Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
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Los autores agradecen al profesor Cijiang He y al Dr. Fu Jia por sus ideas sobre el aislamiento de células endoteliales de ratones y agradecen al profesor Mone Zaidi por proporcionar los ratonesextirpados PhAM y valiosas discusiones. Los autores también desean agradecer el CORE de Microscopía en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai y al personal por la orientación que recibimos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud subvención R01DK097253 y la subvención CDMRP del Departamento de Defensa E01 W81XWH2010836 a I.S.D.

Todos los procedimientos con animales descritos aquí fueron aprobados por el IACUC en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Utilizamos tres ratones machos (ratones transgénicos H-2Kb-tsA58 con mitocondrias fotoactivables [PhAM]) comprados en el laboratorio de Jackson y mantenidos en una dieta normal de comida.
1. Condiciones de trabajo y preparativos
<ol><li>Limpie el espacio de trabajo dentro de la campana de flujo laminar utilizando etanol al 70% y luz UV-C.</li>
...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Las mitocondrias son críticas para el metabolismo celular, la homeostasis y las respuestas al estrés, y su disfunción está relacionada con muchas enfermedades, incluida la enfermedad renal. Las mitocondrias tienen un papel en la generación patológica de especies reactivas excesivas de oxígeno (ROS), la regulación de los niveles de calcio intracelular, las vías de muerte celular y la dinámica citoesquelética21,22,23.</...

El glomérulo es crítico para la filtración de la sangre al restringir el paso de moléculas grandes a través de la barrera de filtración glomerular 1,2. El glomérulo contiene cuatro tipos de células: células epiteliales parietales, podocitos (células epiteliales viscerales), células endoteliales glomerulares (GEC) y células mesangiales3. El endotelio glomerular se caracteriza por una estructura vascular única, según la presencia de fenestra requerida para grandes volúmenes de filtración4. La superficie apical del endotelio glomerular está cubierta con una capa de glicocálix cargada negativamente y una capa llamada capa superficial endotelial que crea un espacio entre el endotelio y la sangre. Esta estructura proporciona una alta selectividad de carga que restringe el paso de moléculas cargadas negativamente como la albúmina y previene la adhesión de leucocitos y plaquetas5.
Los GEC son muy sensibles a los cambios metabólicos, como la hiperglucemia asociada con el medio diabético. De hecho, la diabetes conduce a un aumento de la circulación de sustancias nocivas, la saturación de las vías del metabolismo de la glucosa y el equilibrio redox celular alterado 3,6. Además, el aumento de especies reactivas de oxígeno induce disfunción mitocondrial, que afecta la función endotelial7.
El objetivo general del protocolo actual es aislar células endoteliales glomerulares inmortalizadas con características mitocondriales fluorescentes. De hecho, el cultivo celular de GEC primarios tiene un ciclo proliferativo limitado y senescencia temprana8. Además, la presencia de mitocondrias fluorescentes ayuda a examinar los eventos de fisión y fusión en respuesta a la hiperglucemia o cualquier otro tratamiento. Como método alternativo, otros laboratorios utilizaron h-TERT para inmortalizar células in vitro9.
El método descrito aquí permite el aislamiento de células endoteliales glomerulares mitoDendra2 inmortalizadas condicionalmente de animales de 4-6 semanas de edad (Figura 1). Este protocolo detallado describe el uso de ratones transgénicos (H-2K b-tsA58) que albergan el gen 10,11 del antígeno tumoral grande del virus simio 40 (SV40 TAg) para generar células termolábiles inmortalizadas condicionalmente. El producto del gen tsA58 TAg es funcional a la temperatura permisiva de 33 °C bajo el control del promotor flanqueante 5' inducible del gen H-2K b de ratón, que aumenta por encima de los niveles basales tras la exposición al interferón gamma (IFNγ), manteniendo así el fenotipo de proliferación condicional12. H-2Kb se degrada rápidamente a la temperatura no permisiva de 37 °C en ausencia de IFNγ, eliminando la función inmortalizante del tsA58Tag en las células y permitiendo que las células desarrollen un fenotipo más diferenciado13,14,15. El cruce opcional de ratones transgénicos H-2Kb-tsA58 con ratones PhAM, que expresan una mitocondria específica (subunidad VIII de la citocromo c oxidasa) Dendra2-verde, permite la detección en vivo de mitocondriasfluorescentes 16. La fluorescencia verde Dendra2 cambia a fluorescencia roja después de la exposición a un láser de 405 nm16. Cuando las mitocondrias se fusionan después del fotocambio, forman formas alargadas que aparecen amarillas por el intercambio de material verde y amarillo o aparecen rojas cuando se someten a fisión 7,17. Los mitoDendra2-GECs son una gran herramienta para estudiar las respuestas celulares de las mitocondrias GEC a diferentes estímulos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

La disfunción de las células endoteliales glomerulares (GEC) puede iniciar y contribuir a la ruptura de la barrera de filtración glomerular. El aumento del estrés oxidativo mitocondrial se ha sugerido como un mecanismo que resulta en la disfunción del GEC en la patogénesis de algunas enfermedades glomerulares. Históricamente, el aislamiento de los GEC de los modelos in vivo ha sido notoriamente desafiante debido a las dificultades para aislar los cultivos puros de los glomérulos. Los GEC tienen requisitos de crecimiento complejos in vitro y una vida útil muy limitada. Aquí, describimos el procedimiento para aislar y cultivar GEC inmortalizados condicionalmente con mitocondrias fluorescentes, lo que permite el seguimiento de los eventos de fisión y fusión mitocondrial. Los GEC se aislaron de los riñones de un ratón transgénico doble que expresaba el TAg SV40 termolábil (del Immortomouse), promoviendo condicionalmente la proliferación y suprimiendo la diferenciación celular, y una proteína fluorescente fotoconvertible (Dendra2) en todas las mitocondrias (del ratón mitocondria fotoactivable [PhAMextirpado]). La línea celular estable generada permite la diferenciación celular después de la inactivación del gen inmortalizante SV40 TAg y la fotoactivación de un subconjunto de mitocondrias que causan un cambio en la fluorescencia de verde a rojo. El uso de mitoDendra2-GEC permite obtener imágenes en vivo de los eventos de distribución, fusión y fisión de las mitocondrias fluorescentes sin teñir las células.

En este artículo, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de células endoteliales glomerulares inmortalizadas condicionalmente con mitocondrias fluorescentes estables (mitoDendra2-GEC) (Figura 1). El uso de ratones jóvenes de 6-10 semanas de edad es esencial para obtener un número sustancial de células sanas. Después de 3 días de cultivo, las células comienzan a crecer lentamente a partir de los glomérulos aislados, como se muestra en la Figura 3G...

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Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

El artículo describe el método para aislar células endoteliales glomerulares inmortalizadas condicionalmente de los riñones de ratones transgénicos que expresan el virus simio termolábil 40 y las mitocondrias fotoactivables, PhAMextirpado. Describimos el procedimiento para el aislamiento de glomérulos de riñones enteros utilizando perlas, pasos de digestión, siembra y cultivo de GECs-CD31 positivos.

Aislamiento de células endoteliales glomerulares de ratón condicionalmente inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Las células endoteliales glomerulares inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes estables son una gran herramienta para examinar el efecto de diferentes estímulos sobre la estructura mitocondrial in vitro. El método descrito en el presente artículo produce un alto número de células endoteliales glomerulares. Al probar moléculas pequeñas en un GEC, podríamos detectar la monoterapia para la enfermedad renal diabética donde los GEC se ven afectados.El método descrito es fácil de realizar y no requiere equipo específico. Sin embargo, es importante seguir los pasos descritos y esterilizar el equipo para evitar la contaminación. Para comenzar, coloque los materiales de perfusión y aislamiento necesarios para aislar las células glomerulares renales en un espacio de trabajo.Filtre la solución salina recién preparada de Hanks'Balanced, o HBSS, con un filtro de 0,2 micras, y manténgala debajo del capó para evitar la contaminación. Luego, mezcle 200 microlitros de perlas magnéticas con 20 mililitros de HBSS. Precaliente el RPMI con FCS al 10% y medio de cultivo de células endoteliales en un baño de agua a 37 grados centígrados.Luego, recubra previamente dos pocillos de una placa de seis pocillos con dos mililitros de 10 microgramos por mililitro de colágeno IV durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lave la placa dos veces con PBS para eliminar el ácido acético utilizado para diluir el colágeno. Use las placas recubiertas inmediatamente, o guárdelas a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de cuatro semanas.Limpie los instrumentos quirúrgicos y el espacio de trabajo con etanol al 70%. Posteriormente, autoclave los instrumentos quirúrgicos durante 30 minutos. Después de abrir el abdomen de un ratón anestesiado, inserte una aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo.Para inyectar 100 microlitros de la solución de perlas para expandir la circulación sanguínea, rompa cuidadosamente la vena cava inferior debajo de los riñones con una aguja de calibre 19 y continúe la perfusión de la solución de perlas. A continuación, retire suavemente el tejido graso con pinzas, extirpe ambos riñones con tijeras quirúrgicas delgadas C y colóquelos en un plato con un mililitro de HBSS en hielo. Picar el riñón con un bisturí estéril en trozos pequeños de un milímetro.Incubar el riñón picado con un milímetro de colagenasa tipo II recién preparada durante 35 minutos a 37 grados centígrados con una suave inclinación sobre una coctelera horizontal. Después de la digestión, agregue cuatro mililitros de RPMI con 10% FBS para neutralizar la colagenasa. Filtre el tejido digerido a través de un colador de células estéril de 100 micras en un tubo de 50 mililitros.Use el fondo de un tubo estéril de 1.5 mililitros para agitar el tejido digerido contra el colador, permitiendo que los glomérulos pasen. Enjuague el colador celular con 15 mililitros de HBSS. Luego, centrifugar el flujo a 200 XG durante cinco minutos a temperatura ambiente.En esta etapa, el tubo contiene tres capas. La capa superior contiene estructuras más pequeñas como túbulos, la capa intermedia son cuentas con glomérulos y la capa inferior contiene desechos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y la capa blanca superior.Luego, vuelva a suspender el pellet que contiene perlas que llevan los glomérulos y los desechos en 1.5 mililitros de HBSS y transfiéralo a un tubo de dos mililitros. Coloque el tubo en un concentrador magnético y aspire el sobrenadante antes de lavar las perlas dos veces con un mililitro de HBSS. Coloque 20 microlitros de suspensión celular en un portaobjetos.Luego, observe el portaobjetos bajo un microscopio para detectar la presencia de glomérulos. A continuación, resuspenda el pellet en un medio de crecimiento celular endotelial y transfiera la suspensión a un tubo de dos mililitros. Agregue un microlitro de interferón gamma por cada tres mililitros de medio, y coloque las células en una placa de seis pocillos para incubar a 33 grados centígrados.Después de tres días de cultivo, reemplace cuidadosamente el medio de un mililitro con un medio fresco. En esta etapa, las células son heterogéneas con una mezcla de células glomerulares. Después de siete días, reemplace el medio con dos mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales frescas, complementado con interferón gamma para iniciar la proliferación de las células.Después de 10 días, cuando las células alcancen el 80% de confluencia, pasarlas usando tripsina y transferirlas a un matraz T-25 recubierto con colágeno IV.Después de 21 días de cultivo, transferir las células a un matraz T-75. Añadir tres mililitros de tripsina al 0,25% a un matraz T-75 e incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, neutralice la tripsina con tres mililitros de medio de crecimiento endotelial y transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros para centrifugación a 200 XG durante cinco minutos.Aspirar el sobrenadante y lavar las células en un mililitro de PBS que contenga 1% BSA, EDTA de dos milimolares, 1% de penicilina/estreptomicina. Nuevamente, centrifugar y resuspender el pellet en 200 microlitros de perlas recubiertas de anticuerpos CD31 y 800 microlitros de PBS. Incubar las células durante 45 minutos con agitación continua a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Luego, coloque el tubo en el concentrador magnético y lave las celdas cuatro veces con PBS que contenga BSA, EDTA y penicilina/estreptomicina. Después del último lavado, resuspender las células en tres mililitros de medio de crecimiento endotelial, complementado con interferón gamma. Placa 1,5 mililitros de células por pocillo en pocillos recubiertos de colágeno IV en una placa de seis pocillos y cultivo en condiciones permisivas a 33 grados centígrados.Después de cuatro días, reemplace 750 microlitros del medio con un medio de crecimiento endotelial fresco, complementado con interferón gamma. Después de 10 a 14 días de cultivo, utilizando un microscopio de epifluorescencia con un filtro de 488 nanómetros, observe el crecimiento de células endoteliales glomerulares CD31 positivas, o GEC, colonias que expresan mitocondrias fluorescentes. Después de 21 días, o cuando las células hayan alcanzado el 80 al 90% de confluencia, transferirlas a un matraz T-25.Mantener el cultivo con un medio de crecimiento RPMI que contenga 10% de FCS. Alternativamente, las células pueden ser criopreservadas. Células de paso usando tripsina, como se demostró anteriormente.Luego, centrifuga las células y resuspende el pellet en tres mililitros de medio de congelación. Alícuota las células en tubos criogénicos y almacénelas en nitrógeno líquido, temperatura de vapor. Este protocolo describió un método para el aislamiento de células endoteliales glomerulares.A partir de los glomérulos aislados, las células comenzaron a crecer lentamente después de tres días de cultivo. Después de siete días, las células parecían heterogéneas y mostraban otros tipos de células glomerulares, como podocitos, parietales, epiteliales y mesangiales. Después de alcanzar una confluencia del 70 al 80%, se eliminaron otras células glomerulares utilizando una selección positiva de células endoteliales.Los GEC de MitoDendra2 expresaron CD31 y fueron negativos para el marcador de podocitos, como se muestra en la tinción negativa de sinaptopodina. Se examinó el efecto de la concentración de glucosa en la estructura de las mitocondrias. En comparación con las mitocondrias alargadas visibles en las células bajo glucosa normal, la glucosa alta indujo fragmentación o fisión de las mitocondrias, como se observa en las mitocondrias prominentes en forma de esferoide.Además, se utilizó un láser de 405 nanómetros para fotoconvertir una subpoblación seleccionada de mitocondrias en un solo GEC vivo de MitoDendra2. Se muestra un fotocambio exitoso de las mitocondrias de verde a rojo en el área seleccionada para las células tratadas con concentración normal y alta de glucosa. Este cambio permitió presenciar los eventos de fusión en los GEC MitoDendra2.Bajo glucosa normal, se observó fluorescencia verde y roja amarilla combinada debido a la fusión de la matriz mitocondria. En contraste, en los GEC tratados con alta glucosa, las mitocondrias estaban principalmente fragmentadas. Colocar las células en un pocillo de placa de seis pocillos con un pequeño volumen de medio de crecimiento es esencial para permitir que las células se adhieran al plato.Las células endoteliales aisladas podrían usarse para realizar estudios estructurales y de función mitocondrial. El uso de células endoteliales inmortalizadas con características mitocondriales fluorescentes allanará el camino hacia el descubrimiento de fármacos. Las moléculas pequeñas podrían probarse en las células, y se realizan imágenes en vivo para examinar su efecto sobre la función de las mitocondrias.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

El aislamiento de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Investigación

Biología

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Aislamiento de células endoteliales valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Aislamiento de células endoteliales embrionarias ventriculares

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias