Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
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Die Autoren danken Professor Cijiang He und Dr. Fu Jia für ihre Einblicke in die Endothelzellisolierung von Mäusen und danken Professor Mone Zaidi für die Bereitstellung der von PhAMausgeschnittenen Mäuse und wertvolle Diskussionen. Die Autoren möchten auch dem Microscopy CORE an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai und den Mitarbeitern für die Beratung danken, die wir erhalten haben. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institutes of Health Grant R01DK097253 und des Department of Defense CDMRP Grant E01 W81XWH2010836 an I.S.D. unterstützt.

Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der IACUC an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai genehmigt. Wir verwendeten drei männliche Mäuse (H-2Kb-tsA58 transgene Mäuse mit photoaktivierbaren Mitochondrien [PhAM]), die im Jackson-Labor gekauft wurden, und behielten eine normale Chow-Diät bei.
1. Arbeitsbedingungen und Vorbereitungen
<ol><li>Reinigen Sie den Arbeitsbereich in der Laminar-Flow-Haube mit 70% Ethanol und UV-C-Licht.</li>
	<li>Bereiten Sie die Wa...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Mitochondrien sind entscheidend für den Zellstoffwechsel, die Homöostase und Stressreaktionen, und ihre Dysfunktion ist mit vielen Krankheiten verbunden, einschließlich Nierenerkrankungen. Mitochondrien spielen eine Rolle bei der pathologischen Erzeugung übermäßiger reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Regulation des intrazellulären Kalziumspiegels, der Zelltodwege und der Dynamik des Zytoskeletts21,22,23.
<p class=...

Der Glomerulus ist entscheidend für die Blutfiltration, indem er den Durchgang großer Moleküle durch die glomeruläre Filtrationsbarriere 1,2 einschränkt. Der Glomerulus enthält vier Zelltypen: parietale Epithelzellen, Podozyten (viszerale Epithelzellen), glomeruläre Endothelzellen (GEC) und mesangiale Zellen3. Das glomeruläre Endothel zeichnet sich durch eine einzigartige Gefäßstruktur aus, entsprechend dem Vorhandensein von Fenestrae, das für große Filtrationsvolumina erforderlich ist4. Die apikale Oberfläche des glomerulären Endothels ist mit einer negativ geladenen Glykokalyxschicht und einer Schicht bedeckt, die als endotheliale Oberflächenschicht bezeichnet wird und einen Raum zwischen dem Endothel und dem Blut schafft. Diese Struktur bietet eine hohe Ladungsselektivität, die den Durchgang von negativ geladenen Molekülen wie Albumin einschränkt und die Leukozyten- und Thrombozytenadhäsion verhindert5.
GECs reagieren sehr empfindlich auf metabolische Veränderungen, wie die Hyperglykämie im Zusammenhang mit dem diabetischen Milieu. Tatsächlich führt Diabetes zu einer erhöhten Zirkulation schädlicher Substanzen, zur Sättigung der Glukosestoffwechselwege und zu einem gestörten zellulären Redoxgleichgewicht 3,6. Darüber hinaus induziert die Zunahme der reaktiven Sauerstoffspezies eine mitochondriale Dysfunktion, die die Endothelfunktion beeinträchtigt7.
Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls ist es, immortalisierte glomeruläre Endothelzellen mit fluoreszierenden mitochondrialen Merkmalen zu isolieren. Tatsächlich hat die Zellkultur von primären GECs einen begrenzten proliferativen Zyklus und eine frühe Seneszenz8. Darüber hinaus hilft das Vorhandensein von fluoreszierenden Mitochondrien, Spalt- und Fusionsereignisse als Reaktion auf Hyperglykämie oder eine andere Behandlung zu untersuchen. Als alternative Methode verwendeten andere Labore h-TERT, um Zellen in vitro9 zu verewigen.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von bedingt immortalisierten mitoDendra2 glomerulären Endothelzellen aus 4-6 Wochen alten Tieren (Abbildung 1). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Verwendung transgener Mäuse (H-2K b-tsA58), die das Simian Virus 40 Large Tumor Antigen (SV40 TAg) Gen10,11 zur Erzeugung thermolabiler bedingt immortalisierter Zellen beherbergen. Das TSA58 TAg-Genprodukt ist bei der permissiven Temperatur von 33 °C unter der Kontrolle des induzierbaren 5'-flankierenden Promotors des Maus-H-2K-b-Gens funktionsfähig, der bei Exposition gegenüber Interferon gamma (IFNγ) über das Basalniveau erhöht ist, wodurch der bedingte Proliferationsphänotyp12 erhalten bleibt. H-2Kb wird bei der nicht-permissiven Temperatur von 37 °C in Abwesenheit von IFNγ schnell abgebaut, wodurch die immortalisierende Funktion des tsA58Tag in Zellen entfernt wird und die Zellen einen differenzierteren Phänotyp13,14,15 entwickeln können. Die optionale Kreuzung von H-2Kb-tsA58 transgenen Mäusen mit PhAM-Mäusen, die ein mitochondrienspezifisches (Untereinheit VIII der Cytochrom-c-Oxidase) Dendra2-grün exprimieren, ermöglicht den Live-Nachweis fluoreszierender Mitochondrien16. Die grüne Dendra2-Fluoreszenz schaltet nach Bestrahlung mit einem 405-nm-Laser16 auf rote Fluoreszenz um. Wenn Mitochondrien nach dem Photoswitching verschmelzen, bilden sie längliche Formen, die durch den Austausch von grünem und gelbem Material gelb erscheinen oder rot erscheinen, wenn sie einer Spaltung unterzogenwerden 7,17. Die mitoDendra2-GECs sind ein großartiges Werkzeug, um die zellulären Reaktionen von GEC-Mitochondrien auf verschiedene Reize zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Eine Dysfunktion der glomerulären Endothelzelle (GEC) kann den Abbau der glomerulären Filtrationsbarriere initiieren und dazu beitragen. Erhöhter mitochondrialer oxidativer Stress wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, der zu einer GEC-Dysfunktion in der Pathogenese einiger glomerulärer Erkrankungen führt. In der Vergangenheit war die Isolierung von GECs aus In-vivo-Modellen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Isolierung reiner Kulturen aus Glomeruli eine notorische Herausforderung. GECs haben komplexe Wachstumsanforderungen in vitro und eine sehr begrenzte Lebensdauer. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung bedingt immortalisierter GECs mit fluoreszierenden Mitochondrien, die die Verfolgung von mitochondrialen Spaltungs- und Fusionsereignissen ermöglichen. GECs wurden aus den Nieren einer doppelten transgenen Maus isoliert, die das thermolabile SV40 TAg (aus der Immortomaus) exprimierte, was die Proliferation bedingt förderte und die Zelldifferenzierung unterdrückte, und einem photokonvertierbaren fluoreszierenden Protein (Dendra2) in allen Mitochondrien (aus der photoaktivierbaren Mitochondrien [PhAMexcised] Maus). Die erzeugte stabile Zelllinie ermöglicht eine Zelldifferenzierung nach Inaktivierung des immortalisierenden SV40 TAg-Gens und Photoaktivierung einer Untergruppe von Mitochondrien, was zu einem Wechsel der Fluoreszenz von Grün zu Rot führt. Die Verwendung von mitoDendra2-GECs ermöglicht die Live-Bildgebung der Verteilung, Fusion und Spaltung fluoreszierender Mitochondrien, ohne die Zellen zu färben.

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Endothelzellen mit stabilen fluoreszierenden Mitochondrien (mitoDendra2-GECs) beschrieben (Abbildung 1). Die Verwendung von jungen 6-10 Wochen alten Mäusen ist unerlässlich, um eine beträchtliche Anzahl gesunder Zellen zu erhalten. Nach 3 Tagen Kultur beginnen die Zellen langsam aus den isolierten Glomeruli zu wachsen, wie in Abbildung 3G gezeigt. Nach...

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Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Der Artikel beschreibt die Methode zur Isolierung bedingt immortalisierter glomerulärer Endothelzellen aus den Nieren transgener Mäuse, die das thermolabile Affenvirus 40 exprimieren, und photoaktivierbaren Mitochondrien, PhAMexcised. Wir beschreiben das Verfahren zur Glomeruli-Isolierung aus ganzen Nieren mittels Perlen, Verdauungsschritten, Aussaat und Kultivierung von GECs-CD31-positiv.

Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Maus-Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrien

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Immortalisierte glomeruläre Endothelzellen mit stabilen fluoreszierenden Mitochondrien sind ein großartiges Werkzeug, um die Wirkung verschiedener Reize auf die mitochondriale Struktur in vitro zu untersuchen. Die im vorliegenden Artikel beschriebene Methode liefert eine hohe Anzahl von glomerulären Endothelzellen. Durch das Testen kleiner Moleküle auf einem GEC könnten wir nach einer Monotherapie für diabetische Nierenerkrankungen suchen, bei denen die GECs betroffen sind.Die beschriebene Methode ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Es ist jedoch wichtig, die beschriebenen Schritte zu befolgen und die Ausrüstung zu sterilisieren, um eine Kontamination zu vermeiden. Um zu beginnen, legen Sie die Perfusions- und Isolierungsmaterialien, die erforderlich sind, um nierenglomeruläre Zellen zu isolieren, auf einen Arbeitsbereich.Filtern Sie die frisch zubereitete Hanks'Balanced Salt Solution (HBSS) mit einem 0,2-Mikron-Filter und bewahren Sie sie unter der Haube auf, um eine Kontamination zu vermeiden. Mischen Sie dann 200 Mikroliter Magnetperlen mit 20 Milliliter HBSS. Wärmen Sie das RPMI mit 10% FCS und Endothelzellkulturmedium im Wasserbad bei 37 Grad Celsius vor.Dann beschichten Sie zwei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit zwei Milliliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen IV für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platte zweimal mit PBS, um die Essigsäure zu entfernen, die zur Verdünnung des Kollagens verwendet wird. Verwenden Sie die beschichteten Platten sofort oder lagern Sie sie bis zu vier Wochen bei zwei bis acht Grad Celsius.Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Anschließend autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente für 30 Minuten. Nachdem Sie den Bauch einer anästhesierten Maus geöffnet haben, führen Sie eine Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel ein.Um 100 Mikroliter der Perlenlösung zu injizieren, um die Durchblutung zu erweitern, brechen Sie vorsichtig die untere Hohlvene unterhalb der Nieren mit einer 19-Gauge-Nadel und setzen Sie die Perfusion der Perlenlösung fort. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe mit einer Pinzette, schneiden beide Nieren mit einer dünnen chirurgischen Schere C heraus und legen Sie sie auf einen Teller mit einem Milliliter HBSS auf Eis. Zerkleinern Sie die Niere mit einem sterilen Skalpell in einen Millimeter kleine Stücke.Inkubieren Sie die gehackte Niere mit einem Millimeter frisch zubereiteter Kollagenase Typ II für 35 Minuten bei 37 Grad Celsius mit leichtem Kippen auf einem horizontalen Shaker. Nach der Verdauung fügen Sie vier Milliliter RPMI mit 10% FBS hinzu, um die Kollagenase zu neutralisieren. Filtern Sie das verdaute Gewebe durch ein steriles 100-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Verwenden Sie den Boden eines sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchens, um das verdaute Gewebe gegen das Sieb zu rühren, damit die Glomeruli durchgehen können. Spülen Sie das Zellsieb mit 15 Milliliter HBSS ab. Dann zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 200 XG für fünf Minuten bei Raumtemperatur.In diesem Stadium enthält die Röhre drei Schichten. Die obere Schicht enthält kleinere Strukturen wie Tubuli, die mittlere Schicht besteht aus Perlen mit Glomeruli und die untere Schicht enthält Trümmer. Den Überstand und die oberste weiße Schicht vorsichtig absaugen.Dann resuspendieren Sie das Pellet mit den Perlen mit den Glomeruli und Ablagerungen in 1,5 Milliliter HBSS und geben Sie es in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in einen magnetischen Konzentrator und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie die Perlen zweimal mit einem Milliliter HBSS waschen. 20 Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger geben.Beobachten Sie dann den Objektträger unter einem Mikroskop auf Glomerulis Anwesenheit. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Endothelzellwachstumsmedium und übertragen die Suspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie einen Mikroliter Interferon-Gamma für jeweils drei Milliliter Medium hinzu und legen Sie die Zellen zur Inkubation bei 33 Grad Celsius in eine Platte mit sechs Vertiefungen.Nach drei Tagen Kultur das Milliliter-Medium vorsichtig durch ein frisches Medium ersetzen. In diesem Stadium sind die Zellen heterogen mit einer Mischung von glomerulären Zellen. Ersetzen Sie das Medium nach sieben Tagen durch zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium für Endothelzellen, ergänzt mit Interferon gamma, um die Zellproliferation zu starten.Nach 10 Tagen, wenn die Zellen 80% erreichenKonfluenz, passieren Sie sie mit Trypsin und geben Sie sie in einen T-25-Kolben, der mit Kollagen IV beschichtet ist.Nach 21 Tagen Kultur werden die Zellen in einen T-75-Kolben überführt. Drei Milliliter 0,25% Trypsin in einen T-75-Kolben geben und die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann neutralisieren Sie das Trypsin mit drei Milliliter endothelialem Wachstumsmedium und überführen die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation bei 200 XG für fünf Minuten.Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS, das 1% BSA, zwei Millimolar EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin enthält. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern CD31-Antikörper-beschichteten Beads und 800 Mikrolitern PBS. Inkubieren Sie die Zellen für 45 Minuten mit kontinuierlichem Schütteln bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Als nächstes legen Sie das Röhrchen in den magnetischen Konzentrator und waschen Sie die Zellen viermal mit PBS, das BSA, EDTA und Penicillin / Streptomycin enthält. Nach dem letzten Waschgang resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter endothelialem Wachstumsmedium, ergänzt mit Interferon gamma. Platte 1,5 Milliliter Zellen pro Vertiefung in Kollagen IV beschichteten Vertiefungen auf einer Sechs-Well-Platte und Kultur unter permissiven Bedingungen bei 33 Grad Celsius.Ersetzen Sie nach vier Tagen 750 Mikroliter des Mediums durch ein frisches endotheliales Wachstumsmedium, ergänzt mit Interferon gamma. Nach 10 bis 14 Tagen Kultur beobachten Sie mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 488-Nanometer-Filter CD31-positive glomeruläre Endothelzellen oder GECs, Kolonien, die fluoreszierende Mitochondrien exprimieren. Nach 21 Tagen oder wenn die Zellen 80 bis 90% Konfluenz erreicht haben, werden sie in einen T-25-Kolben überführt.Pflegen Sie die Kultur mit einem RPMI-Wachstumsmedium, das 10% FCS enthält. Alternativ können Zellen kryokonserviert werden. Passage Zellen mit Trypsin, wie zuvor gezeigt.Dann zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter Gefriermedium. Aliquot die Zellen in Kryoröhren und speichern Sie sie in flüssigem Stickstoff, Dampftemperatur. Dieses Protokoll beschrieb eine Methode zur Isolierung von glomerulären Endothelzellen.Aus den isolierten Glomeruli begannen die Zellen nach drei Tagen Kultur langsam zu wachsen. Nach sieben Tagen erschienen die Zellen heterogen und zeigten andere glomeruläre Zelltypen wie Podozyten, parietale, epitheliale und mesangiale Zellen. Nach Erreichen einer Konfluenz von 70 bis 80% wurden andere glomeruläre Zellen unter Verwendung einer positiven Selektion von Endothelzellen entfernt.Die MitoDendra2 GECs exprimierten CD31 und waren negativ für Podozytenmarker, wie durch Synaptopodin-negative Färbung gezeigt. Die Wirkung der Glukosekonzentration auf die Mitochondrienstruktur wurde untersucht. Im Vergleich zu den länglichen Mitochondrien, die in Zellen unter normaler Glukose sichtbar sind, induzierte eine hohe Glukose die Fragmentierung oder Spaltung von Mitochondrien, wie sie von prominenten sphäroidförmigen Mitochondrien beobachtet wurde.Darüber hinaus wurde ein 405-Nanometer-Laser verwendet, um eine ausgewählte Subpopulation von Mitochondrien in ein einzelnes lebendes MitoDendra2 GEC zu photokonvertieren. Ein erfolgreicher Photoswitching der Mitochondrien von grün nach rot im ausgewählten Bereich für normal und mit hoher Glukosekonzentration behandelte Zellen wird gezeigt. Diese Umschaltung ermöglichte es, die Fusionsereignisse in MitoDendra2-GECs zu beobachten.Unter normaler Glukose wurden gelb verschmolzene grüne und rote Fluoreszenz aufgrund der Mitochondrienmatrixfusion beobachtet. Im Gegensatz dazu waren in den mit hoher Glukose behandelten GECs die Mitochondrien hauptsächlich fragmentiert. Das Platzieren der Zellen in einer Vertiefung mit sechs Vertiefungen mit einem kleinen Volumen an Wachstumsmedium ist unerlässlich, damit sich die Zellen an der Schale festsetzen können.Die isolierten Endothelzellen könnten verwendet werden, um mitochondriale Funktions- und Strukturstudien durchzuführen. Die Verwendung von immortalisierten Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrienmerkmalen wird den Weg zur Wirkstoffforschung ebnen. Die kleinen Moleküle könnten an den Zellen getestet werden, und Live-Bildgebung wird durchgeführt, um ihre Wirkung auf die Funktion der Mitochondrien zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...