Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

המחברים מודים לפרופסור צ'יג'יאנג הוא ולד"ר פו ג'יה על התובנות שלהם בבידוד תאי אנדותל בעכברים ומודים לפרופסור מונה זיידי על שסיפקו את העכבריםשנכרתו על ידי PhAM ודיונים חשובים. המחברים רוצים גם להודות למיקרוסקופיה CORE בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני ולצוות על ההדרכה שקיבלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות מענק R01DK097253 ומענק CDMRP של משרד ההגנה E01 W81XWH2010836 ל- I.S.D.

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. השתמשנו בשלושה עכברים זכרים (H-2Kb-tsA58 עכברים מהונדסים עם מיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAM]) שנרכשו ממעבדת ג'קסון ושמרנו על דיאטת צ'או רגילה.
1. תנאי עבודה והכנות
<ol><li>נקו א?...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

מיטוכונדריה חיונית לחילוף החומרים בתאים, להומאוסטזיס ולתגובות סטרס, ותפקוד לקוי שלהם קשור למחלות רבות, כולל מחלות כליות. למיטוכונדריה יש תפקיד ביצירה הפתולוגית של מיני חמצן תגובתי יתר (ROS), בוויסות רמות הסידן התוך-תאי, במסלולי המוות של התאים ובדינמיקה הציטוסקטלית 21,22,23.<s...

הגלומרולוס חיוני לסינון הדם על ידי הגבלת המעבר של מולקולות גדולות דרך מחסום הסינון הגלומרולרי 1,2. הגלומרולוס מכיל ארבעה סוגי תאים: תאי אפיתל קודקודיים, פודוציטים (תאי אפיתל קרביים), תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) ותאים מסנגיאליים3. האנדותל הגלומרולרי מאופיין במבנה כלי דם ייחודי, בהתאם לנוכחות של fenestrae הנדרשת לנפחי סינון גדולים4. המשטח האפיקלי של האנדותל הגלומרולרי מכוסה בשכבת גליקוקליקס טעונה שלילית ובשכבה הנקראת שכבת פני השטח של האנדותל היוצרת רווח בין האנדותל לדם. מבנה זה מספק סלקטיביות מטען גבוהה המגבילה את המעבר של מולקולות טעונות שלילית כגון אלבומין ומניעת הידבקות לויקוציטים וטסיות דם5.
GECs רגישים מאוד לשינויים מטבוליים, כגון היפרגליקמיה הקשורה לסביבה הסוכרתית. ואכן, סוכרת מובילה לזרימת דם מוגברת של חומרים רעילים, לרוויה של מסלולי חילוף החומרים של הגלוקוז ולהפרעה במאזן החיזור התאי 3,6. יתר על כן, העלייה בכמות החמצן הריאקטיבי גורמת לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמשפיע על תפקוד האנדותל7.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד תאי אנדותל גלומרולריים מונצחים עם תכונות מיטוכונדריאליות פלואורסצנטיות. ואכן, לתרבית התאים של GECs ראשוניים יש מחזור התפשטות מוגבל וסנסנציה מוקדמת8. בנוסף, נוכחות של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מסייעת לבחון אירועי ביקוע ואיחוי בתגובה להיפרגליקמיה או כל טיפול אחר. כשיטה חלופית, מעבדות אחרות השתמשו ב-h-TERT כדי להנציח תאים במבחנה9.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת בידוד של תאי האנדותל הגלומרולריים mitoDendra2 המונצחים מותנה מחיות בנות 4-6 שבועות (איור 1). פרוטוקול מפורט זה מתאר את השימוש בעכברים מהונדסים (H-2K b-tsA58) המכילים את נגיף הסימיאן 40 אנטיגן גידולי גדול (SV40 TAg) גן10,11 ליצירת תאים אימורטליים מותנים תרמולביליים. תוצר הגן tsA58 TAg מתפקד בטמפרטורה המתירנית של 33 מעלות צלזיוס תחת שליטתו של מקדם האגפים 5' הבלתי ניתן להשראה של הגן H-2K b של העכבר, אשר מוגבר מעל הרמות הבסיסיות עם חשיפה לגמא אינטרפרון (IFNγ), ובכך שומר על פנוטיפ ההתפשטות המותנה12. H-2Kb מתפרק במהירות בטמפרטורה הלא מתירנית של 37 מעלות צלזיוס בהיעדר IFNγ, מסיר את הפונקציה המונצחת של tsA58Tag בתאים ומאפשר לתאים לפתח פנוטיפ ממוין יותר13,14,15. חצייה אופציונלית של עכברי H-2Kb-tsA58 מהונדסים עם עכברי PhAM, המבטאים מיטוכונדריה ספציפית (תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז) דנדרה2-ירוקה, מאפשרת זיהוי חי של מיטוכונדריה פלואורסצנטית16. פלואורסצנציה ירוקה של Dendra2 עוברת לפלואורסצנציה אדומה לאחר חשיפה ללייזר 405 ננומטר16. כאשר המיטוכונדריה מתמזגים לאחר החלפת תמונות, הם יוצרים צורות מוארכות שנראות צהובות מחילופי חומרים ירוקים וצהובים או נראות אדומות כאשר הן עוברות ביקוע 7,17. MitoDendra2-GECs הם כלי נהדר לחקר התגובות התאיות של מיטוכונדריה של GEC לגירויים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

תפקוד לקוי של תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) יכול ליזום ולתרום לפירוק מחסום סינון גלומרולרי. עקה חמצונית מיטוכונדריאלית מוגברת הוצעה כמנגנון הגורם לתפקוד לקוי של GEC בפתוגנזה של מחלות גלומרולריות מסוימות. מבחינה היסטורית, הבידוד של GECs ממודלים in vivo היה מאתגר לשמצה בשל קשיים בבידוד תרבויות טהורות מגלומרולי. ל-GECs יש דרישות גידול מורכבות במבחנה ותוחלת חיים מוגבלת מאוד. במאמר זה נתאר את הליך הבידוד וההתרבות של GECs מונצחים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית, מה שמאפשר מעקב אחר ביקוע מיטוכונדריאלי ואירועי היתוך. GECs בודדו מכליות של עכבר מהונדס כפול המבטא את התרמולביל SV40 TAg (מה-Immortomouse), מקדם באופן מותנה התפשטות ודיכוי התמיינות תאים, וחלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה (Dendra2) בכל המיטוכונדריה (מהעכבר המיטוכונדריה הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAMנכרת]). קו התאים היציב שנוצר מאפשר התמיינות תאים לאחר השבתה של הגן האמונטלי SV40 TAg והפעלה פוטו-אקטיבית של תת-קבוצה של מיטוכונדריה הגורמת למתג בפלואורסצנטיות מירוק לאדום. השימוש ב-mitoDendra2-GECs מאפשר הדמיה חיה של אירועי התפלגות, איחוי וביקוע של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מבלי להכתים את התאים.

במאמר זה מתואר פרוטוקול מפורט לבידוד של תאי אנדותל גלומרולריים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית יציבה (mitoDendra2-GECs) (איור 1). השימוש בעכברים צעירים בני 6-10 שבועות חיוני להשגת מספר משמעותי של תאים בריאים. לאחר 3 ימים של תרבית, תאים מתחילים לגדול לאט מהגלומרולי המבודד, כפי שמוצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

המאמר מתאר את השיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים מותנים מכליות של עכברים מהונדסים המבטאים את נגיף סימיאן התרמולבילי 40 ואת המיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית, PhAMנכרת. אנו מתארים את ההליך לבידוד גלומרולי מכליות שלמות באמצעות חרוזים, שלבי עיכול, זריעה וגידול של GECs-CD31 חיובי.

בידוד של תאי אנדותל גלומרולריים של עכברים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

תאי אנדותל גלומרולריים אימורטליים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית יציבה הם כלי נהדר לבחון את ההשפעה של גירויים שונים על מבנה המיטוכונדריה במבחנה. השיטה המתוארת במאמר הנוכחי מניבה מספר גבוה של תאי אנדותל גלומרולריים. על-ידי בדיקת מולקולות קטנות ב-GEC, אנו יכולים לבדוק מונותרפיה למחלת כליות סוכרתית שבה ה-GECs מושפעים.השיטה המתוארת קלה לביצוע ואינה דורשת ציוד ספציפי. עם זאת, חשוב לעקוב אחר הצעדים המתוארים לעקר את הציוד כדי למנוע זיהום. כדי להתחיל, מקם את חומרי הפרפוזיה והבידוד הדרושים לבידוד תאי גלומרולריים בכליות בסביבת עבודה.סנן את תמיסת המלח המאוזנת הטרייה של Hanks's, או HBSS, עם מסנן של 0.2 מיקרון, ושמור אותה מתחת למכסה המנוע כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, מערבבים 200 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים עם 20 מיליליטר של HBSS. הקדימו את ה-RPMI עם 10% FCS ותרבית תאי אנדותל בינונית באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מצפים מראש שתי בארות של צלחת שש בארות עם שני מיליליטר של 10 מיקרוגרם לכל מיליליטר קולגן IV במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS כדי להסיר את החומצה האצטית המשמשת לדילול הקולגן. השתמש בצלחות המצופות מיד, או אחסן אותן בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה שבועות.נקו את כלי הניתוח ואת סביבת העבודה עם 70% אתנול. לאחר מכן, autoclave את כלי הניתוח במשך 30 דקות. לאחר פתיחת הבטן של עכבר מורדם, הכנס מחט פרפר לחדר השמאלי.כדי להזריק 100 microliters של פתרון חרוז כדי להרחיב את זרימת הדם, בזהירות לשבור את הווריד הנבוב נחות מתחת לכליות עם מחט 19 מד ולהמשיך את הזלוף של תמיסת חרוז. לאחר מכן, בעדינות להסיר את רקמת השומן עם פינצטה, הבלו את שתי הכליות עם מספריים כירורגיים דקים C, ולשים אותם על צלחת עם מיליליטר אחד של HBSS על קרח. טחנו את הכליה באזמל סטרילי לחתיכות קטנות של מילימטר אחד.דגירה של הכליה הטחונה עם מילימטר אחד של קולגן טרי סוג II במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם הטיה עדינה על שייקר אופקי. לאחר העיכול, להוסיף ארבעה מיליליטר של RPMI עם 10% FBS כדי לנטרל את collagenase. סננו את הרקמה המעוכלת דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר.השתמש בתחתית צינור סטרילי של 1.5 מיליליטר כדי לערבב את הרקמה המעוכלת כנגד המסננת, ומאפשר לגלומרולי לעבור. יש לשטוף את מסננת התאים ב-15 מיליליטר HBSS. לאחר מכן, צנטריפוגה של הזרימה ב-200 XG למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.בשלב זה, הצינור מכיל שלוש שכבות. השכבה העליונה מכילה מבנים קטנים יותר כגון צינוריות, השכבה האמצעית היא חרוזים עם גלומרולי, והשכבה התחתונה מכילה פסולת. שאפו בזהירות את הסופרנטנט ואת השכבה הלבנה העליונה.לאחר מכן, החזירו את הכדור המכיל חרוזים הנושאים את הגלומרולי והפסולת ב-1.5 מיליליטר של HBSS והעבירו אותו לצינור של שני מיליליטר. מניחים את הצינור ברכז מגנטי ושואפים את הסופר-נטנט לפני שטיפת החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של HBSS. הניחו 20 מיקרוליטרים של תליית תאים על מגלשה.לאחר מכן, צפו בשקופית מתחת למיקרוסקופ לנוכחותו של גלומרולי. לאחר מכן, לתלות את הכדור במדיום צמיחת תאי אנדותל ולהעביר את ההשעיה לצינור שני מיליליטר. מוסיפים מיקרוליטר אחד של אינטרפרון גמא לכל שלושה מיליליטר של מדיום, ומניחים את התאים בצלחת של שש בארות לדגירה בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס.לאחר שלושה ימים של תרבות, החלף בזהירות את המדיום מיליליטר אחד במדיום טרי. בשלב זה, התאים הטרוגניים עם תערובת של תאים גלומרולריים. לאחר שבעה ימים, החלף את המדיום בשני מיליליטר של מדיום צמיחת תאי אנדותל טריים, בתוספת אינטרפרון גמא כדי להתחיל את התפשטות התאים.לאחר 10 ימים, כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, העבירו אותם באמצעות טריפסין והעבירו אותם לתוך בקבוק T-25 המצופה בקולגן IV.לאחר 21 ימים של תרבית, העבירו את התאים לבקבוק T-75. מוסיפים שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין לבקבוק T-75 ומדגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, לנטרל את הטריפסין עם שלושה מיליליטר של מדיום גידול אנדותל ולהעביר את ההשעיה לצינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה ב 200 XG במשך חמש דקות.שאפו את הסופרנטנט ושטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS המכיל 1% BSA, EDTA של שני מילימולר, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. שוב, צנטריפוגה ולהשהות את הכדור ב 200 מיקרוליטר של חרוזים מצופים נוגדן CD31 ו 800 מיקרוליטר של PBS. לדגור על התאים במשך 45 דקות עם רעידות מתמשכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.לאחר מכן, הניחו את הצינור ברכז המגנטי ושטפו את התאים ארבע פעמים עם PBS המכיל BSA, EDTA ופניצילין/סטרפטומיצין. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום צמיחת אנדותל, בתוספת אינטרפרון גמא. צלחת 1.5 מיליליטר של תאים לכל באר בקולגן IV מצופה בארות על צלחת שש בארות ותרבית בתנאים מתירניים ב 33 מעלות צלזיוס.לאחר ארבעה ימים, להחליף 750 microliters של המדיום עם מדיום צמיחה אנדותל טרי, בתוספת אינטרפרון גמא. לאחר 10 עד 14 ימים של תרבית, באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנן של 488 ננומטר, שימו לב לגידול תאי אנדותל גלומרולריים חיוביים CD31, או GECs, מושבות המבטאות מיטוכונדריה פלואורסצנטית. לאחר 21 יום, או כאשר התאים הגיעו למפגש של 80% עד 90%, העבירו אותם לתוך בקבוק T-25.שמור על התרבות עם מדיום צמיחה RPMI המכיל 10% FCS. לחלופין, תאים יכולים להיות מוקפאים בהקפאה. תאי מעבר באמצעות טריפסין, כפי שהוכח קודם לכן.לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ולתלות מחדש את הכדור בשלושה מיליליטר של מדיום הקפאה. Aliquot את התאים בצינורות cryo ולאחסן אותם חנקן נוזלי, טמפרטורת אדים. פרוטוקול זה תיאר שיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים.מהגלומרולי המבודד, התאים החלו לגדול לאט לאחר שלושה ימים של תרבית. לאחר שבעה ימים, התאים נראו הטרוגניים והראו סוגי תאים גלומרולריים אחרים, כגון פודוציטים, קודקודים, אפיתל ותאים מסנגיאליים. לאחר הגעה למפגש של 70% עד 80%, תאים גלומרולריים אחרים הוסרו באמצעות בחירה חיובית של תאי אנדותל.ה- GECs של MitoDendra2 ביטאו CD31 והיו שליליים עבור סמן פודוציטים, כפי שמוצג על ידי צביעה שלילית של סינפטופודין. נבדקה השפעת ריכוז הגלוקוז על מבנה המיטוכונדריה. בהשוואה למיטוכונדריה המוארכת הנראית בתאים תחת גלוקוז רגיל, גלוקוז גבוה המושרה פיצול או ביקוע של המיטוכונדריה, כפי שנצפה על ידי מיטוכונדריה בולטת בצורת ספרואידים.יתר על כן, נעשה שימוש בלייזר בגודל 405 ננומטר כדי לבצע פוטו-המרה של תת-אוכלוסייה נבחרת של מיטוכונדריה ב-MitoDendra2 GEC חי יחיד. מוצג צילום מוצלח של המיטוכונדריה מירוק לאדום באזור שנבחר עבור תאים מטופלים בריכוז גלוקוז תקין וגבוה. מיתוג זה איפשר לחזות באירועי ההיתוך ב- MitoDendra2 GECs.תחת גלוקוז רגיל, פלואורסצנטיות ירוקה ואדומה ממוזגות צהובות נצפו עקב היתוך מטריצת המיטוכונדריה. לעומת זאת, ב-GECs שטופלו ברמת גלוקוז גבוהה, המיטוכונדריה היו בעיקר מקוטעים. הצבת התאים בבאר אחת של צלחת שש בארות עם נפח קטן של מדיום צמיחה חיונית כדי לאפשר לתאים להתחבר לצלחת.ניתן להשתמש בתאי האנדותל המבודדים לביצוע תפקוד מיטוכונדריאלי ומחקרים מבניים. השימוש בתאי אנדותל אימורטליים עם תכונות מיטוכונדריה פלואורסצנטיות יסלול את הדרך לגילוי תרופות. המולקולות הקטנות יכולות להיבדק על התאים, ומבוצע הדמיה חיה כדי לבחון את השפעתן על תפקוד המיטוכונדריה.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...