeer ze met behulp van trypsine en breng ze over in een T-25-kolf bedekt met collageen IV.Na 21 dagen cultuur, breng cellen over naar een T-75 kolf. Voeg drie milliliter van 0,25% trypsine toe aan een T-75 kolf en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Neutraliseer vervolgens het trypsine met drie milliliter endotheelgroeimedium en breng de suspensie over naar een buis van 15 milliliter voor centrifugatie bij 200 XG gedurende vijf minuten.Aspirateer het supernatant en was de cellen in één milliliter PBS met 1% BSA, twee millimolaire EDTA, 1% penicilline / streptomycine. Nogmaals, centrifugeer en resuspendeer de pellet in 200 microliter CD31 antilichaam gecoate kralen en 800 microliter PBS. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten met continu schudden bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Plaats vervolgens de buis in de magnetische concentrator en was de cellen vier keer met PBS die BSA, EDTA en penicilline / streptomycine bevatten. Na de laatste wasbeurt resuspenseren de cellen in drie milliliter endotheelgroeimedium, aangevuld met interferon gamma. Plaat 1,5 milliliter cellen per put in collageen IV gecoate putten op een zes-well plaat en cultuur onder permissieve omstandigheden bij 33 graden Celsius.Vervang na vier dagen 750 microliter van het medium door een vers endotheelgroeimedium, aangevuld met interferon gamma. Na 10 tot 14 dagen cultuur, met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een filter van 488 nanometer, observeer voor het kweken van CD31-positieve glomerulaire endotheelcel, of GEC's, kolonies die fluorescerende mitochondriën tot expressie brengen. Na 21 dagen, of wanneer de cellen 80 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt, breng ze over in een T-25 kolf.Onderhoud de cultuur met een RPMI-groeimedium dat 10% FCS bevat. Als alternatief kunnen cellen worden gecryopreserveerd. Passagecellen met trypsine, zoals eerder aangetoond.Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspeneer de pellet in drie milliliter vriesmedium. Aliquot de cellen in cryobuizen en sla ze op in vloeibare stikstof, damptemperatuur. Dit protocol beschreef een methode voor de isolatie van glomerulaire endotheelcellen.Uit de geïsoleerde glomeruli begonnen cellen langzaam te groeien na drie dagen kweken. Na zeven dagen leken cellen heterogeen en vertoonden andere glomerulaire celtypen, zoals podocyten, pariëtale, epitheliale en mesangiale cellen. Na het bereiken van 70 tot 80% confluency werden andere glomerulaire cellen verwijderd met behulp van een positieve selectie van endotheelcellen.De MitoDendra2 GEC's brachten CD31 tot expressie en waren negatief voor podocytmarker, zoals blijkt uit synaptopodine negatieve kleuring. Het effect van glucoseconcentratie op de mitochondriale structuur werd onderzocht. Vergeleken met de langwerpige mitochondriën die zichtbaar zijn in cellen onder normale glucose, veroorzaakte hoge glucose fragmentatie of splijting van mitochondriën, zoals waargenomen door prominente sferoïde gevormde mitochondriën.Bovendien werd een laser van 405 nanometer gebruikt om een geselecteerde subpopulatie van mitochondriën in een enkele levende MitoDendra2 GEC te fotoconverteren. Een succesvolle fotoswitching van mitochondriën van groen naar rood in het geselecteerde gebied voor met normale en hoge glucoseconcentratie behandelde cellen wordt getoond. Deze omschakeling maakte het mogelijk om getuige te zijn van de fusiegebeurtenissen in MitoDendra2 GEC's.Onder normale glucose werden geel samengevoegde groene en rode fluorescentie waargenomen als gevolg van mitochondriale matrixfusie. In de met hoge glucose behandelde GEC's daarentegen waren de mitochondriën voornamelijk gefragmenteerd. Het plaatsen van de cellen in een put van zes putten plaat met een klein volume groeimedium is essentieel om de cellen aan het gerecht te laten hechten.De geïsoleerde endotheelcellen kunnen worden gebruikt om mitochondriale functie- en structurele studies uit te voeren. Het gebruik van vereeuwigde endotheelcellen met fluorescerende mitochondriën zal de weg vrijmaken voor het ontdekken van geneesmiddelen. De kleine moleculen kunnen op de cellen worden getest en live beeldvorming wordt uitgevoerd om hun effect op de mitochondriale functie te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolatie en Cultuur van Pulmonary endotheelcellen van neonatale muizen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...