Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Forfatterne takker professor Cijiang He og Dr. Fu Jia for deres innsikt i musens endotelcelleisolasjon og takker professor Mone Zaidi for å gi PhAMutskårne mus og verdifulle diskusjoner. Forfatterne vil også gjerne anerkjenne Microscopy CORE ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai og ansatte for veiledningen vi mottok. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health grant R01DK097253 og Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 til I.S.D.

Alle dyreprosedyrer beskrevet her ble godkjent av IACUC ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Vi brukte tre mannlige mus (H-2Kb-tsA58 transgene mus med fotoaktiverbare mitokondrier [PhAM]) kjøpt fra Jackson lab og holdt på en normal chow diett.
1. Arbeidsforhold og forberedelser
<ol><li>Rengjør arbeidsområdet inne i den laminære strømningshetten med 70% etanol og UV-C-lys.</li>
	<li>Forbered perlens vaskebuffere. Lag buffer-1 ved bruk av 0,1 M natriumfosfat ved...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Mitokondrier er kritiske for cellulær metabolisme, homeostase og stressresponser, og deres dysfunksjon er knyttet til mange sykdommer, inkludert nyresykdom. Mitokondrier har en rolle i patologisk generering av overdreven reaktive oksygenarter (ROS), regulering av intracellulære kalsiumnivåer, celledødsveier og cytoskeletal dynamikk21,22,23.
Isoleringen av murine GEC er utfordrende på grunn av der...

Glomerulus er kritisk for blodfiltrering ved å begrense passasjen av store molekyler gjennom glomerulær filtreringsbarriere 1,2. Glomerulus inneholder fire celletyper: parietale epitelceller, podocytter (viscerale epitelceller), glomerulære endotelceller (GEC) og mesangialceller3. Det glomerulære endotelet er preget av en unik vaskulær struktur, i henhold til tilstedeværelsen av fenestrae som kreves for store filtreringsvolumer4. Den apikale overflaten av det glomerulære endotelet er dekket med et negativt ladet glykokalyxlag og et lag kalt endoteloverflatelaget som skaper et mellomrom mellom endotelet og blodet. Denne strukturen gir høy ladningsselektivitet som begrenser passasjen av negativt ladede molekyler som albumin og forhindrer leukocytt- og blodplateadhesjon5.
GEC er svært følsomme for metabolske endringer, for eksempel hyperglykemi forbundet med diabetisk miljø. Faktisk fører diabetes til økt sirkulasjon av skadelige stoffer, metning av glukosemetabolismeveier og forstyrret cellulær redoksbalanse 3,6. Videre induserer økningen i reaktive oksygenarter mitokondriell dysfunksjon, noe som påvirker endotelfunksjonen7.
Det overordnede målet med den nåværende protokollen er å isolere udødelige glomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrielle egenskaper. Faktisk har cellekulturen til primære GEC-er en begrenset proliferativ syklus og tidlig aldring8. I tillegg bidrar tilstedeværelsen av fluorescerende mitokondrier til å undersøke fisjons- og fusjonshendelser som respons på hyperglykemi eller annen behandling. Som en alternativ metode brukte andre laboratorier h-TERT for å udødeliggjøre celler in vitro9.
Metoden beskrevet her tillater isolering av betinget udødelige mitoDendra2 glomerulære endotelceller fra 4-6 uker gamle dyr (figur 1). Denne detaljerte protokollen beskriver bruken av transgene mus (H-2K b-tsA58) som inneholder simian virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg) genet10,11 for å generere termolabile betinget udødeliggjorte celler. TSA58 TAg-genproduktet er funksjonelt ved den tillatte temperaturen på 33 °C under kontroll av den induserbare 5' flankerende promotoren av musens H-2Kb-gen, som økes over basale nivåer ved eksponering for interferon gamma (IFNγ), og opprettholder derfor den betingede proliferasjonsfenotypen12. H-2Kb nedbrytes raskt ved den ikke-permissive temperaturen på 37 °C i fravær av IFNγ, noe som fjerner den immortaliserende funksjonen til tsA58Tag i celler og lar cellene utvikle en mer differensiert fenotype13,14,15. Valgfri kryssing av H-2Kb-tsA58 transgene mus med PhAM-mus, som uttrykker en mitokondrie-spesifikk (underenhet VIII av cytokrom c-oksidase) Dendra2-grønn, tillater levende deteksjon av fluorescerende mitokondrier16. Dendra2 grønn fluorescens bytter til rød fluorescens etter eksponering for en 405 nm laser16. Når mitokondrier smelter sammen etter fotobytte, danner de langstrakte former som ser gule ut fra utvekslingen av grønt og gult materiale eller ser røde ut når de gjennomgår fisjon 7,17. MitoDendra2-GECs er et flott verktøy for å studere de cellulære responsene til GEC-mitokondrier til forskjellige stimuli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Glomerulær endotelcelledysfunksjon (GEC) kan initiere og bidra til nedbrytning av glomerulær filtreringsbarriere. Økt mitokondriell oksidativt stress har blitt foreslått som en mekanisme som resulterer i GEC dysfunksjon i patogenesen av noen glomerulære sykdommer. Historisk sett har isolasjonen av GECs fra in vivo-modeller vært notorisk utfordrende på grunn av vanskeligheter med å isolere rene kulturer fra glomeruli. GEC-er har komplekse vekstkrav in vitro og en svært begrenset levetid. Her beskriver vi prosedyren for isolering og dyrking av betinget udødeliggjorte GEC-er med fluorescerende mitokondrier, noe som muliggjør sporing av mitokondrielle fisjons- og fusjonshendelser. GEC ble isolert fra nyrene til en dobbel transgen mus som uttrykker termolabil SV40 TAg (fra Immortomouse), betinget fremme proliferasjon og undertrykke celledifferensiering, og et fotokonvertibelt fluorescerende protein (Dendra2) i alle mitokondrier (fra fotoaktiverbar mitokondrier [PhAMskåret ut] mus). Den stabile cellelinjen som genereres tillater celledifferensiering etter inaktivering av det immortaliserende SV40 TAg-genet og fotoaktivering av en delmengde mitokondrier som forårsaker en bryter i fluorescens fra grønn til rød. Bruken av mitoDendra2-GECs muliggjør levende avbildning av fluorescerende mitokondriers distribusjon, fusjon og fisjonshendelser uten å farge cellene.

I denne artikkelen beskrives en detaljert protokoll for isolering av betinget udødelige glomerulære endotelceller med stabile fluorescerende mitokondrier (mitoDendra2-GECs) (figur 1). Bruken av unge 6-10 uker gamle mus er viktig for å få et betydelig antall friske celler. Etter 3 dager med kultur begynner celler å vokse sakte fra den isolerte glomeruli, som vist i figur 3G. Etter 7 dager er cellene heterogene, og viser andre glomerulære celletyper, som pod...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Artikkelen beskriver metoden for å isolere betinget immortaliserte glomerulære endotelceller fra nyrene til transgene mus som uttrykker termolabile simian virus 40 og fotoaktiverbare mitokondrier, PhAMskåret ut. Vi beskriver prosedyren for glomeruli-isolasjon fra hele nyrer ved hjelp av perler, fordøyelsestrinn, såing og dyrking av GECs-CD31 positiv.

Isolering av betinget udødeliggjorte museglomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrier

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Udødelige glomerulære endotelceller med stabile fluorescerende mitokondrier er et flott verktøy for å undersøke effekten av forskjellige stimuli på mitokondriell struktur in vitro. Den beskrevne metoden i denne artikkelen gir et høyt antall glomerulære endotelceller. Ved å teste små molekyler på en GEC, kan vi skjerme for monoterapi for diabetisk nyresykdom der GECs påvirkes.Den beskrevne metoden er enkel å utføre og krever ikke spesifikt utstyr. Det er imidlertid viktig å følge de beskrevne trinnene og sterilisere utstyret for å unngå forurensning. For å begynne, plasser perfusjons- og isolasjonsmaterialene som kreves for å isolere nyreglomerulære celler på et arbeidsområde.Filtrer den nylagde Hanks'Balanced Salt Solution, eller HBSS, med et 0,2 mikron filter, og hold det under panseret for å unngå forurensning. Bland deretter 200 mikroliter magnetiske perler med 20 milliliter HBSS. Forvarm RPMI med 10% FCS og endotelcellekulturmedium i et vannbad ved 37 grader Celsius.Deretter forhåndsbelegger du to brønner av en seksbrønnsplate med to milliliter 10 mikrogram per milliliter kollagen IV i 45 minutter ved romtemperatur. Vask platen to ganger med PBS for å fjerne eddiksyren som brukes til å fortynne kollagenet. Bruk de belagte platene umiddelbart, eller oppbevar dem ved to til åtte grader Celsius i opptil fire uker.Rengjør kirurgiske instrumenter og arbeidsområde med 70% etanol. Deretter autoklav de kirurgiske instrumentene i 30 minutter. Etter å ha åpnet magen til en bedøvet mus, sett en sommerfuglnål inn i venstre ventrikel.For å injisere 100 mikroliter av perleoppløsningen for å utvide blodsirkulasjonen, bryt forsiktig den dårligere vena cava under nyrene med en 19-gauge nål og fortsett perfusjonen av perleoppløsningen. Fjern deretter fettvevet forsiktig med pinsett, excise begge nyrene med tynn kirurgisk saks C, og legg dem på en tallerken med en milliliter HBSS på is. Hakk nyrene med en steril skalpell i en millimeter små biter.Inkuber den hakkede nyren med en millimeter nylaget kollagenase type II i 35 minutter ved 37 grader Celsius med forsiktig vipping på en horisontal shaker. Etter fordøyelsen, legg til fire milliliter RPMI med 10% FBS for å nøytralisere kollagenasen. Filtrer det fordøyede vevet gjennom en steril 100 mikron cellesil inn i et 50 milliliter rør.Bruk bunnen av et sterilt 1,5 milliliter rør for å røre det fordøyede vevet mot silen, slik at glomeruli kan gå gjennom. Skyll cellesilen med 15 milliliter HBSS. Sentrifuger deretter gjennomstrømningen ved 200 XG i fem minutter ved romtemperatur.På dette stadiet inneholder røret tre lag. Det øvre laget inneholder mindre strukturer som tubuli, mellomlaget er perler med glomeruli, og bunnlaget inneholder rusk. Aspirer forsiktig supernatanten og det øverste hvite laget.Deretter resuspenderer pelleten som inneholder perler som bærer glomeruli og rusk i 1, 5 ml HBSS og overfører den til et to milliliter rør. Plasser røret i en magnetisk konsentrator og aspirer supernatanten før du vasker perlene to ganger med en milliliter HBSS. Plasser 20 mikroliter cellesuspensjon på et lysbilde.Deretter observerer du lysbildet under et mikroskop for Glomerulis tilstedeværelse. Deretter resuspenderer pelleten i et endotelcellevekstmedium og overfører suspensjonen til et to milliliter rør. Tilsett en mikroliter interferon gamma for hver tre milliliter medium, og plasser cellene i en seks-brønns plate for inkubering ved 33 grader Celsius.Etter tre dager med kultur, erstatt forsiktig ett milliliter medium med et friskt medium. På dette stadiet er cellene heterogene med en blanding av glomerulære celler. Etter syv dager, erstatt mediet med to milliliter friskt endotelcellevekstmedium, supplert med interferon gamma for å starte celleproliferasjon.Etter 10 dager, når cellene når 80% sammenløp, passerer dem ved hjelp av trypsin og overfører dem til en T-25 kolbe belagt med kollagen IV.Etter 21 dagers kultur, overfør celler til en T-75 kolbe. Tilsett tre milliliter 0,25% trypsin til en T-75 kolbe og inkuber cellene ved 37 grader Celsius i fem minutter. Nøytraliser deretter trypsinet med tre milliliter endotelvekstmedium og overfør suspensjonen til et 15 milliliter rør for sentrifugering ved 200 XG i fem minutter.Aspirer supernatanten og vask cellene i en milliliter PBS som inneholder 1% BSA, to millimolar EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Igjen, sentrifuger og resuspendere pelleten i 200 mikroliter CD31 antistoffbelagte perler og 800 mikroliter PBS. Inkuber cellene i 45 minutter med kontinuerlig risting ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Deretter plasserer du røret i magnetkonsentratoren og vasker cellene fire ganger med PBS som inneholder BSA, EDTA og penicillin / streptomycin. Etter den siste vasken, resuspend cellene i tre milliliter endotelvekstmedium, supplert med interferon gamma. Plate 1,5 milliliter celler per brønn i kollagen IV belagte brønner på en seks-brønns plate og kultur under permissive forhold ved 33 grader Celsius.Etter fire dager, erstatt 750 mikroliter av mediet med et friskt endotelvekstmedium, supplert med interferon gamma. Etter 10 til 14 dagers kultur, ved hjelp av et epifluorescensmikroskop med et 488 nanometer filter, observer for dyrking av CD31-positive glomerulære endotelceller, eller GEC, kolonier som uttrykker fluorescerende mitokondrier. Etter 21 dager, eller når cellene har nådd 80 til 90% sammenheng, overfør dem til en T-25 kolbe.Oppretthold kulturen med et RPMI-vekstmedium som inneholder 10% FCS. Alternativt kan celler kryopreserveres. Passasjeceller ved bruk av trypsin, som vist tidligere.Sentrifuger deretter cellene og resuspenderer pelleten i tre milliliter frysemedium. Aliquot cellene i kryorør og lagre dem i flytende nitrogen, damptemperatur. Denne protokollen beskrev en metode for isolering av glomerulære endotelceller.Fra den isolerte glomerulien begynte cellene å vokse sakte etter tre dager med kultur. Etter syv dager virket celler heterogene og viste andre glomerulære celletyper, som podocytter, parietal-, epitel- og mesangialceller. Etter å ha nådd 70 til 80% sammenløp, ble andre glomerulære celler fjernet ved hjelp av et positivt utvalg av endotelceller.MitoDendra2 GECs uttrykte CD31 og var negative for podocytmarkør, som vist ved synaptopodin negativ farging. Effekten av glukosekonsentrasjon på mitokondrienes struktur ble undersøkt. Sammenlignet med de langstrakte mitokondriene som er synlige i celler under normal glukose, induserte høy glukose fragmentering eller fisjon av mitokondrier, som observert av fremtredende sfæroidformede mitokondrier.Videre ble en 405-nanometer laser brukt til å fotokonvertere en utvalgt underpopulasjon av mitokondrier i en enkelt levende MitoDendra2 GEC. En vellykket fotoswitching av mitokondrier fra grønt til rødt i det valgte området for normale og høye glukosekonsentrasjonsbehandlede celler er vist. Denne endringen tillot å være vitne til fusjonshendelsene i MitoDendra2 GECs.Under normal glukose ble det observert gul sammenslått grønn og rød fluorescens på grunn av mitokondrier matriksfusjon. I motsetning til dette, i de høye glukosebehandlede GEC-ene, var mitokondriene hovedsakelig fragmentert. Plassering av cellene i en brønn med seks brønner med et lite volum vekstmedium er viktig for å la cellene feste seg til parabolen.De isolerte endotelcellene kan brukes til å utføre mitokondriell funksjon og strukturelle studier. Bruken av immortaliserte endotelceller med fluorescerende mitokondrier vil bane vei mot narkotikaoppdagelse. De små molekylene kan testes på cellene, og levende avbildning utføres for å undersøke deres effekt på mitokondrienes funksjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering av mikrovaskulær endotel Tubes fra Mouse Resistance arterier

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolering av mRNA Associated med gjær Mitokondrier å studere mekanismer for Localized Oversettelse

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...