Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Авторы благодарят профессора Сицзян Хэ и доктора Фу Цзя за их понимание изоляции эндотелиальных клеток мышей и благодарят профессора Моне Заиди за предоставлениеPhAM иссекенных мышей и ценные дискуссии. Авторы также хотели бы поблагодарить Microscopy CORE в Медицинской школе Икана на горе Синай и сотрудников за руководство, которое мы получили. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK097253 и грантом МИНИСТЕРСТВА обороны CDMRP E01 W81XWH2010836 для I.S.D.

Все процедуры для животных, описанные здесь, были одобрены IACUC в Медицинской школе Икана на горе Синай. Мы использовали трех самцов мышей (трансгенных мышей H-2Kb-tsA58 с фотоактивируемыми митохондриями [PhAM]), купленных в лаборатории Джексона и придерживавшихся нормальной диеты чау.
<p class="jo...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Митохондрии имеют решающее значение для клеточного метаболизма, гомеостаза и стрессовых реакций, и их дисфункция связана со многими заболеваниями, включая заболевания почек. Митохондрии играют роль в патологической генерации избыточных активных форм кислорода (АФК), регуляции внутри...

Клубочек имеет решающее значение для фильтрации крови, ограничивая прохождение крупных молекул через клубочковый фильтрационный барьер 1,2. Клубочек содержит четыре типа клеток: теменные эпителиальные клетки, подоциты (висцеральные эпителиальные клетки), клубочковые эндотелиальные клетки (GEC) и мезангиальные клетки3. Клубочковый эндотелий характеризуется уникальной сосудистой структурой, в соответствии с наличием фенестр, необходимых для больших объемов фильтрации4. Апикальная поверхность клубочкового эндотелия покрыта отрицательно заряженным слоем гликокаликса и оболочкой, называемой поверхностным слоем эндотелия, которая создает пространство между эндотелием и кровью. Эта структура обеспечивает высокую селективность заряда, ограничивая прохождение отрицательно заряженных молекул, таких как альбумин, и предотвращая адгезию лейкоцитов и тромбоцитов5.
ГЭС очень чувствительны к метаболическим изменениям, таким как гипергликемия, связанная с диабетической средой. Действительно, сахарный диабет приводит к усилению циркуляции вредных веществ, насыщению путей метаболизма глюкозы, нарушению клеточного окислительно-восстановительного баланса 3,6. Кроме того, увеличение активных форм кислорода вызывает митохондриальную дисфункцию, которая влияет на функцию эндотелия7.
Общей целью текущего протокола является выделение увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриальными особенностями. Действительно, клеточная культура первичных ГЭС имеет ограниченный пролиферативный цикл и раннее старение8. Кроме того, наличие флуоресцентных митохондрий помогает исследовать события деления и слияния в ответ на гипергликемию или любое другое лечение. В качестве альтернативного метода другие лаборатории использовали h-TERT для увековечения клеток in vitro9.
Описанный здесь способ позволяет выделить условно увековеченные клубочковые эндотелиальные клетки mitoDendra2 у 4-6-недельных животных (рисунок 1). Этот подробный протокол описывает использование трансгенных мышей (H-2K b-tsA58), содержащих ген крупного опухолевого антигена обезьяны 40 (SV40 TAg)10,11 для генерации термолабильных условно увековеченных клеток. Продукт гена tsA58 TAg функционирует при разрешительной температуре 33 °C под контролем индуцируемого 5'-флангового промотора мышиного гена H-2Kb, который увеличивается выше базальных уровней при воздействии интерферона гамма (IFNγ), поэтому поддерживается условный фенотип пролиферации12. H-2Kb быстро деградирует при непермиссивной температуре 37 °C в отсутствие IFNγ, удаляя увековечивающую функцию tsA58Tag в клетках и позволяя клеткам развивать более дифференцированный фенотип 13,14,15. Необязательное скрещивание трансгенных мышей H-2Kb-tsA58 с мышами PhAM, которые экспрессируют митохондриально-специфическую (субъединицу VIII цитохром-с-оксидазы) Dendra2-green, позволяет вживую обнаружить флуоресцентные митохондрии16. Зеленая флуоресценция Dendra2 переключается на красную флуоресценцию после воздействия 405 нм лазера16. Когда митохондрии сливаются после переключения фотографий, они образуют вытянутые формы, которые кажутся желтыми от обмена зеленым и желтым материалом или кажутся красными, когда они подвергаются делению 7,17. MitoDendra2-GECs являются отличным инструментом для изучения клеточных реакций митохондрий GEC на различные стимулы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Дисфункция клубочковых эндотелиальных клеток (GEC) может инициировать и способствовать разрушению клубочкового фильтрационного барьера. Повышенный митохондриальный окислительный стресс был предложен в качестве механизма, приводящего к дисфункции GEC в патогенезе некоторых клубочковых заболеваний. Исторически изоляция ГЭС от моделей in vivo была, как известно, сложной задачей из-за трудностей в выделении чистых культур из клубочков. GEC имеют сложные требования к росту in vitro и очень ограниченную продолжительность жизни. Здесь мы описываем процедуру выделения и культивирования условно увековеченных ГЭС с флуоресцентными митохондриями, позволяющими отслеживать события деления и синтеза митохондрий. GEC были выделены из почек двойной трансгенной мыши, экспрессирующей термолабильный SV40 TAg (из Immortomouse), условно способствующий пролиферации и подавлению дифференцировки клеток, и фотоконвертируемый флуоресцентный белок (Dendra2) во всех митохондриях (от фотоактивируемых митохондрий [PhAMиссеченной] мыши). Полученная стабильная клеточная линия позволяет дифференцировать клетки после инактивации увековечивающего гена SV40 TAg и фотоактивации подмножества митохондрий, вызывая переключение флуоресценции с зеленого на красный. Использование mitoDendra2-GEC позволяет в реальном времени визуализировать события распределения, слияния и деления флуоресцентных митохондрий без окрашивания клеток.

В данной статье описан подробный протокол выделения условно увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток со стабильными флуоресцентными митохондриями (mitoDendra2-GECs) (рисунок 1). Использование молодых 6-10-недельных мышей имеет важное значение для получения значительно?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

В статье описан способ выделения условно увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток из почек трансгенных мышей, экспрессирующих термолабильный обезьяний вирус 40 и фотоактивируемых митохондрий,иссекенных PhAM. Описана процедура выделения клубочков из цельных почек с помощью шариков, стадий пищеварения, посева и культивирования GECs-CD31-положительных.

Выделение условно увековеченных мышиных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриями

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Увековеченные клубочковые эндотелиальные клетки со стабильными флуоресцентными митохондриями являются отличным инструментом для изучения влияния различных раздражителей на структуру митохондрий in vitro. Описанный способ в настоящей статье дает большое количество клубочковых эндотелиальных клеток. Тестируя небольшие молекулы на GEC, мы могли бы провести скрининг для монотерапии диабетической болезни почек, где затронуты GEC.Описанный способ прост в исполнении и не требует специального оборудования. Тем не менее, важно следовать описанным шагам и стерилизовать оборудование, чтобы избежать загрязнения. Для начала поместите перфузионные и изоляционные материалы, необходимые для изоляции клубочковых клеток почек, на рабочее пространство.Отфильтруйте свежеприготовленный раствор сбалансированной соли Хэнкса, или HBSS, с помощью 0,2-микронного фильтра и держите его под капотом, чтобы избежать загрязнения. Затем смешайте 200 микролитров магнитных шариков с 20 миллилитрами HBSS. Предваряют RPMI с 10% FCS и питательной средой эндотелиальных клеток на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.Затем предварительно обмазываем две лунки шестилуночной пластины двумя миллилитрами по 10 мкг на миллилитр коллагена IV в течение 45 минут при комнатной температуре. Дважды вымойте пластину PBS, чтобы удалить уксусную кислоту, используемую для разбавления коллагена. Немедленно используйте пластины с покрытием или храните их при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение четырех недель.Очистите хирургические инструменты и рабочее пространство 70% этанолом. Впоследствии автоклавируют хирургические инструменты в течение 30 минут. После вскрытия брюшка анестезированной мыши вставьте иглу бабочки в левый желудочек.Ввести 100 микролитров бисерного раствора для расширения кровообращения, аккуратно разбить нижнюю полую вену ниже почек иглой 19-го калибра и продолжить перфузию бисерного раствора. Далее аккуратно удаляют жировую ткань пинцетом, иссекают обе почки тонкими хирургическими ножницами С, и кладут их на тарелку с одним миллилитром HBSS на льду. Измельчите почку стерильным скальпелем на одномиллиметровые мелкие кусочки.Инкубировать измельченную почку одним миллиметром свежеприготовленной коллагеназы типа II в течение 35 минут при 37 градусах Цельсия с легким наклоном на горизонтальном шейкере. После пищеварения добавьте четыре миллилитра RPMI с 10% FBS для нейтрализации коллагеназы. Отфильтруйте переваренную ткань через стерильный 100-микронный клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку.Используйте дно стерильной 1,5-миллилитровой трубки, чтобы перемешать переваренную ткань против ситечка, позволяя клубочкам пройти. Промыть клеточный ситечко 15 миллилитрами HBSS. Затем центрифугируйте проточную обработку при 200 XG в течение пяти минут при комнатной температуре.На этом этапе трубка содержит три слоя. Верхний слой содержит более мелкие структуры, такие как канальцы, средний слой представляет собой бусины с клубочками, а нижний слой содержит мусор. Тщательно аспирируйте супернатант и верхний белый слой.Затем повторно суспендируют гранулы, содержащие шарики, несущие клубочки и мусор в 1,5 миллилитрах HBSS, и переложите его в двухмиллилитровую трубку. Поместите трубку в магнитный концентратор и аспирируйте супернатант перед тем, как дважды промыть шарики одним миллилитром HBSS. Поместите 20 микролитров клеточной суспензии на слайд.Затем понаблюдайте за скольжением под микроскопом на предмет присутствия клубочков. Затем повторно суспендируют гранулу в среде роста эндотелиальных клеток и перенесут суспензию в двухмиллилитровую трубку. Добавьте один микролитр интерферона гамма на каждые три миллилитра среды и поместите клетки в шестилуночную пластину для инкубации при 33 градусах Цельсия.После трех дней посева тщательно замените одну миллилитровую среду свежей средой. На этой стадии клетки неоднородны со смесью клубочковых клеток. Через семь дней замените среду двумя миллилитрами свежей среды роста эндотелиальных клеток, дополненной интерфероном гамма, чтобы начать пролиферацию клеток.Через 10 дней, когда клетки достигнут 80% сливаемости, проходят их с помощью трипсина и переносят в колбу Т-25, покрытую коллагеном IV.После 21 дня культивирования переложите клетки в колбу Т-75. Добавьте три миллилитра 0,25% трипсина в колбу Т-75 и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем нейтрализуют трипсин тремя миллилитрами эндотелиальной питательной среды и перенесут суспензию в 15-миллилитровую трубку для центрифугирования при 200 ХГ в течение пяти минут.Аспирировать супернатант и промыть клетки в одном миллилитре PBS, содержащем 1%BSA, двухмиллимолярный ЭДТА, 1% пенициллин/стрептомицин. Опять же, центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах шариков с покрытием антител CD31 и 800 микролитрах PBS. Инкубируйте клетки в течение 45 минут с непрерывным встряхиванием при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Затем поместите трубку в магнитный концентратор и промойте клетки четыре раза PBS, содержащим BSA, EDTA и пенициллин / стрептомицин. После последней промывки повторно суспендируют клетки в трех миллилитрах эндотелиальной питательной среды, дополненной интерфероном гамма. Пластина 1,5 миллилитра клеток на лунку в коллагеновых IV покрытых лунках на шестилуночной пластине и культурируется в разрешительных условиях при 33 градусах Цельсия.Через четыре дня заменить 750 микролитров среды свежей эндотелиальной питательной средой, дополненной интерфероном гамма. После 10-14 дней культивирования, используя эпифлуоресцентный микроскоп с 488-нанометровым фильтром, наблюдайте за ростом CD31 положительных клубочковых эндотелиальных клеток, или GEC, колоний, которые экспрессируют флуоресцентные митохондрии. Через 21 день или когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, переместите их в колбу Т-25.Поддерживайте культуру с помощью среды роста RPMI, содержащей 10% FCS. Альтернативно, клетки могут быть криоконсервированы. Прохождение клеток с использованием трипсина, как показано ранее.Затем центрифугируют клетки и повторно суспендируют гранулу в трех миллилитрах морозильной среды. Аликвотируют ячейки в криотрубки и хранят их в жидком азоте, температуре паров. Этот протокол описывал метод выделения клубочковых эндотелиальных клеток.Из изолированных клубочков клетки начали медленно расти после трех дней культивирования. Через семь дней клетки казались гетерогенными и показывали другие типы клубочковых клеток, такие как подоциты, теменные, эпителиальные и мезангиальные клетки. После достижения слияния от 70 до 80% другие клубочковые клетки удалялись с помощью положительного отбора эндотелиальных клеток.MitoDendra2 GECs экспрессировали CD31 и были отрицательными для маркера подоцитов, о чем свидетельствует отрицательное окрашивание синаптоподина. Изучено влияние концентрации глюкозы на структуру митохондрий. По сравнению с удлиненными митохондриями, видимыми в клетках при нормальной глюкозе, высокая глюкоза индуцировала фрагментацию или деление митохондрий, наблюдаемую выдающимися сфероидными митохондриями.Кроме того, 405-нанометровый лазер был использован для фотоконверсии выбранной субпопуляции митохондрий в одном живом MitoDendra2 GEC. Показана успешная фотопереключение митохондрий с зеленого на красный в выбранной области для нормальных и высокой концентрации глюкозы обработанных клеток. Это переключение позволило наблюдать за событиями слияния в MitoDendra2 GEC.При нормальной глюкозе наблюдалась желтая слитая зеленая и красная флуоресценция из-за слияния матриц митохондрий. Напротив, в ГЭС с высоким содержанием глюкозы митохондрии были в основном фрагментированы. Размещение ячеек в одной лунке из шести лунок с небольшим объемом питательной среды имеет важное значение для того, чтобы ячейки прикреплялись к тарелке.Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы для выполнения митохондриальной функции и структурных исследований. Использование увековеченных эндотелиальных клеток с флуоресцентными особенностями митохондрий проложит путь к открытию лекарств. Небольшие молекулы могут быть протестированы на клетках, и выполняется живая визуализация для изучения их влияния на функцию митохондрий.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Выделение эмбриональных клетках эндотелия желудочков

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Выделение микрососудистой эндотелиальных трубок от сопротивления мышь автомагистралях

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Выделение мРНК, связанных с митохондриях дрожжей для изучения механизмов локализованных перевода

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...