Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Gli autori ringraziano il professor Cijiang He e il dottor Fu Jia per le loro intuizioni sull'isolamento delle cellule endoteliali dei topi e ringraziano il professor Zaidi per aver fornito i topiasportati PhAM e preziose discussioni. Gli autori vorrebbero anche riconoscere il Microscopy CORE presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai e lo staff per la guida che abbiamo ricevuto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health grant R01DK097253 e Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 a I.S.D.

Tutte le procedure animali qui descritte sono state approvate dalla IACUC presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Abbiamo usato tre topi maschi (topi transgenici H-2Kb-tsA58 con mitocondri fotoattivabili [PhAM]) acquistati dal laboratorio Jackson e tenuti su una normale dieta chow.
1. Condizioni di lavoro e preparativi
<ol><li>Pulire lo spazio di lavoro all'interno della cappa a flusso laminare utilizzando etanolo al 70% e luce UV-C.</li>
	<li>Preparare i tamponi...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

I mitocondri sono fondamentali per il metabolismo cellulare, l'omeostasi e le risposte allo stress e la loro disfunzione è legata a molte malattie, tra cui le malattie renali. I mitocondri hanno un ruolo nella generazione patologica di specie reattive eccessive dell'ossigeno (ROS), nella regolazione dei livelli intracellulari di calcio, nelle vie di morte cellulare e nella dinamica citoscheletrica21,22,23.
<p class="jove_co...

Il glomerulo è fondamentale per la filtrazione del sangue limitando il passaggio di grandi molecole attraverso la barriera di filtrazione glomerulare 1,2. Il glomerulo contiene quattro tipi di cellule: cellule epiteliali parietali, podociti (cellule epiteliali viscerali), cellule endoteliali glomerulari (GEC) e cellule mesangiali3. L'endotelio glomerulare è caratterizzato da una struttura vascolare unica, come per la presenza di fenestrae richieste per grandi volumi di filtrazione4. La superficie apicale dell'endotelio glomerulare è ricoperta da uno strato di glicocalice caricato negativamente e da un rivestimento chiamato strato superficiale endoteliale che crea uno spazio tra l'endotelio e il sangue. Questa struttura fornisce un'elevata selettività della carica limitando il passaggio di molecole caricate negativamente come l'albumina e impedendo l'adesione di leucociti e piastrine5.
Gli OG sono molto sensibili ai cambiamenti metabolici, come l'iperglicemia associata all'ambiente diabetico. Infatti, il diabete porta ad un aumento della circolazione di sostanze nocive, alla saturazione delle vie del metabolismo del glucosio e a disturbi dell'equilibrio redox cellulare 3,6. Inoltre, l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno induce disfunzione mitocondriale, che influisce sulla funzione endoteliale7.
L'obiettivo generale dell'attuale protocollo è quello di isolare cellule endoteliali glomerulari immortalizzate con caratteristiche mitocondriali fluorescenti. Infatti, la coltura cellulare di GEC primari ha un ciclo proliferativo limitato e una senescenza precoce8. Inoltre, la presenza di mitocondri fluorescenti aiuta a esaminare gli eventi di fissione e fusione in risposta all'iperglicemia o a qualsiasi altro trattamento. Come metodo alternativo, altri laboratori hanno utilizzato h-TERT per immortalare le cellule in vitro9.
Il metodo qui descritto consente l'isolamento di cellule endoteliali glomerulari mitoDendra2 condizionatamente immortalate da animali di 4-6 settimane (Figura 1). Questo protocollo dettagliato descrive l'uso di topi transgenici (H-2K b-tsA58) che ospitano il gene 10,11 del virus delle scimmie 40 Large Tumor Antigene (SV40 TAg) per generare cellule termolabili condizionatamente immortalate. Il prodotto del gene tsA58 TAg è funzionale alla temperatura permissiva di 33 °C sotto il controllo del promotore 5' fiancheggiante inducibile del gene H-2Kb del topo, che viene aumentato al di sopra dei livelli basali dopo esposizione all'interferone gamma (IFNγ), mantenendo quindi il fenotipo di proliferazione condizionale12. H-2Kb viene rapidamente degradato alla temperatura non permissiva di 37 °C in assenza di IFNγ, rimuovendo la funzione immortalizzante del tsA58Tag nelle cellule e permettendo alle cellule di sviluppare un fenotipo 13,14,15 più differenziato. L'incrocio opzionale di topi transgenici H-2Kb-tsA58 con topi PhAM, che esprimono un mitocondrio-specifico (subunità VIII della citocromo c ossidasi) Dendra2-green, consente la rilevazione in tempo reale di mitocondri fluorescenti16. La fluorescenza verde Dendra2 passa alla fluorescenza rossa dopo l'esposizione a un laser16 a 405 nm. Quando i mitocondri si fondono dopo il foto-switching, formano forme allungate che appaiono gialle dallo scambio di materiale verde e giallo o appaiono rosse quando subiscono la fissione 7,17. I mitoDendra2-GEC sono un ottimo strumento per studiare le risposte cellulari dei mitocondri GEC a diversi stimoli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

La disfunzione delle cellule endoteliali glomerulari (GEC) può avviare e contribuire alla rottura della barriera di filtrazione glomerulare. L'aumento dello stress ossidativo mitocondriale è stato suggerito come meccanismo che provoca la disfunzione GEC nella patogenesi di alcune malattie glomerulari. Storicamente l'isolamento degli OG dai modelli in vivo è stato notoriamente impegnativo a causa delle difficoltà nell'isolare colture pure dai glomeruli. Gli OG hanno requisiti di crescita complessi in vitro e una durata di vita molto limitata. Qui, descriviamo la procedura per isolare e coltivare GEC condizionatamente immortalati con mitocondri fluorescenti, consentendo il monitoraggio degli eventi di fissione e fusione mitocondriale. I GEC sono stati isolati dai reni di un topo transgenico doppio che esprime il termolabile SV40 TAg (dall'Immortomouse), promuovendo condizionatamente la proliferazione e sopprimendo la differenziazione cellulare, e una proteina fluorescente fotoconvertibile (Dendra2) in tutti i mitocondri (dal topo mitocondriale fotoattivabile). La linea cellulare stabile generata consente la differenziazione cellulare dopo l'inattivazione del gene immortalizzante SV40 TAg e la foto-attivazione di un sottogruppo di mitocondri causando un passaggio della fluorescenza dal verde al rosso. L'uso di mitoDendra2-GEC consente l'imaging dal vivo degli eventi di distribuzione, fusione e fissione dei mitocondri fluorescenti senza colorare le cellule.

In questo articolo, viene descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento di cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti stabili (mitoDendra2-GECs) (Figura 1). L'uso di giovani topi di 6-10 settimane è essenziale per ottenere un numero considerevole di cellule sane. Dopo 3 giorni di coltura, le cellule iniziano a crescere lentamente dai glomeruli isolati, come mostrato in Figura 3G. Dopo 7 giorni, le cellule...

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Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

L'articolo descrive il metodo per isolare cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate dai reni di topi transgenici che esprimono il virus termolabile delle scimmie 40 e mitocondri fotoattivabili, PhAMasportato. Descriviamo la procedura per l'isolamento dei glomeruli da reni interi usando perline, fasi di digestione, semina e coltura di GEC-CD31 positivi.

Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Le cellule endoteliali glomerulari immortalizzate con mitocondri fluorescenti stabili sono un ottimo strumento per esaminare l'effetto di diversi stimoli sulla struttura mitocondriale in vitro. Il metodo descritto nell'articolo corrente produce un numero elevato di cellule endoteliali glomerulari. Testando piccole molecole su un GEC, potremmo schermare la monoterapia per la malattia renale diabetica in cui i GEC sono interessati.Il metodo descritto è facile da eseguire e non richiede attrezzature specifiche. Tuttavia, è importante seguire i passaggi descritti e sterilizzare l'apparecchiatura per evitare la contaminazione. Per iniziare, posizionare i materiali di perfusione e isolamento necessari per isolare le cellule glomerulari renali in uno spazio di lavoro.Filtrare la soluzione salina bilanciata di Hanks appena preparata, o HBSS, con un filtro da 0,2 micron e tenerla sotto il cofano per evitare contaminazioni. Quindi, mescolare 200 microlitri di perline magnetiche con 20 millilitri di HBSS. Preriscaldare l'RPMI con FCS al 10% e terreno di coltura cellulare endoteliale a bagnomaria a 37 gradi Celsius.Quindi, pre-rivestire due pozzetti di una piastra a sei pozzetti con due millilitri di 10 microgrammi per millilitro di collagene IV per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare la piastra due volte con PBS per rimuovere l'acido acetico utilizzato per diluire il collagene. Utilizzare immediatamente le piastre rivestite o conservarle da due a otto gradi Celsius per un massimo di quattro settimane.Pulire gli strumenti chirurgici e lo spazio di lavoro con etanolo al 70%. Successivamente, autoclavare gli strumenti chirurgici per 30 minuti. Dopo aver aperto l'addome di un topo anestetizzato, inserire un ago a farfalla nel ventricolo sinistro.Per iniettare 100 microlitri della soluzione di perline per espandere la circolazione sanguigna, rompere con cura la vena cava inferiore sotto i reni con un ago di calibro 19 e continuare la perfusione della soluzione di perline. Quindi, rimuovere delicatamente il tessuto adiposo con una pinzetta, asportare entrambi i reni con sottili forbici chirurgiche C e metterli su un piatto con un millilitro di HBSS sul ghiaccio. Tritare il rene con un bisturi sterile in piccoli pezzi di un millimetro.Incubare il rene tritato con un millimetro di collagenasi di tipo II appena preparata per 35 minuti a 37 gradi Celsius con una leggera inclinazione su uno shaker orizzontale. Dopo la digestione, aggiungere quattro millilitri di RPMI con 10% FBS per neutralizzare la collagenasi. Filtrare il tessuto digerito attraverso un filtro cellulare sterile da 100 micron in un tubo da 50 millilitri.Utilizzare il fondo di un tubo sterile da 1,5 millilitri per mescolare il tessuto digerito contro il colino, consentendo ai glomeruli di passare. Risciacquare il filtro cellulare con 15 millilitri di HBSS. Quindi, centrifugare il flusso a 200 XG per cinque minuti a temperatura ambiente.In questa fase, il tubo contiene tre strati. Lo strato superiore contiene strutture più piccole come tubuli, lo strato intermedio è perline con glomeruli e lo strato inferiore contiene detriti. Aspirare con cura il surnatante e lo strato bianco superiore.Quindi, risospendere il pellet contenente perline contenenti glomeruli e detriti in 1,5 millilitri di HBSS e trasferirlo in un tubo da due millilitri. Posizionare il tubo in un concentratore magnetico e aspirare il surnatante prima di lavare le perle due volte con un millilitro di HBSS. Posizionare 20 microlitri di sospensione cellulare su un vetrino.Quindi, osserva il vetrino al microscopio per la presenza di glomeruli. Quindi, risospendere il pellet in un mezzo di crescita delle cellule endoteliali e trasferire la sospensione in un tubo da due millilitri. Aggiungere un microlitro di interferone gamma per ogni tre millilitri di terreno e posizionare le cellule in una piastra a sei pozzetti per l'incubazione a 33 gradi Celsius.Dopo tre giorni di coltura, sostituire con cura il mezzo da un millilitro con un mezzo fresco. In questa fase, le cellule sono eterogenee con una miscela di cellule glomerulari. Dopo sette giorni, sostituire il terreno con due millilitri di terreno di crescita cellulare endoteliale fresco, integrato con interferone gamma per avviare la proliferazione cellulare.Dopo 10 giorni, quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, passarle usando tripsina e trasferirle in un pallone T-25 rivestito di collagene IV.Dopo 21 giorni di coltura, trasferire le cellule in un matraccio T-75. Aggiungere tre millilitri di tripsina allo 0,25% in un pallone T-75 e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, neutralizzare la tripsina con tre millilitri di terreno di crescita endoteliale e trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione a 200 XG per cinque minuti.Aspirare il surnatante e lavare le cellule in un millilitro di PBS contenente 1% BSA, EDTA bimolare, 1% penicillina / streptomicina. Ancora una volta, centrifugare e risospendere il pellet in 200 microlitri di perle rivestite di anticorpi CD31 e 800 microlitri di PBS. Incubare le cellule per 45 minuti con agitazione continua a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Quindi, posizionare il tubo nel concentratore magnetico e lavare le cellule quattro volte con PBS contenente BSA, EDTA e penicillina / streptomicina. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in tre millilitri di terreno di crescita endoteliale, integrato con interferone gamma. Piastra 1,5 millilitri di cellule per pozzetto in pozzetti rivestiti di collagene IV su una piastra a sei pozzetti e coltura in condizioni permissive a 33 gradi Celsius.Dopo quattro giorni, sostituire 750 microlitri del mezzo con un mezzo di crescita endoteliale fresco, integrato con interferone gamma. Dopo 10-14 giorni di coltura, utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un filtro a 488 nanometri, osservare per la crescita le cellule endoteliali glomerulari CD31 positive, o GEC, colonie che esprimono mitocondri fluorescenti. Dopo 21 giorni, o quando le cellule hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, trasferirle in un pallone T-25.Mantenere la coltura con un mezzo di crescita RPMI contenente il 10% di FCS. In alternativa, le cellule possono essere crioconservate. Cellule di passaggio usando tripsina, come dimostrato in precedenza.Quindi, centrifugare le celle e risospendere il pellet in tre millilitri di mezzo di congelamento. Aliquotare le cellule in tubi criogenici e conservarle in azoto liquido, temperatura di vapore. Questo protocollo descriveva un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali glomerulari.Dai glomeruli isolati, le cellule hanno iniziato a crescere lentamente dopo tre giorni di coltura. Dopo sette giorni, le cellule apparivano eterogenee e mostravano altri tipi di cellule glomerulari, come podociti, cellule parietali, epiteliali e mesangiali. Dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza, altre cellule glomerulari sono state rimosse utilizzando una selezione positiva di cellule endoteliali.I GEC di MitoDendra2 esprimevano CD31 ed erano negativi per il marcatore podocita, come mostrato dalla colorazione negativa della sinaptopodina. È stato esaminato l'effetto della concentrazione di glucosio sulla struttura dei mitocondri. Rispetto ai mitocondri allungati visibili nelle cellule sotto glucosio normale, l'alta frammentazione indotta dal glucosio o la fissione dei mitocondri, come osservato dai mitocondri prominenti a forma di sferoide.Inoltre, un laser a 405 nanometri è stato utilizzato per fotoconvertire una sottopopolazione selezionata di mitocondri in un singolo MitoDendra2 GEC vivo. Viene mostrato un fotopassaggio riuscito dei mitocondri da verde a rosso nell'area selezionata per le cellule trattate con concentrazione di glucosio normali e elevate. Questa commutazione ha permesso di assistere agli eventi di fusione nei GEC di MitoDendra2.Sotto glucosio normale, la fluorescenza gialla si è fusa verde e rossa a causa della fusione della matrice mitocondriale. Al contrario, nei GEC trattati con alto glucosio, i mitocondri erano principalmente frammentati. Posizionare le cellule in un pozzetto di piastra a sei pozzetti con un piccolo volume di terreno di crescita è essenziale per consentire alle cellule di attaccarsi al piatto.Le cellule endoteliali isolate potrebbero essere utilizzate per eseguire studi sulla funzione mitocondriale e strutturale. L'uso di cellule endoteliali immortalizzate con caratteristiche mitocondriali fluorescenti aprirà la strada alla scoperta di farmaci. Le piccole molecole potrebbero essere testate sulle cellule e viene eseguita l'imaging dal vivo per esaminare il loro effetto sulla funzione dei mitocondri.

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