Name: preparation and structural evaluation of epithelial cell monolayers in a physiologically sized microfluidic culture device
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device at JoVE.com

Los autores reconocen a Alan Shepardson por diseñar el patrón de corte para el adhesivo 3M y la lámina de mylar utilizados en la construcción del canal microfluídico y por probar la velocidad de flujo de medios de cultivo celular y la programación de la bomba de jeringa. Los fondos fueron proporcionados por NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 y Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Para el presente estudio se utilizó la línea de células pulmonares epiteliales humanas NCI-H441 (ver Tabla de Materiales).
1. Cultivo celular en el canal microfluídico
<ol><li>Fabrica el canal microfluídico y realiza el pretratamiento siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Obtenga una matriz de flujo de un solo canal (consulte la Tabla de materiales) y separe la parte superior de la placa base de policarbonato.</li>
		<li>Obtenga u...

<ol>
	<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome.">Acute respiratory distress syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).</li><li>Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome:+An+update+and+Review.">Acute respiratory distress syndrome: An update and Review.</a> Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface-tension-induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).</li><li>Modrykamien, A. M., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).</li><li>Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+Claudin+4.">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4.</a> Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).</li><li>Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+gradient,+not+exposure+duration,+determines+the+extent+of+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).</li><li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+influence+of+cell+topography+on+epithelial+mechanical+stresses+during+pulmonary+airway+reopening.">An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening.</a> Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).</li><li>Gaver, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+POOR+get+POORer:+A+hypothesis+for+the+pathogenesis+of+ventilator-induced+lung+injury.">The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).</li><li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ultra-thin+alveolar-capillary+basement+membrane+mimics.">Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics.</a> Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).</li><li>Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+the+tumor+microenvironment+under+controlled+oxygen+conditions.">Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions.</a> Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).</li><li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation,+barrier+function,+and+motility.">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).</li><li>Jaccard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+rapid+and+precise+estimation+of+adherent+cell+culture+characteristics+from+phase+contrast+microscopy+images.">Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).</li><li>Hagiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+static+pressure+suppresses+columnar+epithelial+cell+growth+in+association+with+cell+shape+and+cytoskeletal+modifications.">Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications.</a> Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+Nucleic+Acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids.</a> The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+on+bacterial+cellular+dimensions+and+integrity.">Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity.</a> Iscience. 24 (4), 102348 (2021).</li><li>Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).</li><li>EpilogueLaser. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FusionSeries:+Pro+&amp;+Edge+Laser+System+Manual+and+Original+Instructions.">FusionSeries: Pro &amp; Edge Laser System Manual and Original Instructions.</a> EpilogueLaser. , (2022).</li><li>Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+disinfection+by+exposure+to+germicidal+UV+light.">Surface disinfection by exposure to germicidal UV light.</a> Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).</li><li>Sandell, L., Sakai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+culture.">Mammalian cell culture.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).</li><li>New Era Pump Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Phaser+Programmable+Syringe+Pump:+NE-1000+Series+User+Manual.">Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual.</a> New Era Pump Systems. , (2014).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Data+Sheet:+Image-iT+Fixative+Solution+(4%+formaldehyde,+methanol-free).">Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free).</a> Thermo Fisher Scientific. , (2018).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActinGreen+488+ReadyProbes+Reagent+Protocol.">ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol.</a> Thermo Fisher Scientific. , (2022).</li><li>Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML</a> (2022)</li><li>Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+media:+An+overview.">Mounting media: An overview.</a> Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).</li><li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images.">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Ferriera, F., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+User+Guide.">ImageJ User Guide.</a> National Institutes of Health. , (2012).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+fibronectin+by+human+epithelial+cells+in+culture.">Production of fibronectin by human epithelial cells in culture.</a> American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).</li><li>Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+measurements+in+confocal+microscopy.">Volume measurements in confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).</li><li>Heijink, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cell+adhesion+in+airway+epithelial+cell+types+using+electric+cell-substrate+impedance+sensing.">Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).</li><li>Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretchable+impedance+sensor+for+mammalian+cell+proliferation+measurements.">Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).</li></ol>

El protocolo presentado describe el cultivo, la fijación de reticulación, la tinción, la permeabilización y la visualización microscópica confocal de células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 en el entorno dinámico de una matriz de flujo microfluídico de un solo canal, así como en el entorno estático de un vidrio de cubierta tradicional de ocho pocillos. Con cualquier protocolo de cultivo celular microfluídico, las condiciones de flujo de los medios de cultivo celular son de suma importancia, ya que el ...

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una afección aguda que surge del insulto y la propagación de la lesión en el parénquima pulmonar, que resulta en edema pulmonar de los alvéolos, intercambio gaseoso inadecuado e hipoxemia posterior1. Esto inicia un ciclo de liberación de citoquinas proinflamatorias, reclutamiento de neutrófilos, liberación de mediadores tóxicos y daño tisular, que a su vez incurre en una respuesta inflamatoria adicional2. Además, el surfactante pulmonar, que estabiliza las vías respiratorias y previene el daño causado por el reclutamiento/desreclutamiento repetitivo (R/D), puede ser inactivado o disfuncional por los procesos químicos que ocurren durante el SDRA, lo que resulta en más estrés y lesiones en el parénquima circundante3. Si se sufre un daño suficiente, puede ser necesaria la ventilación mecánica para asegurar una oxigenación sistémica adecuada4. Sin embargo, la ventilación mecánica impone sus propios desafíos y traumas, incluyendo la posibilidad de lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), caracterizada como lesión del parénquima pulmonar causada por las tensiones mecánicas impuestas durante el sobreinflado (volutrauma) y/o la R/D de la interfaz aire-líquido en la vía aérea ocluida por líquido (atelectrauma)5. El gradiente de presión experimentado por las células epiteliales expuestas a una interfaz aire-líquido (como en un bronquiolo ocluido con líquido) en el modelo de atelectrauma puede resultar en una respuesta obstructiva originada por permeabilidad (POOR), lo que lleva a un ciclo virtuoso de lesión POOR-get-POORer 6,7,8.
La experimentación in vitro puede proporcionar información a microescala sobre estos fenómenos, pero los estudios actuales en entornos de canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes enfrentan varios desafíos9. Por un lado, la optimización de las condiciones de cultivo celular plantea una barrera significativa para la entrada para la investigación de cultivos celulares en entornos microfluídicos, ya que existe una intersección estrecha dentro de la cual los parámetros de flujo del medio, la duración del cultivo y otras condiciones de cultivo permiten la formación óptima de la capa celular. Esto incluye las limitaciones de difusión impuestas por la naturaleza impermeable al oxígeno del recinto del canal de cultivo microfluídico. Esto requiere una cuidadosa consideración de los parámetros de flujo del medio, ya que los bajos caudales pueden privar a las células de oxígeno, especialmente a las más alejadas de la entrada; Por otro lado, los altos caudales pueden empujar a las células fuera del canal de cultivo o dar lugar a un desarrollo inadecuado o desigual de la capa. Las limitaciones de difusión pueden abordarse mediante el uso de materiales permeables al oxígeno como el polidimetilsiloxano (PDMS) en un aparato de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI); sin embargo, muchos canales de cultivo microfluídicos convencionales, como los del sistema de detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS), son inherentemente impermeables al oxígeno, dada la naturaleza del recinto fabricado10. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una técnica para analizar las capas celulares cultivadas en un recinto impermeable al oxígeno.
Al comparar la viabilidad de las condiciones de cultivo, las observaciones de características específicas de la capa, como la presencia de una monocapa, la topología de la superficie, la confluencia y la uniformidad del espesor de la capa, son necesarias para determinar si la capa celular producida por un conjunto particular de condiciones de cultivo cumple con las especificaciones deseadas y son realmente relevantes para el diseño experimental. Se puede realizar una evaluación limitada mediante métodos como ECIS, que utiliza mediciones del potencial eléctrico (voltaje) creado por la resistencia a la corriente alterna de alta frecuencia (CA) (impedancia) impuesta por membranas eléctricamente aislantes de células cultivadas en electrodos de oro dentro de la matriz de flujo. Al modular la frecuencia de CA aplicada a las células, las propiedades celulares específicas dependientes de la frecuencia de las células y las capas celulares, como la fuerza de adherencia superficial, la formación de la unión estrecha y la proliferación o confluencia celular, pueden ser dirigidas y examinadas11. Sin embargo, estas formas indirectas de mediciones son algo difíciles de interpretar al inicio de un experimento, y pueden no cuantificar todos los aspectos relevantes de la capa celular. La simple observación de la capa celular bajo un microscopio de contraste de fase puede revelar la naturaleza de ciertas cualidades como la confluencia; sin embargo, muchas características relevantes, como la presencia de una monocapa y la uniformidad del espesor de la capa, requieren una evaluación tridimensional (3D) que no es posible con imágenes microscópicas fluorescentes, de campo claro, contraste de fase o fluorescentes12.
El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica de tinción de actina filamentosa para permitir la verificación basada en imágenes de una monocapa y la evaluación de la uniformidad de la capa celular utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM). La actina filamentosa (F-actina) se consideró un objetivo apropiado para el conjugado fluoróforo, debido en parte a la forma en que la actina F sigue estrechamente la membrana celular, permitiendo una aproximación visual de todo el volumen celular13. Otro beneficio importante de dirigirse a la actina F es la manera en que la tinción de la actina F dilucida visualmente las interrupciones o alteraciones citoesqueléticas impuestas por las tensiones y tensiones experimentadas por las células. La fijación de reticulación con formaldehído libre de metanol fue utilizada para preservar la morfología de las células y la capa celular, ya que los fijadores deshidratantes como el metanol tienden a aplanar las células, distorsionando groseramente la capa celular y alterando sus propiedades14,15.
Para determinar la capacidad de la técnica de evaluación de capas para mitigar estos desafíos, las células se cultivaron en cámaras de cultivo tradicionales de ocho pocillos, así como en canales microfluídicos para evaluar las diferencias, si las hubiera, en las capas celulares que se produjeron. Para los pozos de cultivo fijos, se utilizaron unidades de vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos. Para el cultivo microfluídico, las matrices de flujo (longitud del canal 50 mm, ancho 5 mm, profundidad 0,6 mm) fueron optimizadas para cultivar células epiteliales pulmonares humanas inmortalizadas (NCI-H441) en un ambiente con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales presentes en la zona respiratoria del pulmón humano16. Si bien este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta el entorno de cultivo de las matrices de flujo ECIS, puede aplicarse a cualquier entorno de cultivo dinámico impermeable al oxígeno para el cual es necesaria la evaluación de las características de la capa celular cultivada o las condiciones de cultivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
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		<tr>
			<td>A1R HD25 Confocal Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37110</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Transfer Tape Double Linered</td>
			<td>3M</td>
			<td>468MP</td>
			<td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite&#160;HSW Soft-Ject Disposable Syringes</td>
			<td>Air-Tite RL5</td>
			<td>14-817-53</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet</td>
			<td>BAISDY</td>
			<td>AS022</td>
			<td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics&#160;M Series Ultrasonic Cleaning Bath</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>15-336-100</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Fibronectin, Human</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array</td>
			<td>Applied BioPhysics</td>
			<td>1F8x10E PC</td>
			<td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White</td>
			<td>Enterprise Technology Solutions</td>
			<td>50-211-1163</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4642090</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-21</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Cover Glasses: Rectangles (#1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-GP</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>FB002</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>https://imagej.net/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil F 30 cc</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Capacity Reach-In CO2&#160;Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>LMC3BF1</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>ZY-45505-31</td>
			<td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&#38;persist=true&#38;ip=no&#38; 
			gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC 
			UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k 
			pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 
			udmwaAuDHEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>0016</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>National Target All-Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>03-377-24</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-174</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37441</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch</td>
			<td>PendoTech</td>
			<td>ZY-19406-49</td>
			<td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3890401</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Aluminum Wrap Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>458742928317</td>
			<td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td>
			<td>47036</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36917-5X2ML</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-100-752PM</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16&#34; ID x 1/8&#34; OD; 50 Ft</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-01</td>
			<td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and structural evaluation of epithelial cell monolayers in a physiologically sized microfluidic culture device

La experimentación microfluídica in vitro tiene un gran potencial para revelar muchos conocimientos sobre los fenómenos microfisiológicos que ocurren en afecciones como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI). Sin embargo, los estudios en canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano se enfrentan actualmente a varios desafíos, especialmente debido a las dificultades para establecer condiciones apropiadas de cultivo celular, incluidas las tasas de flujo de medios, dentro de un entorno de cultivo dado. El protocolo presentado describe un enfoque basado en imágenes para evaluar la estructura de las células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas en un canal microfluídico impermeable al oxígeno con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano. Usando tinción de actina filamentosa basada en faloidina, las estructuras citoesqueléticas de las células se revelan mediante microscopía de barrido láser confocal, lo que permite la visualización de células individuales y en capas. La cuantificación posterior determina si las condiciones de cultivo celular empleadas están produciendo monocapas uniformes adecuadas para una mayor experimentación. El protocolo describe el cultivo celular y los métodos de evaluación de capas en canales microfluídicos y entornos tradicionales de pozos fijos. Esto incluye la construcción de canales, el cultivo celular y las condiciones requeridas, la fijación, la permeabilización y la tinción, las imágenes microscópicas confocales, el procesamiento de imágenes y el análisis de datos.

El método presentado permite la visualización de capas celulares epiteliales cultivadas en canales de cultivo microfluídico y utiliza una demostración en entornos tradicionales de cultivo celular de pozo fijo como validación. Las imágenes adquiridas existirán en un espectro de calidad, intensidad de señal y especificidad de objetivo celular. Las imágenes exitosas demostrarán un alto contraste, lo que permitirá el análisis de imágenes y la cuantificación de datos para su posterior evaluación estadística. L...

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Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Este protocolo sirve para reducir una barrera de entrada para la experimentación de cultivos celulares y permite a los investigadores evaluar y caracterizar monocapas celulares adherentes cultivadas en entornos microfluídicos dinámicos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las características de la monocapa celular para servir como base para una mayor experimentación dependiente de la monocapa. Este método permite la recapitulación de un epitelio alveolar in vitro, lo que permite explorar las respuestas dinámicas durante el síndrome de dificultad respiratoria aguda, SDRA, así como la lesión pulmonar inducida por el ventilador, VILI.Para comenzar, obtenga una matriz de flujo de un solo canal. Limpie la superficie del vidrio de la cubierta en un baño ultrasónico. Sumerja el vidrio de la cubierta en poli-d-lisina a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego séquelo a 60 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, coloque adhesivos de doble cara en espaciadores Mylar. Corte con láser como se describe en el manuscrito al vidrio de la cubierta y asegúrese de que los recortes del canal estén alineados con precisión.Fije un vidrio de cubierta rectangular a la tira adhesiva más inferior. Use los papeles adhesivos pelados para cubrir las porciones de adhesivo aún expuestas. Una vez completado el montaje, aplique una presión firme e igual a la construcción.Con una jeringa llena de agua desionizada, enjuague el canal. Esterilice la carcasa del canal en un esterilizador ultravioleta durante 30 minutos. Usando una técnica estéril, tratar el canal con solución de fibronectina humana preparada en PBS e incubar durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados.En la campana de flujo laminar estéril, prepare la suspensión celular NCI H441 utilizando medio RPMI 1640 con 10% FBS. Use 0.25 mililitros de esta suspensión celular para llenar el canal y una porción de los puertos. Usando microscopía de campo claro, verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los canales.Agregue el depósito de medios y la llave de paso al canal. Comience a cultivar el canal a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Use una bomba de jeringa programable para extraer los medios gastados del canal y los medios frescos en el canal desde un depósito de medios estériles conectado a la entrada del canal.En una campana extractora de humos químicos, diluya una solución de formaldehído al 4% en DPBS para crear una solución al 1% y guárdela en un tubo debidamente etiquetado. Prepare la solución de formaldehído al 2% de manera similar. Transfiera las soluciones de formaldehído a jeringas de cinco mililitros debidamente etiquetadas.Extraiga 20 mililitros de DPBS en una jeringa separada de 20 mililitros que se utilizará para los pasos de lavado. A continuación, retire el canal microfluídico del aparato de cultivo y asegúrelo en la campana de humos químicos. Para ensamblar el aparato de fijación y tinción, conecte un segmento de tubo de transferencia al puerto lateral de una llave de paso de tres vías a través de un adaptador de púa de manguera de bloqueo Luer macho.A continuación, conecte la llave de paso al puerto de entrada de la matriz de flujo. Conecte otro segmento de tubo de transferencia al puerto de salida de la llave de paso existente utilizando el mismo tipo de adaptador de púa de manguera. Finalmente, asegure los extremos libres de ambos tubos de transferencia ahora designados como líneas de desechos en un contenedor de desechos apropiado para riesgos químicos y biológicos.Asegúrese de que la llave de paso esté bloqueando el puerto de entrada de la matriz de flujo y enjuague la línea de residuos con DPBS. Luego gire la llave de paso para bloquear la línea de desechos y lave lentamente las celdas con dos mililitros de DPBS. Empuje lentamente dos mililitros de fijador al 1% a través del canal.Déjalo reposar durante cinco minutos y repite con un 2% de fijador. Luego lave las células tres veces con DPBS fresco como se demostró anteriormente. Prepare la solución de saponina al 0,1% como se describe en el manuscrito.Extraiga DPBS adicionales en una jeringa de 20 mililitros para usar en los pasos de lavado. Cubra el tubo con papel de aluminio. Agregue el reactivo filamentoso de faloidina para tinción de actina y un reactivo Hoechst para teñir núcleos a la solución de saponina al 0,1%.Luego transfiera la solución a una jeringa cubierta de aluminio. Enjuague la línea de residuos con una pequeña cantidad de solución permeabilizante y de tinción. Luego introduzca dos mililitros de la solución en el canal microfluídico.Cubra el canal con papel de aluminio para bloquear la luz. Después de 30 minutos, enjuague la solución permeabilizante con dos mililitros de DPBS dos veces durante cinco minutos cada una antes de secar suavemente el canal. Usando una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante anti-decoloración suave en el canal microfluídico asegurándose de cubrir completamente la superficie inferior.Luego selle el extremo del canal. Usando un microscopio de campo claro, verifique rápidamente la integridad de la capa celular antes de almacenar el canal en un recipiente para protegerlo de la luz. Pruebe las ubicaciones de imágenes tomando escaneos de referencia y pilas z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados.Usando la placa base de la matriz de flujo como referencia, construya pilas z en varias ubicaciones a lo largo de la longitud del canal. Finalmente, analice datos transversales, datos de mapas de profundidad y cualquier otra característica relevante para evaluar las propiedades de la capa celular. El uso exitoso de la técnica se demuestra en el entorno de cultivo dinámico microfluídico a través de la adquisición de imágenes al menos a un centímetro de distancia de la entrada y la salida.En un experimento representativo de duración del cultivo, se observó una producción exitosa de monocapa cuando las células se cultivaron durante 24 horas. Sin embargo, cuando se cultivó durante 48 horas, se observó formación multicapa indeseable. Los datos recopilados de cada una de las cinco ubicaciones de imágenes de canales microfluídicos también revelan la relación entre el aumento de la duración del cultivo y el aumento del área de la sección transversal, lo que sugiere que la formación desigual de capas o el crecimiento excesivo ocurren dentro de las 48 horas posteriores al cultivo.Se obtuvo el mapa de profundidad de una ubicación central dentro del canal microfluídico cultivado durante 24 horas, que es útil para la evaluación cualitativa de las características de la capa. Los tres aspectos más cruciales de este protocolo son la construcción adecuada del canal, las condiciones precisas de cultivo y flujo de medios, y el uso cuidadoso del aparato de fijación y tinción. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos en paralelo para validar la viabilidad experimental de las monocapas celulares producidas, como la detección de impedancia celular y sustrato eléctrico, ECIS, o la resistencia eléctrica transepitelial, TEER.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Investigación

Bioingeniería

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...