Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Os autores agradecem ao Professor Cijiang He e ao Dr. Fu Jia por seus insights sobre o isolamento de células endoteliais de camundongos e agradecem ao Professor Mone Zaidi por fornecer aos camundongosexcisados PhAM e discussões valiosas. Os autores também gostariam de agradecer o CORE de Microscopia na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai e a equipe pela orientação que recebemos. Este trabalho foi apoiado por doações do subsídio R01DK097253 do National Institutes of Health e do subsídio CDMRP do Departamento de Defesa E01 W81XWH2010836 ao I.S.D.

Todos os procedimentos animais descritos aqui foram aprovados pela IACUC na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai. Usamos três camundongos machos (camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com mitocôndrias fotoativáveis [PhAM]) comprados do laboratório Jackson e mantidos em uma dieta normal de ração.
1. Condições de trabalho e preparação
<ol><li>Limpe o espaço de trabalho dentro do exaustor de fluxo laminar usando 70% de etanol e luz UV-C.</li>
	<li>Prepare os amort...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

As mitocôndrias são críticas para o metabolismo celular, homeostase e respostas ao estresse, e sua disfunção está ligada a muitas doenças, incluindo doenças renais. As mitocôndrias têm papel na geração patológica de espécies reativas excessivas de oxigênio (EROs), na regulação dos níveis intracelulares de cálcio, nas vias de morte celular e na dinâmica citoesquelética21,22,23.
O i...

O glomérulo é crítico para a filtração sanguínea, restringindo a passagem de moléculas grandes através da barreira de filtração glomerular 1,2. O glomérulo contém quatro tipos de células: células epiteliais parietais, podócitos (células epiteliais viscerais), células endoteliais glomerulares (GEC) e células mesangiais3. O endotélio glomerular é caracterizado por uma estrutura vascular única, de acordo com a presença de fenestras necessárias para grandes volumes de filtração4. A superfície apical do endotélio glomerular é coberta com uma camada de glicocálice carregada negativamente e uma camada chamada camada superficial endotelial que cria um espaço entre o endotélio e o sangue. Essa estrutura proporciona alta seletividade de carga, restringindo a passagem de moléculas carregadas negativamente, como a albumina, e prevenindo a adesão de leucócitos e plaquetas5.
Os GECs são muito sensíveis a alterações metabólicas, como a hiperglicemia associada ao meio diabético. De fato, o diabetes leva ao aumento da circulação de substâncias nocivas, à saturação das vias metabólicas da glicose e à perturbação do equilíbrio redox celular 3,6. Além disso, o aumento das espécies reativas de oxigênio induz disfunção mitocondrial, o que afeta a função endotelial7.
O objetivo geral do protocolo atual é isolar células endoteliais glomerulares imortalizadas com características mitocondriais fluorescentes. De fato, a cultura celular de GECs primários tem um ciclo proliferativo limitado e senescência precoce8. Além disso, a presença de mitocôndrias fluorescentes ajuda a examinar eventos de fissão e fusão em resposta à hiperglicemia ou a qualquer outro tratamento. Como método alternativo, outros laboratórios utilizaram o h-TERT para imortalizar células in vitro9.
O método aqui descrito permite o isolamento de células endoteliais mitoDendra2 imortalizadas condicionalmente de animais de 4 a 6 semanas de idade (Figura 1). Este protocolo detalhado descreve o uso de camundongos transgênicos (H-2K b-tsA58) abrigando o vírus símio 40 grande antígeno tumoral (SV40 TAg) gene10,11 para a geração de células termolábeis condicionalmente imortalizadas. O produto do gene tsA58 TAg é funcional à temperatura permissiva de 33 °C sob o controle do promotor de flanco induzível de 5' do gene H-2Kb do camundongo, que é aumentado acima dos níveis basais após a exposição ao interferon gama (IFNγ), mantendo, portanto, o fenótipo de proliferação condicional12. O H-2Kb é rapidamente degradado à temperatura não permissiva de 37 °C na ausência de IFNγ, removendo a função imortalizante do tsA58Tag nas células e permitindo que as células desenvolvam um fenótipo mais diferenciado13,14,15. O cruzamento opcional de camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com camundongos PhAM, que expressam uma Dendra2-verde específica para mitocôndrias (subunidade VIII da citocromo c oxidase), permite a detecção ao vivo de mitocôndrias fluorescentes16. A fluorescência verde Dendra2 muda para fluorescência vermelha após a exposição a um laser de 405 nm16. Quando as mitocôndrias se fundem após a fotocomutação, formam formas alongadas que aparecem amarelas pela troca de material verde e amarelo ou aparecem vermelhas quando sofrem fissão 7,17. Os mitoDendra2-GECs são uma ótima ferramenta para estudar as respostas celulares das mitocôndrias GEC a diferentes estímulos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

A disfunção das células endoteliais glomerulares (GEC) pode iniciar e contribuir para a quebra da barreira de filtração glomerular. O aumento do estresse oxidativo mitocondrial tem sido sugerido como um mecanismo que resulta em disfunção GEC na patogênese de algumas doenças glomerulares. Historicamente, o isolamento dos GECs dos modelos in vivo tem sido notoriamente desafiador devido às dificuldades em isolar culturas puras dos glomérulos. Os GECs têm requisitos complexos de crescimento in vitro e uma vida útil muito limitada. Aqui, descrevemos o procedimento de isolamento e cultura de GECs condicionalmente imortalizados com mitocôndrias fluorescentes, possibilitando o rastreamento de eventos de fissão e fusão mitocondriais. Os GECs foram isolados dos rins de um camundongo duplo transgênico expressando o TAg termolábil SV40 (do camundongo Immorto), promovendo condicionalmente a proliferação e suprimindo a diferenciação celular, e uma proteína fluorescente fotoconversível (Dendra2) em todas as mitocôndrias (do camundongo mitocôndrias fotoativáveis [PhAMexcised]). A linhagem celular estável gerada permite a diferenciação celular após a inativação do gene imortalizante SV40 TAg e a fotoativação de um subconjunto de mitocôndrias, causando uma mudança na fluorescência do verde para o vermelho. O uso de mitoDendra2-GECs permite imagens ao vivo dos eventos de distribuição, fusão e fissão das mitocôndrias fluorescentes sem corar as células.

Neste artigo, um protocolo detalhado para o isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes estáveis (mitoDendra2-GECs) é descrito (Figura 1). O uso de camundongos jovens de 6 a 10 semanas de idade é essencial para obter um número substancial de células saudáveis. Após 3 dias de cultura, as células começam a crescer lentamente a partir dos glomérulos isolados, como mostra a Figura 3G. Após...

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Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

O artigo descreve o método de isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente dos rins de camundongos transgênicos expressando o vírus símio termolábil 40 e mitocôndrias fotoativáveis,excisadas por PhAM. Descrevemos o procedimento para isolamento de glomérulos de rins inteiros usando contas, etapas de digestão, semeadura e cultura de GECs-CD31 positivos.

Isolamento de células endoteliais glomerulares de camundongos imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Células endoteliais glomerulares imortalizadas com mitocôndrias fluorescentes estáveis são uma ótima ferramenta para examinar o efeito de diferentes estímulos na estrutura mitocondrial in vitro. O método descrito no presente artigo produz um elevado número de células endoteliais glomerulares. Ao testar pequenas moléculas em um GEC, poderíamos rastrear a monoterapia para a doença renal diabética, onde os GECs são afetados.O método descrito é fácil de executar e não requer equipamento específico. No entanto, é importante seguir os passos descritos e esterilizar o equipamento para evitar a contaminação. Para começar, coloque os materiais de perfusão e isolamento necessários para isolar as células glomerulares renais em um espaço de trabalho.Filtre a solução salina balanceada de Hanks, ou HBSS, recém-preparada, com um filtro de 0,2 mícron e mantenha-a sob o capô para evitar a contaminação. Em seguida, misture 200 microlitros de contas magnéticas com 20 mililitros de HBSS. Pré-aqueça o PMR com 10%FCS e meio de cultura de células endoteliais em banho-maria a 37 graus Celsius.Em seguida, pré-cubra dois poços de uma placa de seis poços com dois mililitros de 10 microgramas por mililitro de colágeno IV por 45 minutos à temperatura ambiente. Lave a placa duas vezes com PBS para remover o ácido acético usado para diluir o colágeno. Use as placas revestidas imediatamente ou armazene-as a dois a oito graus Celsius por até quatro semanas.Limpe os instrumentos cirúrgicos e o espaço de trabalho com etanol a 70%. Posteriormente, autoclave os instrumentos cirúrgicos por 30 minutos. Depois de abrir o abdômen de um rato anestesiado, insira uma agulha de borboleta no ventrículo esquerdo.Para injetar 100 microlitros da solução de grânulos para expandir a circulação sanguínea, quebre cuidadosamente a veia cava inferior abaixo dos rins com uma agulha de calibre 19 e continue a perfusão da solução de contas. Em seguida, remova suavemente o tecido adiposo com pinças, excise ambos os rins com uma tesoura cirúrgica fina C e coloque-os em um prato com um mililitro de HBSS no gelo. Pique o rim com um bisturi estéril em pedaços pequenos de um milímetro.Incubar o rim picado com um milímetro de colagenase tipo II recém-preparada por 35 minutos a 37 graus Celsius com inclinação suave em um agitador horizontal. Após a digestão, adicione quatro mililitros de RPMI com 10% FBS para neutralizar a colagenase. Filtre o tecido digerido através de um filtro de células estéreis de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros.Use o fundo de um tubo estéril de 1,5 mililitro para mexer o tecido digerido contra o coador, permitindo que os glomérulos passem. Lave o filtro celular com 15 mililitros de HBSS. Em seguida, centrifugar o fluxo a 200 XG por cinco minutos à temperatura ambiente.Nesta fase, o tubo contém três camadas. A camada superior contém estruturas menores, como túbulos, a camada intermediária é de contas com glomérulos e a camada inferior contém detritos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e a camada branca superior.Em seguida, ressuspenda o pellet contendo contas com os glomérulos e detritos em 1,5 mililitros de HBSS e transfira-o para um tubo de dois mililitros. Coloque o tubo em um concentrador magnético e aspirar o sobrenadante antes de lavar as contas duas vezes com um mililitro de HBSS. Coloque 20 microlitros de suspensão celular em um slide.Em seguida, observe a lâmina sob um microscópio para a presença de glomérulos. Em seguida, ressuscite o pellet em um meio de crescimento de células endoteliais e transfira a suspensão para um tubo de dois mililitros. Adicione um microlitro de interferon gama para cada três mililitros de meio e coloque as células em uma placa de seis poços para incubação a 33 graus Celsius.Após três dias de cultura, substitua cuidadosamente o meio de um mililitro por um meio fresco. Nesta fase, as células são heterogêneas com uma mistura de células glomerulares. Após sete dias, substitua o meio por dois mililitros de meio de crescimento de células endoteliais frescas, suplementado com interferon gama para iniciar a proliferação celular.Após 10 dias, quando as células atingirem 80% de confluência, passá-las usando tripsina e transferi-las para um frasco de T-25 revestido com colágeno IV.Após 21 dias de cultura, transfira as células para um frasco de T-75. Adicionar três mililitros de tripsina a 0,25% a um frasco de T-75 e incubar as células a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, neutralize a tripsina com três mililitros de meio de crescimento endotelial e transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros para centrifugação a 200 XG por cinco minutos.Aspirar o sobrenadante e lavar as células em um mililitro de PBS contendo 1% de BSA, EDTA de dois milimolares, 1% de penicilina/estreptomicina. Novamente, centrifugar e ressuspender o pellet em 200 microlitros de contas revestidas com anticorpos CD31 e 800 microlitros de PBS. Incubar as células durante 45 minutos com agitação contínua a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, coloque o tubo no concentrador magnético e lave as células quatro vezes com PBS contendo BSA, EDTA e penicilina/estreptomicina. Após a última lavagem, ressuspender as células em três mililitros de meio de crescimento endotelial, suplementado com interferon gama. Placa de 1,5 mililitros de células por poço em poços revestidos de colágeno IV em uma placa de seis poços e cultura sob condições permissivas a 33 graus Celsius.Após quatro dias, substitua 750 microlitros do meio por um meio de crescimento endotelial fresco, suplementado com interferon gama. Após 10 a 14 dias de cultura, usando um microscópio de epifluorescência com um filtro de 488 nanômetros, observe o crescimento de células endoteliais glomerulares positivas para CD31, ou GECs, colônias que expressam mitocôndrias fluorescentes. Após 21 dias, ou quando as células tiverem atingido 80 a 90% de confluência, transferi-las para um frasco de T-25.Manter a cultura com um meio de crescimento RPMI contendo 10%FCS. Alternativamente, as células podem ser criopreservadas. Células de passagem usando tripsina, como demonstrado anteriormente.Em seguida, centrifugar as células e ressuspender o pellet em três mililitros de meio de congelamento. Aliquotar as células em tubos criogênicos e armazená-las em nitrogênio líquido, temperatura de vapor. Este protocolo descreveu um método para o isolamento de células endoteliais glomerulares.A partir dos glomérulos isolados, as células começaram a crescer lentamente após três dias de cultura. Após sete dias, as células apareceram heterogêneas e apresentaram outros tipos de células glomerulares, como podócitos, células parietais, epiteliais e mesangiais. Após atingir 70 a 80% de confluência, outras células glomerulares foram removidas usando uma seleção positiva de células endoteliais.Os GECs de MitoDendra2 expressaram CD31 e foram negativos para o marcador de podócitos, como demonstrado pela coloração negativa de sinaptopódios. O efeito da concentração de glicose na estrutura mitocondrial foi examinado. Em comparação com as mitocôndrias alongadas visíveis em células sob glicose normal, a glicose elevada induziu fragmentação ou fissão das mitocôndrias, como observado por mitocôndrias proeminentes em forma de esferoide.Além disso, um laser de 405 nanômetros foi usado para fotoconverter uma subpopulação selecionada de mitocôndrias em um único MitoDendra2 GEC vivo. Uma fotocomutação bem-sucedida de mitocôndrias de verde para vermelho na área selecionada para células tratadas com concentração normal e alta de glicose é mostrada. Esta comutação permitiu testemunhar os eventos de fusão em GECs MitoDendra2.Sob glicose normal, a fluorescência verde e vermelha amarela mesclada foi observada devido à fusão da matriz mitocondrial. Em contraste, nos GECs tratados com alta glicose, as mitocôndrias estavam principalmente fragmentadas. Colocar as células em um poço de placa de seis poços com um pequeno volume de meio de crescimento é essencial para deixar as células se ligarem ao prato.As células endoteliais isoladas poderiam ser usadas para realizar a função mitocondrial e estudos estruturais. O uso de células endoteliais imortalizadas com características mitocondriais fluorescentes abrirá o caminho para a descoberta de medicamentos. As pequenas moléculas podem ser testadas nas células, e imagens ao vivo são realizadas para examinar seu efeito na função das mitocôndrias.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biologia

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...