Name: isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria
Uploaded: 2022-09-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Yazarlar, farelerin endotel hücre izolasyonu konusundaki görüşleri için Profesör Cijiang He ve Dr. Fu Jia'ya teşekkür ediyor ve PhAMeksize edilmiş fareleri ve değerli tartışmaları sağladığı için Profesör Mone Zaidi'ye teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Mikroskopi CORE'a ve aldığımız rehberlik için personele teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01DK097253 ve Savunma Bakanlığı CDMRP hibesi E01 W81XWH2010836'dan I.S.D.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki IACUC tarafından onaylanmıştır. Jackson laboratuvarından satın alınan ve normal bir chow diyetinde tutulan üç erkek fare (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAM]'li H-2Kb-tsA58 transgenik fareler) kullandık.
1. Çalışma koşulları ve hazırlıklar
<ol><li>Laminer akış davlumbazının içindeki çalışma alanını %70 etanol ve UV-C ışığı kullanarak temizleyin.</l...

<ol>
	<li>Daehn, I. S., Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glomerular+filtration+barrier:+A+structural+target+for+novel+kidney+therapies.">The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).</li><li>Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+injury+and+cross+talk+in+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).</li><li>Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+early+diabetic+kidney+disease:+Glomerular+endothelial+cell+dysfunction.">Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).</li><li>Haraldsson, B., Jeansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+filtration+barrier.">Glomerular filtration barrier.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).</li><li>Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+glycocalyx+in+health+and+disease.">The role of endothelial glycocalyx in health and disease.</a> Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).</li><li>Giacco, F., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+diabetic+complications.">Oxidative stress and diabetic complications.</a> Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).</li><li>Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+cell+stress+and+cross-talk+With+podocytes+in+early+[corrected]+diabetic+kidney+disease.">Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease.</a> Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Wieser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hTERT+alone+immortalizes+epithelial+cells+of+renal+proximal+tubules+without+changing+their+functional+characteristics.">hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-+tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Jat, P. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+established+by+a+temperature-sensitive+simian+virus+40+large-+T-antigen+gene+are+growth+restricted+at+the+nonpermissive+temperature.">Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).</li><li>Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+response+sequence+potentiates+activity+of+an+enhancer+in+the+promoter+region+of+a+mouse+H-2+gene.">Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene.</a> Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).</li><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li><li>Rops, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cell+lines.">Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines.</a> Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--Mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Casalena, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetic+microenvironment+causes+mitochondrial+oxidative+stress+in+glomerular+endothelial+cells+and+pathological+crosstalk+with+podocytes.">The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+endothelial+mitochondrial+dysfunction+is+essential+and+characteristic+of+diabetic+kidney+disease+susceptibility.">Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility.</a> Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).</li><li>Akis, N., Madaio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+characterization+of+endothelial+cells+from+mouse+glomeruli.">Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli.</a> Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).</li><li>Schuler, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1-mediated+mitochondrial+positioning+shapes+intracellular+energy+gradients+required+for+cell+migration.">Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+kidney+injury+and+repair.">Mitochondrial quality control in kidney injury and repair.</a> Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).</li><li>Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+tether+to+Focal+Adhesions+during+cell+migration+and+regulate+their+size.">Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size.</a> bioRxiv. , 827998 (2019).</li><li>Dylewski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification,+and+conditional+immortalization+of+murine+glomerular+endothelial+cells+of+microvascular+phenotype.">Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype.</a> MethodsX. 7, 101048 (2020).</li><li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures:+Incidence,+sources,+effects,+detection,+elimination,+prevention.">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li></ol>

Mitokondri, hücresel metabolizma, homeostaz ve stres yanıtları için kritik öneme sahiptir ve işlev bozuklukları böbrek hastalığı da dahil olmak üzere birçok hastalıkla bağlantılıdır. Mitokondri, aşırı reaktif oksijen türlerinin (ROS) patolojik oluşumunda, hücre içi kalsiyum düzeylerinin düzenlenmesinde, hücre ölüm yolaklarında ve sitoiskelet dinamiklerinde rol oynamaktadır21,22,23.
<p class="j...

Glomerulus, büyük moleküllerin glomerüler filtrasyon bariyeri 1,2'den geçişini kısıtlayarak kan filtrasyonu için kritik öneme sahiptir. Glomerulus dört hücre tipi içerir: parietal epitel hücreleri, podositler (viseral epitel hücreleri), glomerüler endotel hücreleri (GEC) ve mezangial hücreler3. Glomerüler endotel, büyük filtrasyon hacimleri için gerekli olan fenestra varlığına göre benzersiz bir vasküler yapı ile karakterizedir4. Glomerüler endotelin apikal yüzeyi, negatif yüklü bir glikokaliks tabakası ve endotel ile kan arasında bir boşluk yaratan endotel yüzey tabakası adı verilen bir kat ile kaplıdır. Bu yapı, albümin gibi negatif yüklü moleküllerin geçişini kısıtlayan, lökosit ve trombosit yapışmasını önleyen yüksek yüklü seçicilik sağlar5.
GEC'ler, diyabetik çevre ile ilişkili hiperglisemi gibi metabolik değişikliklere karşı çok hassastır. Gerçekten de, diyabet zararlı maddelerin dolaşımının artmasına, glikoz metabolizması yollarının doygunluğuna ve bozulmuş hücresel redoks dengesine yol açar 3,6. Ayrıca, reaktif oksijen türlerindeki artış, endotel fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal disfonksiyona nedenolur 7.
Mevcut protokolün genel amacı, floresan mitokondriyal özelliklere sahip ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerini izole etmektir. Gerçekten de, primer GEC'lerin hücre kültürü sınırlı bir proliferatif döngüye ve erken yaşlanmaya sahiptir8. Ek olarak, floresan mitokondrinin varlığı, hiperglisemi veya başka herhangi bir tedaviye yanıt olarak fisyon ve füzyon olaylarının incelenmesine yardımcı olur. Alternatif bir yöntem olarak, diğer laboratuvarlar in vitro9 hücrelerini ölümsüzleştirmek için h-TERT kullandılar.
Burada tarif edilen yöntem, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş mitoDendra2 glomerüler endotel hücrelerinin 4-6 haftalık hayvanlardan izole edilmesini sağlar (Şekil 1). Bu ayrıntılı protokol, termolabil şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için simian virüsü 40 büyük tümör antijeni (SV40 TAg) geni10,11'i barındıran transgenik farelerin (H-2Kb-tsA58) kullanımını açıklar. tsA58 TAg gen ürünü, fare H-2Kb geninin indüklenebilir 5' yan promotörünün kontrolü altında 33 ° C'lik izin verilen sıcaklıkta işlevseldir, bu da interferon gamaya (IFNγ) maruz kalındığında bazal seviyelerin üzerine çıkarılır, bu nedenle koşullu proliferasyon fenotip12'yi korur. H-2K b, IFNγ'nun yokluğunda izin verilmeyen 37 ° C'lik sıcaklıkta hızla parçalanır, tsA58Tag'in hücrelerdeki ölümsüzleştirme işlevini ortadan kaldırır ve hücrelerin daha farklılaşmış bir fenotip13,14,15 geliştirmesine izin verir. H-2Kb-tsA58 transgenik farelerin, mitokondriye özgü (sitokrom c oksidazın alt birimi VIII) Dendra2-yeşilini ifade eden PhAM fareleri ile isteğe bağlı geçişi, floresan mitokondri16'nın canlı tespitine izin verir. Dendra2 yeşil floresan, 405 nm lazer16'ya maruz kaldıktan sonra kırmızı floresana geçer. Mitokondri foto-anahtarlamadan sonra kaynaştığında, yeşil ve sarı malzemenin değişiminden sarı görünen veya fisyona uğradıklarında kırmızı görünen uzun şekiller oluştururlar 7,17. MitoDendra2-GEC'ler, GEC mitokondrisinin farklı uyaranlara hücresel tepkilerini incelemek için harika bir araçtır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Insulin Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G butterfly</td>
			<td>BD</td>
			<td>367298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm cutting edge scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30ml syringe</td>
			<td>BD Biooscience</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m nylon mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C6885</td>
			<td>125CDU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C5533-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase-I</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads 450</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>endothelial cells growth medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>cc-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine graefe forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T Dumont</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>Cell Science</td>
			<td>CRI001B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortomouse</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>32619</td>
			<td>Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mitotracker</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penecillin streptomycin 100x</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhaM mice</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>18397</td>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease (10 mg/ml)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>3945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate 100mM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>&#160;F.S.T</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-515842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria

Glomerüler endotel hücresi (GEC) disfonksiyonu glomerüler filtrasyon bariyerinin parçalanmasını başlatabilir ve katkıda bulunabilir. Bazı glomerüler hastalıkların patogenezinde artmış mitokondriyal oksidatif stres, GEC disfonksiyonuna neden olan bir mekanizma olarak önerilmiştir. Tarihsel olarak, GEC'lerin in vivo modellerden izole edilmesi, saf kültürlerin glomerüllerden izole edilmesindeki zorluklar nedeniyle oldukça zor olmuştur. GEC'lerin in vitro karmaşık büyüme gereksinimleri ve çok sınırlı bir ömrü vardır. Burada, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş GEC'leri floresan mitokondri ile izole etme ve kültürleme prosedürünü açıklıyoruz, bu da mitokondriyal fisyon ve füzyon olaylarının izlenmesini sağlıyor. GEC'ler, termolabil SV40 TAg'yi (Immortomouse'tan) ifade eden, proliferasyonu şartlı olarak teşvik eden ve hücre farklılaşmasını baskılayan çift transgenik bir farenin böbreklerinden ve tüm mitokondrilerde foto-dönüştürülebilir bir floresan proteinden (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAMeksize edilmiş] fareden) izole edildi. Üretilen kararlı hücre hattı, ölümsüzleştirici SV40 TAg geninin inaktivasyonundan sonra hücre farklılaşmasına ve bir mitokondri alt kümesinin foto-aktivasyonuna izin verir ve floresanda yeşilden kırmızıya geçişe neden olur. MitoDendra2-GEC'lerin kullanımı, floresan mitokondrinin dağılımının, füzyonunun ve fisyon olaylarının hücreleri boyamadan canlı görüntülenmesini sağlar.

Bu makalede, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin stabil floresan mitokondri (mitoDendra2-GEC'ler) ile izolasyonu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1). 6-10 haftalık genç farelerin kullanımı, önemli sayıda sağlıklı hücre elde etmek için gereklidir. 3 günlük kültürden sonra, hücreler Şekil 3G'de gösterildiği gibi izole glomerüllerden yavaşça büyümeye başlar. 7 gün sonra, hücr...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria at JoVE.com

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Makalede, termolabil simian virüsü 40'ı eksprese eden transgenik farelerin böbreklerinden şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin izole edilmesi ve foto-aktive edilebilir mitokondri, PhAMeksize edilmesi yöntemi açıklanmaktadır. Boncuklar, sindirim adımları, tohumlama ve GEC-CD31 pozitifin kültürlenmesi kullanılarak tüm böbreklerden glomerül izolasyonu prosedürünü açıklıyoruz.

Şartlı Ölümsüzleştirilmiş Fare Glomerüler Endotel Hücrelerinin Floresan Mitokondri ile İzolasyonu

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Stabil floresan mitokondrili ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücreleri, farklı uyaranların in vitro mitokondriyal yapı üzerindeki etkisini incelemek için harika bir araçtır. Bu makalede açıklanan yöntem, çok sayıda glomerüler endotel hücresi vermektedir. Bir GEC üzerinde küçük molekülleri test ederek, GEC'lerin etkilendiği diyabetik böbrek hastalığı için monoterapi taraması yapabiliriz.Açıklanan yöntemin gerçekleştirilmesi kolaydır ve belirli bir ekipman gerektirmez. Bununla birlikte, açıklanan adımları takip etmek ve kontaminasyonu önlemek için ekipmanı sterilize etmek önemlidir. Başlamak için, böbrek glomerüler hücrelerini izole etmek için gereken perfüzyon ve izolasyon malzemelerini bir çalışma alanına yerleştirin.Taze hazırlanmış Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisini veya HBSS'yi 0,2 mikronluk bir filtreyle filtreleyin ve kontaminasyonu önlemek için kaputun altında tutun. Ardından, 200 mikrolitre manyetik boncuğu 20 mililitre HBSS ile karıştırın. RPMI'yı% 10 FCS ve endotel hücre kültürü ortamı ile 37 santigrat derecede bir su banyosunda önceden ısıtın.Daha sonra, altı delikli bir plakanın iki kuyuğunu oda sıcaklığında 45 dakika boyunca mililitre kollajen IV başına iki mililitre 10 mikrogram ile ön kaplayın. Kollajeni seyreltmek için kullanılan asetik asidi çıkarmak için plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Kaplanmış plakaları hemen kullanın veya dört haftaya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.Cerrahi aletleri ve çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin. Daha sonra, cerrahi aletleri 30 dakika boyunca otoklav yapın. Anestezi uygulanan bir farenin karnını açtıktan sonra, sol ventriküle bir kelebek iğnesi yerleştirin.Kan dolaşımını genişletmek için 100 mikrolitre boncuk çözeltisi enjekte etmek için, 19 gauge iğne ile böbreklerin altındaki inferior vena kavayı dikkatlice kırın ve boncuk çözeltisinin perfüzyonuna devam edin. Daha sonra, yağ dokusunu cımbızla yavaşça çıkarın, her iki böbreği de ince cerrahi makas C ile tüketin ve buz üzerinde bir mililitre HBSS içeren bir tabağa koyun. Böbreği steril bir neşterle bir milimetrelik küçük parçalara ayırın.Kıyılmış böbreği, yatay bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe eğerek 37 santigrat derecede 35 dakika boyunca bir milimetre taze hazırlanmış kollajenaz tip II ile inkübe edin. Sindirimden sonra, kollajenazı nötralize etmek için% 10 FBS ile dört mililitre RPMI ekleyin. Sindirilen dokuyu steril bir 100 mikron hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün.Sindirilen dokuyu süzgecin üzerine karıştırmak için steril 1,5 mililitrelik bir tüpün tabanını kullanın ve glomerüllerin geçmesine izin verin. Hücre süzgecini 15 mililitre HBSS ile durulayın. Ardından, akışı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 XG'de santrifüj edin.Bu aşamada, tüp üç katman içerir. Üst tabaka tübüller gibi daha küçük yapılar içerir, orta tabaka glomerüllü boncuklardır ve alt tabaka döküntü içerir. Süpernatant ve üst beyaz tabakayı dikkatlice aspire edin.Daha sonra, glomerülleri ve kalıntıları taşıyan boncukları içeren peleti 1.5 mililitre HBSS'de yeniden askıya alın ve iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü manyetik bir yoğunlaştırıcıya yerleştirin ve boncukları bir mililitre HBSS ile iki kez yıkamadan önce süpernatantı aspire edin. Bir slaytın üzerine 20 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin.Ardından, glomerüllerin varlığı için slaytı mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra, peleti bir endotel hücresi büyüme ortamında yeniden askıya alın ve süspansiyonu iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Her üç mililitre ortam için bir mikrolitre interferon gama ekleyin ve hücreleri 33 santigrat derecede inkübasyon için altı delikli bir plakaya yerleştirin.Üç günlük kültürden sonra, bir mililitrelik ortamı dikkatlice taze bir ortamla değiştirin. Bu aşamada, hücreler glomerüler hücrelerin bir karışımı ile heterojendir. Yedi gün sonra, ortamın hücrelerin çoğalmasını başlatmak için interferon gama ile desteklenmiş iki mililitre taze endotel hücresi büyüme ortamı ile değiştirin.10 gün sonra, hücreler% 80 akıcılığa ulaştığında, tripsin kullanarak onları geçirin ve kollajen IV ile kaplı bir T-25 şişesine aktarın.21 günlük kültürden sonra, hücreleri bir T-75 şişesine aktarın. Bir T-75 şişesine üç mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, tripsini üç mililitre endotel büyüme ortamı ile nötralize edin ve süspansiyonu beş dakika boyunca 200 XG'de santrifüjleme için 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Süpernatantı aspire edin ve hücreleri% 1 BSA,% 1 milimolar EDTA,% 1 penisilin / streptomisin içeren bir mililitre PBS içinde yıkayın. Yine 200 mikrolitre CD31 antikor kaplı boncuk ve 800 mikrolitre PBS içinde peleti santrifüj edip yeniden askıya alın. Hücreleri 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede sürekli sallama ve% 5 karbondioksit ile inkübe edin.Daha sonra, tüpü manyetik yoğunlaştırıcıya yerleştirin ve hücreleri BSA, EDTA ve penisilin / streptomisin içeren PBS ile dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri interferon gama ile desteklenmiş üç mililitre endotel büyüme ortamında yeniden askıya alın. Kollajen IV'te kuyu başına 1,5 mililitre hücre plakası, altı kuyucuklu bir plaka üzerinde ve 33 santigrat derecede izin verilen koşullar altında kültür ile kaplanır.Dört gün sonra, ortamın 750 mikrolitresini, interferon gama ile desteklenmiş taze bir endotel büyüme ortamı ile değiştirin. 10 ila 14 günlük kültürden sonra, 488 nanometre filtreli bir epifloresan mikroskobu kullanarak, floresan mitokondri eksprese eden koloniler olan CD31 pozitif glomerüler endotel hücresi veya GEC'lerin büyümesini gözlemleyin. 21 gün sonra veya hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, bunları bir T-25 şişesine aktarın.Kültürü% 10 FCS içeren bir RPMI büyüme ortamı ile koruyun. Alternatif olarak, hücreler kriyoprezerve edilebilir. Daha önce gösterildiği gibi tripsin kullanan geçiş hücreleri.Daha sonra, hücreleri santrifüj edin ve peleti üç mililitre dondurucu ortamda yeniden askıya alın. Hücreleri kriyo tüplerinde alıkoyun ve sıvı azotta, buhar sıcaklığında saklayın. Bu protokol, glomerüler endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem tanımladı.İzole glomerüllerden, hücreler üç günlük kültürden sonra yavaşça büyümeye başladı. Yedi gün sonra, hücreler heterojen göründü ve podositler, parietal, epitel ve mezangial hücreler gibi diğer glomerüler hücre tiplerini gösterdi. % 70 ila% 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, diğer glomerüler hücreler pozitif bir endotel hücresi seçimi kullanılarak çıkarıldı.MitoDendra2 GEC'ler CD31'i eksprese etti ve sinaptopodin negatif boyama ile gösterildiği gibi podosit belirteci için negatifti. Glukoz konsantrasyonunun mitokondri yapısı üzerindeki etkisi incelendi. Normal glikoz altındaki hücrelerde görülebilen uzamış mitokondri ile karşılaştırıldığında, belirgin sferoid şekilli mitokondri tarafından gözlendiği gibi, yüksek glikoz indüklenen mitokondri parçalanması veya fisyonu.Ayrıca, tek bir canlı MitoDendra2 GEC'de seçilen bir mitokondri alt popülasyonunu fotodönüştürmek için 405 nanometrelik bir lazer kullanıldı. Normal ve yüksek glikoz konsantrasyonu ile tedavi edilen hücreler için seçilen alanda mitokondrinin yeşilden kırmızıya başarılı bir şekilde foto-anahtarlanması gösterilmiştir. Bu geçiş, MitoDendra2 GEC'lerdeki füzyon olaylarına tanık olmayı sağladı.Normal glukoz altında, mitokondri matriks füzyonu nedeniyle sarı birleşmiş yeşil ve kırmızı floresan gözlendi. Buna karşılık, yüksek glikozla tedavi edilen GEC'lerde, mitokondri esas olarak parçalanmıştır. Hücreleri, küçük hacimli bir büyüme ortamına sahip altı delikli bir tabaktaki bir kuyucuğa yerleştirmek, hücrelerin yemeğe yapışmasına izin vermek için esastır.İzole endotel hücreleri mitokondriyal fonksiyon ve yapısal çalışmalar yapmak için kullanılabilir. Floresan mitokondri özelliklerine sahip ölümsüzleştirilmiş endotel hücrelerinin kullanılması, ilaç keşfine giden yolu açacaktır. Küçük moleküller hücreler üzerinde test edilebilir ve mitokondri fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için canlı görüntüleme yapılır.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...