Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Författarna tackar professor Cijiang He och Dr. Fu Jia för deras insikter i möss endotelcellisolering och tackar professor Mone Zaidi för att ha tillhandahållit dePhAM-utskurna mössen och värdefulla diskussioner. Författarna vill också erkänna mikroskopi CORE vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai och personal för den vägledning vi fick. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health-bidrag R01DK097253 och Department of Defense CDMRP-bidrag E01 W81XWH2010836 till I.S.D.

Alla djurförsök som beskrivs här godkändes av IACUC vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai. Vi använde tre hanmöss (H-2Kb-tsA58 transgena möss med fotoaktiverbara mitokondrier [PhAM]) köpta från Jackson lab och höll på en normal chow-diet.
1. Arbetsförhållanden och förberedelser
<ol><li>Rengör arbetsutrymmet inuti den laminära flödeshuven med 70% etanol och UV-C-ljus.</li>
	<li>Förbered pärlans tvättbuffertar. Gör buffert-1 med 0,1 M natriumfosfat ...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Mitokondrier är avgörande för cellulär metabolism, homeostas och stressreaktioner, och deras dysfunktion är kopplad till många sjukdomar, inklusive njursjukdom. Mitokondrier har en roll i den patologiska genereringen av överdriven reaktiva syrearter (ROS), regleringen av intracellulära kalciumnivåer, celldödsvägar och cytoskeletal dynamik21,22,23.
Isoleringen av murina GEC är utmanande på...

Glomerulus är avgörande för blodfiltrering genom att begränsa passagen av stora molekyler genom den glomerulära filtreringsbarriären 1,2. Glomerulus innehåller fyra celltyper: parietala epitelceller, podocyter (viscerala epitelceller), glomerulära endotelceller (GEC) och mesangiala celler3. Det glomerulära endotelet kännetecknas av en unik vaskulär struktur, enligt närvaron av fenestrae som krävs för stora filtreringsvolymer4. Den apikala ytan av det glomerulära endotelet är täckt med ett negativt laddat glykokalyxskikt och en beläggning som kallas endotelytskiktet som skapar ett utrymme mellan endotelet och blodet. Denna struktur ger hög laddningsselektivitet som begränsar passagen av negativt laddade molekyler såsom albumin och förhindrar leukocyt- och trombocytadhesion5.
GEC är mycket känsliga för metaboliska förändringar, såsom hyperglykemi i samband med diabetesmiljön. Faktum är att diabetes leder till ökad cirkulation av skadliga ämnen, mättnad av glukosmetabolismvägar och störd cellulär redoxbalans 3,6. Dessutom inducerar ökningen av reaktiva syrearter mitokondriell dysfunktion, vilket påverkar endotelfunktionen7.
Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att isolera odödliga glomerulära endotelceller med fluorescerande mitokondriella egenskaper. Faktum är att cellkulturen hos primära GEC har en begränsad proliferativ cykel och tidig åldrande8. Dessutom hjälper närvaron av fluorescerande mitokondrier att undersöka fissions- och fusionshändelser som svar på hyperglykemi eller någon annan behandling. Som en alternativ metod använde andra laboratorier h-TERT för att föreviga celler in vitro9.
Metoden som beskrivs här möjliggör isolering av villkorligt odödliggjorda mitoDendra2 glomerulära endotelceller från 4-6 veckor gamla djur (Figur 1). Detta detaljerade protokoll beskriver användningen av transgena möss (H-2K b-tsA58) som hyser simianvirus 40 stort tumörantigen (SV40 TAg) gen10,11 för att generera termolabila villkorligt odödliga celler. TSA58 TAg-genprodukten är funktionell vid den tillåtna temperaturen 33 °C under kontroll av den inducerbara 5'-flankerande promotorn för musens H-2Kb-gen, som ökas över basalnivåerna vid exponering för interferon gamma (IFNγ), vilket upprätthåller den villkorliga proliferationsfenotypen12. H-2Kb bryts snabbt ned vid den icke-tillåtna temperaturen 37 °C i frånvaro av IFNγ, vilket avlägsnar den förevigande funktionen hos tsA58Tag i celler och låter cellerna utveckla en mer differentierad fenotyp13,14,15. Valfri korsning av H-2Kb-tsA58 transgena möss med PhAM-möss, som uttrycker en mitokondrierspecifik (subenhet VIII av cytokrom c-oxidas) Dendra2-grön, möjliggör levande detektion av fluorescerande mitokondrier16. Dendra2 grön fluorescens växlar till röd fluorescens efter exponering för en 405 nm laser16. När mitokondrier smälter samman efter fotobyte bildar de långsträckta former som verkar gula från utbytet av grönt och gult material eller verkar röda när de genomgår fission 7,17. MitoDendra2-GEC är ett utmärkt verktyg för att studera de cellulära svaren från GEC mitokondrier på olika stimuli.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunktion kan initiera och bidra till glomerulär filtreringsbarriärnedbrytning. Ökad mitokondriell oxidativ stress har föreslagits som en mekanism som resulterar i GEC-dysfunktion i patogenesen av vissa glomerulära sjukdomar. Historiskt sett har isoleringen av GEC från in vivo-modeller varit notoriskt utmanande på grund av svårigheter att isolera rena kulturer från glomeruli. GEC har komplexa tillväxtkrav in vitro och en mycket begränsad livslängd. Här beskriver vi proceduren för att isolera och odla villkorligt förevigade GEC med fluorescerande mitokondrier, vilket möjliggör spårning av mitokondriell fission och fusionshändelser. GEC isolerades från njurarna hos en dubbel transgen mus som uttrycker den termolabila SV40 TAg (från Immortomouse), vilket villkorligt främjar proliferation och undertrycker celldifferentiering och ett fotokonvertibelt fluorescerande protein (Dendra2) i alla mitokondrier (från den fotoaktiverbara mitokondrierna [PhAMutskuren] musen). Den stabila cellinjen som genereras möjliggör celldifferentiering efter inaktivering av den odödliga SV40 TAg-genen och fotoaktivering av en delmängd av mitokondrier som orsakar en övergång i fluorescens från grönt till rött. Användningen av mitoDendra2-GEC möjliggör levande avbildning av fluorescerande mitokondriers distribution, fusion och fissionshändelser utan att färga cellerna.

I denna artikel beskrivs ett detaljerat protokoll för isolering av villkorligt odödliga glomerulära endotelceller med stabila fluorescerande mitokondrier (mitoDendra2-GEC) (Figur 1). Användningen av unga 6-10 veckor gamla möss är avgörande för att få ett stort antal friska celler. Efter 3 dagars odling börjar cellerna växa långsamt från de isolerade glomeruli, som visas i figur 3G. Efter 7 dagar är cellerna heterogena och visar andra glomerulära c...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Artikeln beskriver metoden för att isolera villkorligt förevigade glomerulära endotelceller från njurarna hos transgena möss som uttrycker det termolabila simianviruset 40 och fotoaktiverbara mitokondrier, PhAMutskurna. Vi beskriver proceduren för glomeruliisolering från hela njurar med hjälp av pärlor, matsmältningssteg, sådd och odling av GEC-CD31-positiva.

Isolering av villkorligt förevigade musglomerulära endotelceller med fluorescerande mitokondrier

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Odödliga glomerulära endotelceller med stabila fluorescerande mitokondrier är ett utmärkt verktyg för att undersöka effekten av olika stimuli på mitokondriell struktur in vitro. Den beskrivna metoden i den aktuella artikeln ger ett stort antal glomerulära endotelceller. Genom att testa små molekyler på en GEC kunde vi screena för monoterapi för diabetisk njursjukdom där GEC påverkas.Den beskrivna metoden är lätt att utföra och kräver ingen specifik utrustning. Det är dock viktigt att följa de beskrivna stegen och sterilisera utrustningen för att undvika kontaminering. För att börja, placera de perfusions- och isoleringsmaterial som krävs för att isolera njurglomerulära celler på en arbetsyta.Filtrera den nyberedda Hanks'Balanced Salt Solution, eller HBSS, med ett 0,2 mikron filter och håll den under huven för att undvika kontaminering. Blanda sedan 200 mikroliter magnetiska pärlor med 20 ml HBSS. Förvärm RPMI med 10% FCS och endotelcellodlingsmedium i ett vattenbad vid 37 grader Celsius.Täck sedan två brunnar av en sexbrunnsplatta med två milliliter 10 mikrogram per milliliter kollagen IV i 45 minuter vid rumstemperatur. Tvätta plattan två gånger med PBS för att ta bort ättiksyran som används för att späda kollagenet. Använd de belagda plattorna omedelbart eller förvara dem vid två till åtta grader Celsius i upp till fyra veckor.Rengör de kirurgiska instrumenten och arbetsytan med 70% etanol. Därefter autoklav de kirurgiska instrumenten i 30 minuter. Efter att ha öppnat buken på en bedövad mus, sätt in en fjärilsnål i vänster kammare.För att injicera 100 mikroliter av pärllösningen för att expandera blodcirkulationen, bryt försiktigt den underlägsna vena cava under njurarna med en 19-gauge nål och fortsätt perfusionen av pärllösningen. Ta sedan försiktigt bort fettvävnaden med pincett, skär ut båda njurarna med tunn kirurgisk sax C och lägg dem på en tallrik med en milliliter HBSS på is. Hacka njuren med en steril skalpell i en millimeter små bitar.Inkubera den malet njuren med en millimeter nyberedd kollagenas typ II i 35 minuter vid 37 grader Celsius med mild lutning på en horisontell shaker. Efter matsmältningen, tillsätt fyra milliliter RPMI med 10% FBS för att neutralisera kollagenaset. Filtrera den smälta vävnaden genom en steril 100-mikron cellsil i ett 50-milliliter rör.Använd botten av ett sterilt 1,5-milliliterrör för att röra den smälta vävnaden mot silen, så att glomeruli kan gå igenom. Skölj cellsilen med 15 ml HBSS. Centrifugera sedan genomströmningen vid 200 XG i fem minuter vid rumstemperatur.I detta skede innehåller röret tre lager. Det övre lagret innehåller mindre strukturer som tubuler, mellanskiktet är pärlor med glomeruli och bottenskiktet innehåller skräp. Aspirera försiktigt supernatanten och det övre vita lagret.Återsuspendera sedan pelleten som innehåller pärlor som bär glomeruli och skräp i 1,5 ml HBSS och överför den till ett två-milliliter rör. Placera röret i en magnetisk koncentrator och aspirera supernatanten innan du tvättar pärlorna två gånger med en milliliter HBSS. Placera 20 mikroliter cellsuspension på en bild.Observera sedan bilden under ett mikroskop för glomerulis närvaro. Därefter återsuspendera pelleten i ett endotelcelltillväxtmedium och överför suspensionen till ett två-milliliter rör. Tillsätt en mikroliter interferon gamma för varje tre milliliter medium och placera cellerna i en sexbrunnsplatta för inkubation vid 33 grader Celsius.Efter tre dagars kultur, byt försiktigt ut ett millilitermedium med ett nytt medium. I detta skede är cellerna heterogena med en blandning av glomerulära celler. Efter sju dagar, ersätt mediet med två milliliter färskt endotelcellstillväxtmedium, kompletterat med interferon gamma för att starta cellernas spridning.Efter 10 dagar, när cellerna når 80% sammanflöde, passera dem med trypsin och överför dem till en T-25-kolv belagd med kollagen IV.Efter 21 dagars odling, överför celler till en T-75-kolv. Tillsätt tre milliliter 0,25% trypsin till en T-75-kolv och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i fem minuter. Neutralisera sedan trypsin med tre milliliter endoteltillväxtmedium och överför suspensionen till ett 15-milliliter rör för centrifugering vid 200 XG i fem minuter.Aspirera supernatanten och tvätta cellerna i en milliliter PBS innehållande 1% BSA, två millimolar EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Återigen, centrifugera och återsuspendera pelleten i 200 mikroliter CD31 antikroppsbelagda pärlor och 800 mikroliter PBS. Inkubera cellerna i 45 minuter med kontinuerlig skakning vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Placera sedan röret i magnetkoncentratorn och tvätta cellerna fyra gånger med PBS som innehåller BSA, EDTA och penicillin / streptomycin. Efter den sista tvätten, återsuspendera cellerna i tre milliliter endoteltillväxtmedium, kompletterat med interferon gamma. Platta 1,5 ml celler per brunn i kollagen IV-belagda brunnar på en sexbrunnsplatta och odling under tillåtna förhållanden vid 33 grader Celsius.Efter fyra dagar, byt ut 750 mikroliter av mediet med ett nytt endoteltillväxtmedium, kompletterat med interferon gamma. Efter 10 till 14 dagars odling, med hjälp av ett epifluorescensmikroskop med ett 488-nanometerfilter, observera för odling av CD31-positiva glomerulära endotelceller, eller GECs, kolonier som uttrycker fluorescerande mitokondrier. Efter 21 dagar, eller när cellerna har nått 80 till 90% sammanflöde, överför dem till en T-25-kolv.Behåll kulturen med ett RPMI-tillväxtmedium som innehåller 10% FCS. Alternativt kan celler kryokonserveras. Passageceller med trypsin, som visats tidigare.Centrifugera sedan cellerna och återsuspendera pelleten i tre milliliter frysmedium. Alikvotera cellerna i kryorör och förvara dem i flytande kväve, ångtemperatur. Detta protokoll beskrev en metod för isolering av glomerulära endotelceller.Från de isolerade glomeruli började cellerna växa långsamt efter tre dagars odling. Efter sju dagar verkade cellerna heterogena och visade andra glomerulära celltyper, såsom podocyter, parietala, epitelala och mesangiala celler. Efter att ha nått 70 till 80% sammanflöde avlägsnades andra glomerulära celler med hjälp av ett positivt urval av endotelceller.MitoDendra2 GEC uttryckte CD31 och var negativa för podocytmarkör, vilket visas genom synaptopodinnegativ färgning. Effekten av glukoskoncentration på mitokondristrukturen undersöktes. Jämfört med de långsträckta mitokondrierna som är synliga i celler under normal glukos, inducerad fragmentering eller fission av mitokondrier, som observerats av framträdande sfäroidformade mitokondrier.Dessutom användes en 405-nanometer laser för att fotokonvertera en utvald delpopulation av mitokondrier i en enda levande MitoDendra2 GEC. En framgångsrik fotoväxling av mitokondrier från grönt till rött i det valda området för normala och höga glukoskoncentrationsbehandlade celler visas. Denna växling gjorde det möjligt att bevittna fusionshändelserna i MitoDendra2 GEC.Under normal glukos observerades gul sammanslagen grön och röd fluorescens på grund av mitokondrier matrisfusion. Däremot var mitokondrierna huvudsakligen fragmenterade i de högglukosbehandlade GEC: erna. Att placera cellerna i en brunn med sex brunnar med en liten volym tillväxtmedium är viktigt för att låta cellerna fästa vid skålen.De isolerade endotelcellerna skulle kunna användas för att utföra mitokondriella funktions- och strukturstudier. Användningen av odödliga endotelceller med fluorescerande mitokondrier kommer att bana väg för läkemedelsupptäckt. De små molekylerna kan testas på cellerna, och levande avbildning utförs för att undersöka deras effekt på mitokondriernas funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolering av mänskliga Endothelial Umbilical Vein Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolering av valvulär endotelceller

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolering och odling av pulmonell endotelceller från neonatala möss

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonala Ventrikulära Endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering av Microvascular Endothelial Rör från mus Resistance Artärer

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Isolering av mRNA associerad med jäst Mitokondrier att studera mekanismer för lokal Översättning

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...