Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
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著者らは、マウスの内皮細胞単離に関する洞察を提供してくれたCijiang He教授とFu Jia博士に感謝し、PhAM切除 マウスと貴重な議論を提供してくれたMone Zaidi教授に感謝しています。著者はまた、マウントサイナイのアイカーン医学部の顕微鏡COREとスタッフに、私たちが受けた指導に感謝したいと思います。この作業は、国立衛生研究所の助成金R01DK097253および国防総省CDMRP助成金E01 W81XWH2010836からのI.S.Dへの助成金によってサポートされました。

ここに記載されているすべての動物の手順は、マウントサイナイのアイカーン医学部のIACUCによって承認されました。ジャクソン研究室から購入した3匹のオスマウス(H-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスと光活性化可能なミトコンドリア[PhAM])を使用し、通常の飼料を続けました。
1.労働条件と準備
<ol><li>層流フード内の作業スペースは、70%エタノールとUV-Cラ...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

ミトコンドリアは、細胞の代謝、恒常性、ストレス応答に不可欠であり、その機能不全は腎臓病を含む多くの病気に関連しています。ミトコンドリアは、過剰な活性酸素種(ROS)の病理学的生成、細胞内カルシウムレベルの調節、細胞死経路、および細胞骨格動態に役割を果たしています21,22,23。
マウス...

糸球体は、糸球体濾過バリア1,2を通過する大きな分子の通過を制限することにより、血液濾過にとって重要である。糸球体には、頭頂上皮細胞、足細胞(内臓上皮細胞)、糸球体内皮細胞(GEC)、メサンギウム細胞の4つの細胞タイプが含まれています3。糸球体内皮は、大きな濾過量に必要なフェネストラの存在に従って、独特の血管構造によって特徴付けられる4。糸球体内皮の頂端表面は、負に帯電したグリコカリックス層と、内皮と血液の間に空間を作り出す内皮表面層と呼ばれるコートで覆われています。この構造は、アルブミンなどの負に帯電した分子の通過を制限し、白血球と血小板の接着を防ぐ高い電荷選択性を提供します5。
GECは、糖尿病環境に関連する高血糖などの代謝変化に非常に敏感です。実際、糖尿病は有害物質の循環の増加、グルコース代謝経路の飽和、および細胞酸化還元バランスの乱れにつながります3,6。さらに、活性酸素種の増加はミトコンドリア機能障害を誘発し、内皮機能に影響を与えます7。
現在のプロトコルの全体的な目標は、蛍光ミトコンドリアの特徴を持つ不死化糸球体内皮細胞を単離することです。実際、初代GECの細胞培養は増殖周期が限られており、老化が早い8。さらに、蛍光ミトコンドリアの存在は、高血糖または他の治療に応答して分裂および融合事象を調べるのに役立つ。別の方法として、他の研究室ではh-TERTを使用して細胞をin vitroで不死化しました9。
ここで説明する方法は、4〜6週齢の動物から条件付き不死化mitoDendra2糸球体内皮細胞を単離することを可能にする(図1)。この詳細なプロトコルは、熱不安定な条件付き不死化細胞を生成するためのサルウイルス40大腫瘍抗原(SV40TAg)遺伝子10,11を保持するトランスジェニックマウス(H-2Kb-tsA58)の使用を記載している。tsA58 TAg遺伝子産物は、マウスH-2Kb遺伝子の誘導性5'隣接プロモーターの制御下で33°Cの許容温度で機能し、インターフェロンガンマ(IFNγ)への曝露により基礎レベルを超えて増加し、したがって条件付き増殖表現型12を維持します。H-2Kbは、IFNγの非存在下で37°Cの非許容温度で急速に分解され、細胞内のtsA58Tagの不死化機能を除去し、細胞がより分化した表現型を発達させることを可能にします13,14,15。H-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスと、ミトコンドリア特異的(シトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIII)デンドラ2-グリーンを発現するPhAMマウスとのオプションの交配により、蛍光ミトコンドリア16のライブ検出が可能になります。Dendra2緑色蛍光は、405 nmレーザー16に曝露すると赤色蛍光に切り替わります。ミトコンドリアが光スイッチング後に融合すると、緑と黄色の物質の交換から黄色に見えるか、核分裂を起こすと赤く見える細長い形状を形成します7,17。mitoDendra2-GECは、さまざまな刺激に対するGECミトコンドリアの細胞応答を研究するための優れたツールです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

糸球体内皮細胞(GEC)の機能不全は、糸球体濾過バリアの破壊を開始し、一因となる可能性があります。ミトコンドリア酸化ストレスの増加は、いくつかの糸球体疾患の病因におけるGEC機能障害をもたらすメカニズムとして示唆されています。歴史的に、 in vivo モデルからのGECの単離は、糸球体から純粋な培養物を単離することが困難であるため、悪名高いほど困難でした。GECは、 in vitroでの 複雑な増殖要件と非常に限られた寿命を持っています。ここでは、ミトコンドリアの分裂および融合イベントの追跡を可能にする、蛍光ミトコンドリアを有する条件付き不死化GECを単離および培養する手順について説明します。GECは、熱不安定性SV40 TAg(イモータルトマウス由来)を発現し、条件付きで増殖を促進し、細胞分化を抑制する二重トランスジェニックマウスの腎臓から単離され、すべてのミトコンドリア(光活性化可能なミトコンドリア[PhAM切除]マウスから)の光変換蛍光タンパク質(Dendra2)を単離しました。生成された安定した細胞株は、不死化SV40 TAg遺伝子の不活性化後の細胞分化と、蛍光の緑から赤への切り替えを引き起こすミトコンドリアのサブセットの光活性化を可能にします。mitoDendra2-GECを使用することで、細胞を染色することなく、蛍光ミトコンドリアの分布、融合、および分裂イベントのライブイメージングが可能になります。

この記事では、安定した蛍光ミトコンドリア(mitoDendra2-GECs)を有する条件付き不死化糸球体内皮細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明します(図1)。若い6〜10週齢のマウスの使用は、かなりの数の健康な細胞を得るために不可欠です。3日間の培養後、 図3Gに示すように、細胞は単離された糸球体からゆっくりと増殖し始めます。7日後?...

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Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

この記事では、熱不安定性サルウイルス40および光活性化可能なミトコンドリア、PhAMを切除したトランスジェニックマウスの腎臓から条件付き不死化糸球体内皮細胞を単離する方法について説明しています。ビーズを用いた腎臓全体からの糸球体単離の手順、消化ステップ、播種、およびGECs-CD31陽性の培養について説明します。

蛍光ミトコンドリアによる条件付き不死化マウス糸球体内皮細胞の単離

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

安定した蛍光ミトコンドリアを有する不死化糸球体内皮細胞は、in vitroでミトコンドリア構造に対するさまざまな刺激の影響を調べるための優れたツールです。本論文に記載されている方法は、多数の糸球体内皮細胞を生じる。GECで低分子を試験することにより、GECが罹患している糖尿病性腎疾患の単剤療法をスクリーニングすることができます。説明されている方法は実行が簡単で、特定の機器を必要としません。ただし、汚染を避けるために、説明されている手順に従い、機器を滅菌することが重要です。まず、腎糸球体細胞を単離するために必要な灌流および分離材料をワークスペースに配置します。新しく調製したハンクスバランス塩溶液(HBSS)を0.2ミクロンのフィルターでろ過し、汚染を避けるためにボンネットの下に保管してください。次に、200マイクロリットルの磁気ビーズと20ミリリットルのHBSSを混合します。RPMIを10%FCSと内皮細胞培養培地で摂氏37度のウォーターバスで予熱します。次いで、6ウェルプレートの2つのウェルに2ミリリットルの10マイクログラム当たり1ミリリットルのコラーゲンIVを室温で45分間プレコートする。プレートをPBSで2回洗浄して、コラーゲンの希釈に使用した酢酸を除去します。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、摂氏2〜8度で最大4週間保管してください。手術器具と作業スペースを70%エタノールで洗浄します。続いて、手術器具を30分間オートクレーブする。麻酔をかけたマウスの腹部を開いた後、左心室に蝶の針を挿入します。血液循環を拡大するために100マイクロリットルのビーズ溶液を注入するには、腎臓の下の下大静脈を19ゲージの針で慎重に破り、ビーズ溶液の灌流を続けます。次に、ピンセットで脂肪組織をそっと取り除き、細い手術用ハサミCで両方の腎臓を切除し、氷の上に1ミリリットルのHBSSを入れたプレートに置きます。滅菌メスで腎臓を1ミリメートルの小片にひきます。細かく刻んだ腎臓を1ミリメートルの新しく調製したコラゲナーゼII型で摂氏37度で35分間インキュベートし、水平シェーカーを穏やかに傾けます。消化後、10%FBSを含む4ミリリットルのRPMIを加えてコラゲナーゼを中和します。消化された組織を滅菌済みの100ミクロンセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。滅菌した1.5ミリリットルのチューブの底を使用して、消化された組織をストレーナーに対して攪拌し、糸球体を通過させます。セルストレーナーを15ミリリットルのHBSSですすいでください。次に、フロースルーを 200 XG で室温で 5 分間遠心分離します。この段階で、チューブは3つの層を含みます。上層は細管などの小さな構造を含み、中間層は糸球体を有するビーズであり、そして最下層は破片を含む。上清と一番上の白い層を注意深く吸引します。次に、糸球体と破片を含むビーズを含むペレットを1.5ミリリットルのHBSSに再懸濁し、2ミリリットルのチューブに移します。チューブを磁気濃縮器に入れ、上清を吸引してから、ビーズを1ミリリットルのHBSSで2回洗浄します。20マイクロリットルの細胞懸濁液をスライド上に置きます。次に、糸球体の存在について顕微鏡下でスライドを観察します。次に、ペレットを内皮細胞増殖培地に再懸濁し、懸濁液を2ミリリットルのチューブに移します。培地3ミリリットルごとに1マイクロリットルのインターフェロンガンマを加え、細胞を6ウェルプレートに入れて摂氏33度でインキュベートします。3日間の培養後、1ミリリットルの培地を新しい培地と慎重に交換します。この段階では、細胞は糸球体細胞の混合物と不均一である。7日後、培地を2ミリリットルの新鮮な内皮細胞増殖培地と交換し、インターフェロンガンマを添加して細胞の増殖を開始します。10日後、細胞が80%コンフルエントに達したら、トリプシンを使用して継代し、コラーゲンIVでコーティングされたT-25フラスコに移します.21日間の培養後、細胞をT-75フラスコに移します。3ミリリットルの0.25%トリプシンをT-75フラスコに加え、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、3ミリリットルの内皮増殖培地でトリプシンを中和し、懸濁液を15ミリリットルのチューブに移して、200 XGで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1%BSA、2ミリモルEDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。再度、遠心分離し、ペレットを200マイクロリットルのCD31抗体被覆ビーズおよび800マイクロリットルのPBSに再懸濁する。摂氏37度と5%二酸化炭素で連続的に振とうしながら、細胞を45分間インキュベートします。次に、チューブを磁気濃縮器に入れ、BSA、EDTA、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBSで細胞を4回洗浄します。最後の洗浄後、インターフェロンガンマを添加した3ミリリットルの内皮増殖培地に細胞を再懸濁する。コラーゲンIVコーティングウェルに1ウェルあたり1.5ミリリットルの細胞を6ウェルプレート上にプレートし、摂氏33度の許容条件下で培養する。4日後、750マイクロリットルの培地をインターフェロンガンマを添加した新鮮な内皮増殖培地と交換する。10〜14日間の培養後、488ナノメートルのフィルターを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、蛍光ミトコンドリアを発現するコロニーであるCD31陽性糸球体内皮細胞(GEC)の増殖を観察します。21日後、または細胞が80〜90%コンフルエントに達したら、それらをT-25フラスコに移します。10%FCSを含むRPMI増殖培地で培養を維持します。あるいは、細胞を凍結保存することもできる。継代細胞は、先に実証したようにトリプシンを用いた。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを3ミリリットルの凍結培地に再懸濁します。細胞をクライオチューブに分注し、液体窒素、蒸気温度で保存します。このプロトコールは、糸球体内皮細胞の単離のための方法を記載した。単離された糸球体から、細胞は3日間の培養後にゆっくりと成長し始めました。7日後、細胞は不均一に見え、足細胞、頭頂細胞、上皮細胞、メサンギウム細胞などの他の糸球体細胞タイプを示しました。70〜80%のコンフルエントに達した後、他の糸球体細胞を、内皮細胞のポジティブ選択を用いて除去した。MitoDendra2 GECはCD31を発現し、シナプトポジン陰性染色によって示されるように、足細胞マーカーに対して陰性であった。ミトコンドリア構造に対するグルコース濃度の影響を調べた。正常なグルコース下の細胞に見られる細長いミトコンドリアと比較して、高グルコースは、顕著なスフェロイド形状のミトコンドリアによって観察されるように、ミトコンドリアの断片化または分裂を誘発した。さらに、405ナノメートルのレーザーを使用して、単一の生きたMitoDendra2GECでミトコンドリアの選択された亜集団を光変換しました。正常および高グルコース濃度で処理された細胞について、選択された領域でミトコンドリアの緑から赤への光切り替えに成功したことが示されています。この切り替えにより、MitoDendra2 GECでの核融合イベントを目撃することができました。通常のグルコース下では、ミトコンドリアマトリックス融合により黄色の緑色と赤色の蛍光が融合した。対照的に、高グルコース処理GECでは、ミトコンドリアは主に断片化されていました。少量の増殖培地を含む6ウェルプレートの1ウェルに細胞を配置することは、細胞をディッシュに付着させるために不可欠です。単離された内皮細胞は、ミトコンドリアの機能および構造研究を行うために使用することができる。蛍光ミトコンドリアの特徴を持つ不死化内皮細胞の使用は、創薬への道を開くでしょう。低分子は細胞上でテストすることができ、ミトコンドリア機能への影響を調べるためにライブイメージングが実行されます。

Research

JoVE Journal

Biology

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