Name: preparation and structural evaluation of epithelial cell monolayers in a physiologically sized microfluidic culture device
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device at JoVE.com

Forfatterne anerkender Alan Shepardson for at designe skæremønsteret til 3M-klæbemidlet og mylararket, der anvendes i mikrofluidisk kanalkonstruktion og til test af cellekulturmediestrømningshastigheden og sprøjtepumpeprogrammeringen. Finansiering blev leveret af NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 og Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

NCI-H441 human epitellungecellelinje blev anvendt til denne undersøgelse (se materialetabel).
1. Cellekultur i den mikrofluidiske kanal
<ol><li>Fabriker den mikrofluidiske kanal og udfør forbehandlingen ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Få et enkeltkanals flowarray (se materialetabel), og adskil den øverste del fra polycarbonatbundpladen.</li>
		<li>Få et #1.5 rektangulært dækglas (tykkelse 0.17 mm) med dimensioner på 60 mm x ...

<ol>
	<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome.">Acute respiratory distress syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).</li><li>Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome:+An+update+and+Review.">Acute respiratory distress syndrome: An update and Review.</a> Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface-tension-induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).</li><li>Modrykamien, A. M., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).</li><li>Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+Claudin+4.">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4.</a> Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).</li><li>Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+gradient,+not+exposure+duration,+determines+the+extent+of+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).</li><li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+influence+of+cell+topography+on+epithelial+mechanical+stresses+during+pulmonary+airway+reopening.">An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening.</a> Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).</li><li>Gaver, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+POOR+get+POORer:+A+hypothesis+for+the+pathogenesis+of+ventilator-induced+lung+injury.">The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).</li><li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ultra-thin+alveolar-capillary+basement+membrane+mimics.">Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics.</a> Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).</li><li>Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+the+tumor+microenvironment+under+controlled+oxygen+conditions.">Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions.</a> Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).</li><li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation,+barrier+function,+and+motility.">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).</li><li>Jaccard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+rapid+and+precise+estimation+of+adherent+cell+culture+characteristics+from+phase+contrast+microscopy+images.">Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).</li><li>Hagiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+static+pressure+suppresses+columnar+epithelial+cell+growth+in+association+with+cell+shape+and+cytoskeletal+modifications.">Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications.</a> Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+Nucleic+Acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids.</a> The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+on+bacterial+cellular+dimensions+and+integrity.">Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity.</a> Iscience. 24 (4), 102348 (2021).</li><li>Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).</li><li>EpilogueLaser. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FusionSeries:+Pro+&amp;+Edge+Laser+System+Manual+and+Original+Instructions.">FusionSeries: Pro &amp; Edge Laser System Manual and Original Instructions.</a> EpilogueLaser. , (2022).</li><li>Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+disinfection+by+exposure+to+germicidal+UV+light.">Surface disinfection by exposure to germicidal UV light.</a> Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).</li><li>Sandell, L., Sakai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+culture.">Mammalian cell culture.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).</li><li>New Era Pump Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Phaser+Programmable+Syringe+Pump:+NE-1000+Series+User+Manual.">Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual.</a> New Era Pump Systems. , (2014).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Data+Sheet:+Image-iT+Fixative+Solution+(4%+formaldehyde,+methanol-free).">Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free).</a> Thermo Fisher Scientific. , (2018).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActinGreen+488+ReadyProbes+Reagent+Protocol.">ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol.</a> Thermo Fisher Scientific. , (2022).</li><li>Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML</a> (2022)</li><li>Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+media:+An+overview.">Mounting media: An overview.</a> Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).</li><li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images.">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Ferriera, F., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+User+Guide.">ImageJ User Guide.</a> National Institutes of Health. , (2012).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+fibronectin+by+human+epithelial+cells+in+culture.">Production of fibronectin by human epithelial cells in culture.</a> American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).</li><li>Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+measurements+in+confocal+microscopy.">Volume measurements in confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).</li><li>Heijink, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cell+adhesion+in+airway+epithelial+cell+types+using+electric+cell-substrate+impedance+sensing.">Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).</li><li>Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretchable+impedance+sensor+for+mammalian+cell+proliferation+measurements.">Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).</li></ol>

Den præsenterede protokol beskriver kulturen, tværbindingsfiksering, farvning, permeabilisering og konfokal mikroskopisk visualisering af NCI-H441 humane lungeepitelceller i det dynamiske miljø i et enkeltkanals mikrofluidisk flowarray såvel som i det statiske miljø i et traditionelt otte-brøndkammerdækglas. Med enhver mikrofluidisk cellekulturprotokol er strømningsbetingelserne for cellekulturmediet af afgørende betydning, da den høje hastighed har potentialet til at vaske cellerne væk eller forstyrre den nor...

Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er en akut tilstand som følge af fornærmelse mod og udbredelse af skade i lungeparenchymen, hvilket resulterer i lungeødem i alveolerne, utilstrækkelig gasudveksling og efterfølgende hypoxæmi1. Dette initierer en cyklus af proinflammatorisk cytokinfrigivelse, neutrofilrekruttering, toksisk mediatorfrigivelse og vævsskade, som i sig selv medfører et yderligere inflammatorisk respons2. Derudover kan lungeoverfladeaktivt stof, som stabiliserer luftvejene og forhindrer skader forårsaget af gentagen rekruttering / derekruttering (R / D), inaktiveres eller på anden måde gøres dysfunktionel af de kemiske processer, der forekommer under ARDS, hvilket resulterer i yderligere stress og skade på det omgivende parenkym3. Hvis der opstår tilstrækkelig skade, kan mekanisk ventilation være nødvendig for at sikre tilstrækkelig systemisk iltning4. Imidlertid pålægger mekanisk ventilation sine egne udfordringer og traumer, herunder muligheden for respiratorinduceret lungeskade (VILI), karakteriseret som skade på lungeparenkymet forårsaget af de mekaniske belastninger, der pålægges under overinflation (volutrauma) og / eller R / D af luft-væskegrænsefladen i de væske-okkluderede luftveje (atelectrauma)5. Trykgradienten, der opleves af epitelceller udsat for en luft-væske-grænseflade (som i en væske-okkluderet bronchiole) i atelectrauma-modellen, kan resultere i et permeabilitetsopstået obstruktivt respons (POOR), hvilket fører til en POOR-get-POORer dydigskadecyklus 6,7,8.
In vitro-eksperimenter kan give mikroskala indsigt i disse fænomener, men aktuelle undersøgelser i mikrofluidiske kanalmiljøer med fysiologisk relevante dimensioner står over for flere udfordringer9. For det første udgør optimering af cellekulturbetingelser en betydelig adgangsbarriere for cellekulturforskning i mikrofluidiske miljøer, da der findes et smalt skæringspunkt, inden for hvilket mediestrømningsparametre, dyrkningsvarighed og andre kulturbetingelser tillader optimal dannelse af cellelag. Dette omfatter de diffusionsbegrænsninger, der er pålagt af den iltuigennemtrængelige karakter af den mikrofluidiske kulturkanalindeslutning. Dette kræver nøje overvejelse af mediestrømningsparametre, da lave strømningshastigheder kan fratage celler ilt, især dem, der er længst væk fra indløbet; På den anden side kan høje strømningshastigheder skubbe celler ud af kulturkanalen eller resultere i forkert eller ujævn lagudvikling. Diffusionsbegrænsninger kan afhjælpes ved at anvende oxygengennemtrængelige materialer såsom polydimethylsiloxan (PDMS) i et luft-væske-interface (ALI)-kulturapparat Mange konventionelle mikrofluidiske kulturkanaler, f.eks. kanalerne i ECIS-systemet (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing), er imidlertid i sagens natur iltuigennemtrængelige på grund af arten af det fremstillede kabinet10. Denne protokol sigter mod at tilvejebringe en teknik til analyse af cellelag dyrket i et iltuigennemtrængeligt kabinet.
Ved sammenligning af levedygtigheden af dyrkningsbetingelser er observationer af specifikke lagegenskaber, såsom tilstedeværelsen af et monolag, overfladetopologi, sammenløb og lagtykkelsesensartethed, nødvendige for at bestemme, om cellelaget produceret af et bestemt sæt kulturbetingelser opfylder de ønskede specifikationer og faktisk er relevante for det eksperimentelle design. En begrænset evaluering kan udføres ved metoder som ECIS, der anvender målinger af elektrisk potentiale (spænding) skabt af modstand mod højfrekvent vekselstrøm (AC) (impedans) pålagt af elektrisk isolerende membraner af celler dyrket på guldelektroder i flowarrayet. Ved at modulere frekvensen af AC anvendt på celler kan specifikke frekvensafhængige cellulære egenskaber af cellerne og cellelagene, såsom overfladevedhæftningsstyrke, tæt forbindelsesdannelse og celleproliferation eller sammenløb, målrettes og undersøges11. Disse indirekte former for målinger er imidlertid noget vanskelige at fortolke ved begyndelsen af et eksperiment og kvantificerer muligvis ikke alle relevante aspekter af cellelaget. Blot at observere cellelaget under et fasekontrastmikroskop kan afsløre arten af visse kvaliteter såsom sammenløb; Mange relevante egenskaber såsom tilstedeværelsen af et monolag og lagtykkelsens ensartethed kræver imidlertid en tredimensionel (3D) evaluering, som ikke er mulig med brightfield, fasekontrast eller fluorescerende mikroskopisk billeddannelse12.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en filamentøs actinfarvningsteknik for at muliggøre billeddannelsesbaseret verifikation af et monolag og evaluering af cellelagets ensartethed ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM). Filamentøs actin (F-actin) blev anset for et passende mål for fluoroforkonjugatet, delvis på grund af den måde, hvorpå F-actin tæt følger cellemembranen, hvilket muliggør en visuel tilnærmelse af hele cellevolumen13. En anden vigtig fordel ved målretning af F-actin er den måde, hvorpå farvning af F-actin visuelt belyser cytoskeletale forstyrrelser eller ændringer pålagt af de belastninger og belastninger, som cellerne oplever. Tværbindingsfiksering med methanolfri formaldehyd blev brugt til at bevare cellernes og cellelagets morfologi, da dehydrerende fikseringsmidler såsom methanol har tendens til at flade celler, groft forvrænge cellelaget og ændre dets egenskaber14,15.
For at bestemme lagevalueringsteknikkens evne til at afbøde disse udfordringer blev celler dyrket i traditionelle kulturkamre med otte brønde såvel som i mikrofluidiske kanaler for at evaluere forskellene, hvis nogen, i de cellelag, der blev produceret. Til faste kulturbrønde blev der anvendt otte-brøndkammerede dækglasenheder. Til mikrofluidisk kultur blev flowarrays (kanallængde 50 mm, bredde 5 mm, dybde 0,6 mm) optimeret til dyrkning af udødeliggjorte humane lungeepitelceller (NCI-H441) i et miljø med dimensioner, der er fysiologisk relevante for de terminale bronchioler, der er til stede i åndedrætszonen i den menneskelige lunge16. Selvom denne protokol blev udviklet med kulturmiljøet i ECIS-flowarrays i tankerne, kan den gælde for ethvert iltuigennemtrængeligt dynamisk kulturmiljø, for hvilket evaluering af dyrkede cellelagskarakteristika eller kulturbetingelser er nødvendig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A1R HD25 Confocal Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37110</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Transfer Tape Double Linered</td>
			<td>3M</td>
			<td>468MP</td>
			<td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite&#160;HSW Soft-Ject Disposable Syringes</td>
			<td>Air-Tite RL5</td>
			<td>14-817-53</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet</td>
			<td>BAISDY</td>
			<td>AS022</td>
			<td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics&#160;M Series Ultrasonic Cleaning Bath</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>15-336-100</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Fibronectin, Human</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array</td>
			<td>Applied BioPhysics</td>
			<td>1F8x10E PC</td>
			<td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White</td>
			<td>Enterprise Technology Solutions</td>
			<td>50-211-1163</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4642090</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-21</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Cover Glasses: Rectangles (#1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-GP</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>FB002</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>https://imagej.net/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil F 30 cc</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Capacity Reach-In CO2&#160;Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>LMC3BF1</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>ZY-45505-31</td>
			<td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&#38;persist=true&#38;ip=no&#38; 
			gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC 
			UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k 
			pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 
			udmwaAuDHEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>0016</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>National Target All-Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>03-377-24</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-174</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37441</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch</td>
			<td>PendoTech</td>
			<td>ZY-19406-49</td>
			<td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3890401</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Aluminum Wrap Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>458742928317</td>
			<td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td>
			<td>47036</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36917-5X2ML</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-100-752PM</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16&#34; ID x 1/8&#34; OD; 50 Ft</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-01</td>
			<td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and structural evaluation of epithelial cell monolayers in a physiologically sized microfluidic culture device

In vitro mikrofluidiske eksperimenter har stort potentiale til at afsløre mange indsigter i de mikrofysiologiske fænomener, der forekommer under tilstande som akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) og respirator-induceret lungeskade (VILI). Imidlertid står undersøgelser i mikrofluidiske kanaler med dimensioner, der er fysiologisk relevante for de terminale bronchioler i den menneskelige lunge, i øjeblikket over for flere udfordringer, især på grund af vanskeligheder med at etablere passende cellekulturbetingelser, herunder mediestrømningshastigheder, inden for et givet dyrkningsmiljø. Den præsenterede protokol beskriver en billedbaseret tilgang til evaluering af strukturen af NCI-H441 humane lungeepitelceller dyrket i en iltuigennemtrængelig mikrofluidisk kanal med dimensioner, der fysiologisk er relevante for de terminale bronchioler i den menneskelige lunge. Ved hjælp af phalloidin-baseret filamentøs actinfarvning afsløres cellernes cytoskeletale strukturer ved konfokal laserscanningsmikroskopi, hvilket muliggør visualisering af individuelle såvel som lagdelte celler. Efterfølgende kvantificering bestemmer, om de anvendte cellekulturbetingelser producerer ensartede monolag, der er egnede til yderligere eksperimentering. Protokollen beskriver cellekultur og lagevalueringsmetoder i mikrofluidiske kanaler og traditionelle miljøer med fast brønd. Dette inkluderer kanalkonstruktion, cellekultur og nødvendige betingelser, fiksering, permeabilisering og farvning, konfokal mikroskopisk billeddannelse, billedbehandling og dataanalyse.

Den præsenterede metode muliggør visualisering af epitelcellelag dyrket i mikrofluidiske kulturkanaler og bruger en demonstration i traditionelle cellekulturmiljøer med fast brønd som validering. Erhvervede billeder vil eksistere på et spektrum af kvalitet, signalintensitet og cellulær målspecificitet. Vellykkede billeder vil demonstrere høj kontrast, hvilket giver mulighed for billedanalyse og kvantificering af data til efterfølgende statistisk evaluering. Mislykkede billeder vil være svage, uklare, slørede e...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device at JoVE.com

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

Den præsenterede protokol beskriver udviklingen og anvendelsen af en phalloidin-baseret filamentøs actinfarvningsteknik med konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) til visualisering af klæbende cellelagstruktur i mikrofluidiske dynamiske kulturkanaler og traditionelle statiske kulturkamre med fast brønd. Denne tilgang hjælper med at evaluere cellelagssammenløb, monolagsdannelse og lagtykkelsesensartethed.

Forberedelse og strukturel evaluering af epitelcellemonolag i en fysiologisk størrelse mikrofluidisk kulturanordning

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Denne protokol tjener til at sænke en adgangsbarriere for cellekultureksperimenter og gør det muligt for forskere at evaluere og karakterisere klæbende cellemonolag dyrket i dynamiske mikrofluidiske miljøer. Den primære fordel ved denne teknik er, at den muliggør både kvalitativ og kvantitativ evaluering af cellemonolagsegenskaber til at tjene som grundlag for yderligere enkeltlagsafhængige eksperimenter. Denne metode muliggør rekapitulation af et alveolært epitel in vitro, hvilket muliggør udforskning af de dynamiske reaktioner under akut respiratorisk distress syndrom, ARDS, samt ventilatorinduceret lungeskade, VILI.For at begynde skal du få et enkelt kanalflowarray. Rengør dækglasoverfladen i et ultralydbad. Nedsænk dækglasset i poly-d-lysin ved stuetemperatur i fem minutter.Tør det derefter ved 60 grader Celsius i 30 minutter. Derefter fastgøres dobbeltsidede klæbemidler i Mylar afstandsstykker. Laserskæres som beskrevet i manuskriptet til dækglasset og sikrer, at kanaludskæringerne er nøjagtigt justeret.Fastgør et rektangulært dækglas til den nederste klæbestrimmel. Brug de skrællede klæbepapirer til at dække de dele af klæbemidlet, der stadig er udsat. Når samlingen er færdig, skal du anvende fast og lige tryk på konstruktionen.Brug en sprøjte fyldt med deioniseret vand til at skylle kanalen. Steriliser kanalkabinettet i en ultraviolet sterilisator i 30 minutter. Ved hjælp af en steril teknik behandles kanalen med human fibronectinopløsning fremstillet i PBS og inkuberes i mindst 30 minutter ved 37 grader Celsius.I den sterile laminære strømningshætte fremstilles NCI H441-cellesuspension ved hjælp af RPMI 1640-medium med 10 % FBS. Brug 0,25 ml af denne cellesuspension til at fylde kanalen og en del af portene. Brug brightfieldmikroskopi til at kontrollere, at cellerne er fordelt jævnt inden for kanalerne.Føj mediebeholderen og stophanen til kanalen. Begynd at dyrke kanalen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Brug en programmerbar sprøjtepumpe til at trække brugte medier ud af kanalen og friske medier ind i kanalen fra et sterilt mediereservoir, der er fastgjort til kanalindtaget.I en kemisk damphætte fortyndes en 4% formaldehydopløsning i DPBS for at skabe en 1% opløsning og opbevares i et passende mærket rør. Forbered 2% formaldehydopløsningen på lignende måde. Overfør formaldehydopløsningerne til passende mærkede fem milliliter sprøjter.Træk 20 ml DPBS op i en separat 20 ml sprøjte, som vil blive brugt til vasketrinnene. Fjern derefter den mikrofluidiske kanal fra kulturapparatet og fastgør den i den kemiske damphætte. For at samle fikserings- og farvningsapparatet skal du fastgøre et segment af overførselsrør til sideporten på en trevejs stophane via Luer-hanlås til slangemodhageadapter.Tilslut derefter stophanen til flowarrayets indløbsport. Fastgør et andet segment af overførselsrør til udløbsporten på den eksisterende stophane ved hjælp af den samme type slangemodhageadapter. Endelig fastgøres de frie ender af begge overførselsrør, der nu er udpeget som affaldsledninger, i en kemisk og biologisk farlig affaldsbeholder.Sørg for, at stophanen blokerer flowarrayets indløbsport, og skyl affaldsledningen med DPBS. Drej derefter stophanen for at blokere affaldsledningen, og vask langsomt cellerne med to ml DPBS. Skub langsomt to milliliter 1% fikseringsmiddel gennem kanalen.Lad det sidde i fem minutter og gentag med 2%fikseringsmiddel. Vask derefter cellerne tre gange med frisk DPBS som tidligere vist. Forbered 0,1% saponinopløsningen som beskrevet i manuskriptet.Træk yderligere DPBS op i en 20 ml sprøjte til brug i vasketrinnene. Dæk røret med aluminiumsfolie. Det filamentøse actinfarvningsphalloidinreagens og et Hoechst-reagens til 0,1 % saponinopløsningen tilsættes til Hoechst-blandingen.Overfør derefter opløsningen til en foliedækket sprøjte. Skyl affaldsledningen med en lille mængde permeabiliserende og farvningsopløsning. Derefter introduceres to ml af opløsningen til den mikrofluidiske kanal.Dæk kanalen med aluminiumsfolie for at blokere lyset. Efter 30 minutter skylles permeabiliseringsopløsningen ud med to ml DPBS to gange i fem minutter hver, før kanalen tørres forsigtigt. Brug en mikropipette til at indføre en minimal mængde af et blødt sæt anti-fade-beslag til den mikrofluidiske kanal, der sikrer, at bundoverfladen dækkes fuldstændigt.Forsegl derefter enden til kanalen. Brug et brightfield-mikroskop til hurtigt at kontrollere cellelagets integritet, før du opbevarer kanalen i en beholder for at beskytte den mod lys. Test billeddannelsessteder ved at tage referencescanninger og z-stakke, indtil de ønskede billedparametre og betingelser er opfyldt.Brug flowarray-bundpladen som reference til at konstruere z-stakke forskellige steder langs kanalens længde. Endelig skal du analysere tværsnitsdata, dybdekortdata og andre relevante egenskaber for at evaluere cellelagegenskaber. Den vellykkede anvendelse af teknikken demonstreres i det mikrofluidiske dynamiske kulturmiljø gennem billedoptagelse mindst en centimeter væk fra indløbet og udløbet.I et repræsentativt dyrkningsvarighedseksperiment blev der observeret vellykket monolagsproduktion, når cellerne blev dyrket i 24 timer. Men når dyrket i 48 timer, blev uønsket flerlagsdannelse set. De indsamlede data fra hver af de fem mikrofluidiske kanalbilleddannelsessteder afslører også forholdet mellem øget dyrkningsvarighed og øget tværsnitsareal, hvilket tyder på, at ujævn lagdannelse eller overvækst forekommer inden for 48 timers kultur.Dybdekortet over en central placering inden for den mikrofluidiske kanal dyrket i 24 timer blev opnået, hvilket er nyttigt til kvalitativ evaluering af lagegenskaber. Denne protokols tre mest afgørende aspekter er korrekt kanalkonstruktion, nøjagtige kultur- og mediestrømningsforhold og omhyggelig brug af fikserings- og farvningsapparatet. Efter denne procedure kan andre metoder anvendes parallelt til at validere den eksperimentelle levedygtighed af de producerede cellemonolag, såsom elektrisk celle-substratimpedanssensor, ECIS eller transepitelial elektrisk modstand, TEER.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protokol for Biofilm Streamer Dannelse i en mikrofluidindretning med Micro-søjler

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analyserer Blanding Inhomogeniteter i en mikrofluidapparat af Individuel Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelial cellerepopulationskilde og Udarbejdelse af Gnaver ekstracellulær matrix Stilladser for Renal Tissue Udvikling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur af Living microbiome med Microengineered Menneskelig Intestinal Villi i en Gut-on-a-Chip mikrofluidanordning

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tør Film Photoresist-baserede elektrokemisk mikrofluid Biosensor Platform: Enhed fabrikation, On-chip Assay forberedelse og drift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable vaskulære netværk med en væv Model i en mikrofluid enhed

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primær afklaring af CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjælp af en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...