Name: preparation and structural evaluation of epithelial cell monolayers in a physiologically sized microfluidic culture device
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device at JoVE.com

Författarna erkänner Alan Shepardson för att utforma skärmönstret för 3M-lim och mylarark som används i mikrofluidisk kanalkonstruktion och för att testa cellkulturens medieflödeshastighet och sprutpumpprogrammering. Finansiering tillhandahölls av NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 och Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

NCI-H441 human epitelial lungcellinje användes för den aktuella studien (se materialtabell).
1. Cellodling i mikrofluidisk kanal
<ol><li>Tillverka den mikrofluidiska kanalen och utför förbehandlingen enligt stegen nedan.<ol><li>Skaffa en enkanals flödesmatris (se materialtabell) och separera den övre delen från polykarbonatbasplattan.</li>
		<li>Skaffa ett #1,5 rektangulärt täckglas (tjocklek 0,17 mm) med måtten 60 mm x 22 mm. Reng...

<ol>
	<li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome.">Acute respiratory distress syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).</li><li>Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+distress+syndrome:+An+update+and+Review.">Acute respiratory distress syndrome: An update and Review.</a> Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).</li><li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+surface-tension-induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).</li><li>Modrykamien, A. M., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).</li><li>Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+Claudin+4.">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4.</a> Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).</li><li>Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+gradient,+not+exposure+duration,+determines+the+extent+of+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening.">Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).</li><li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+influence+of+cell+topography+on+epithelial+mechanical+stresses+during+pulmonary+airway+reopening.">An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening.</a> Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).</li><li>Gaver, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+POOR+get+POORer:+A+hypothesis+for+the+pathogenesis+of+ventilator-induced+lung+injury.">The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).</li><li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ultra-thin+alveolar-capillary+basement+membrane+mimics.">Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics.</a> Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).</li><li>Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+the+tumor+microenvironment+under+controlled+oxygen+conditions.">Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions.</a> Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).</li><li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation,+barrier+function,+and+motility.">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).</li><li>Jaccard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+rapid+and+precise+estimation+of+adherent+cell+culture+characteristics+from+phase+contrast+microscopy+images.">Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).</li><li>Hagiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+static+pressure+suppresses+columnar+epithelial+cell+growth+in+association+with+cell+shape+and+cytoskeletal+modifications.">Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications.</a> Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+Nucleic+Acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids.</a> The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+on+bacterial+cellular+dimensions+and+integrity.">Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity.</a> Iscience. 24 (4), 102348 (2021).</li><li>Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).</li><li>EpilogueLaser. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FusionSeries:+Pro+&amp;+Edge+Laser+System+Manual+and+Original+Instructions.">FusionSeries: Pro &amp; Edge Laser System Manual and Original Instructions.</a> EpilogueLaser. , (2022).</li><li>Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+disinfection+by+exposure+to+germicidal+UV+light.">Surface disinfection by exposure to germicidal UV light.</a> Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).</li><li>Sandell, L., Sakai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+culture.">Mammalian cell culture.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).</li><li>New Era Pump Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Phaser+Programmable+Syringe+Pump:+NE-1000+Series+User+Manual.">Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual.</a> New Era Pump Systems. , (2014).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Data+Sheet:+Image-iT+Fixative+Solution+(4%+formaldehyde,+methanol-free).">Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free).</a> Thermo Fisher Scientific. , (2018).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ActinGreen+488+ReadyProbes+Reagent+Protocol.">ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol.</a> Thermo Fisher Scientific. , (2022).</li><li>Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML</a> (2022)</li><li>Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+media:+An+overview.">Mounting media: An overview.</a> Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).</li><li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images.">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Ferriera, F., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+User+Guide.">ImageJ User Guide.</a> National Institutes of Health. , (2012).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+fibronectin+by+human+epithelial+cells+in+culture.">Production of fibronectin by human epithelial cells in culture.</a> American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).</li><li>Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+measurements+in+confocal+microscopy.">Volume measurements in confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).</li><li>Heijink, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cell+adhesion+in+airway+epithelial+cell+types+using+electric+cell-substrate+impedance+sensing.">Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).</li><li>Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretchable+impedance+sensor+for+mammalian+cell+proliferation+measurements.">Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).</li></ol>

Det presenterade protokollet beskriver odling, tvärbindningsfixering, färgning, permeabilisering och konfokalmikroskopisk visualisering av NCI-H441 humana lungepitelceller i den dynamiska miljön av en enkanals mikrofluidisk flödesmatris, såväl som i den statiska miljön i ett traditionellt åtta-brunnskammar täckglas. Med alla mikrofluidiska cellodlingsprotokoll är flödesförhållandena för cellodlingsmediet av största vikt, eftersom höghastighetsflödet har potential att tvätta bort cellerna eller störa de...

Akut respiratorisk nödsyndrom (ARDS) är ett akut tillstånd som härrör från förolämpning mot och spridning av skada i lungparenkymet, vilket resulterar i lungödem i alveolerna, otillräckligt gasutbyte och efterföljande hypoxemi1. Detta initierar en cykel av proinflammatorisk cytokinfrisättning, neutrofilrekrytering, toxisk mediatorfrisättning och vävnadsskada, vilket i sig medför ett ytterligare inflammatoriskt svar2. Dessutom kan lungsurfaktant, som stabiliserar luftvägarna och förhindrar skador orsakade av repetitiv rekrytering / derekrytering (R / D), inaktiveras eller på annat sätt göras dysfunktionell av de kemiska processer som inträffar under ARDS, vilket resulterar i ytterligare stress och skada på det omgivande parenkymet3. Om tillräcklig skada uppstår kan mekanisk ventilation vara nödvändig för att säkerställa tillräcklig systemisk syresättning4. Mekanisk ventilation medför emellertid sina egna utmaningar och trauman, inklusive risken för ventilatorinducerad lungskada (VILI), kännetecknad som skada på lungparenkymet orsakad av de mekaniska påfrestningar som åläggs under överinflation (volutrauma) och / eller R/D för luft-vätskegränssnittet i den vätskeockluderade luftvägen (atelectrauma)5. Tryckgradienten som upplevs av epitelceller exponerade för ett luft-vätskegränssnitt (som i en vätskeockluderad bronkiol) i atelectrauma-modellen kan resultera i ett permeabilitets-ursprungligt obstruktivt svar (POOR), vilket leder till en POOR-get-POORer dygdig skadecykel 6,7,8.
In vitro-experiment kan ge insikter i mikroskala om dessa fenomen, men aktuella studier i mikrofluidiska kanalmiljöer med fysiologiskt relevanta dimensioner står inför flera utmaningar9. För det första utgör optimering av cellodlingsförhållanden ett betydande hinder för inträde för cellodlingsforskning i mikrofluidiska miljöer, eftersom det finns en smal skärningspunkt inom vilken medieflödesparametrar, odlingsvaraktighet och andra odlingsförhållanden möjliggör optimal cellskiktbildning. Detta inkluderar diffusionsbegränsningarna som orsakas av den syreogenomträngliga naturen hos den mikrofluidiska kulturkanalhöljet. Detta kräver noggrant övervägande av medieflödesparametrar, eftersom låga flödeshastigheter kan beröva celler syre, särskilt de längst bort från inloppet; Å andra sidan kan höga flödeshastigheter driva celler ut ur odlingskanalen eller resultera i felaktig eller ojämn lagerutveckling. Diffusionsbegränsningar kan åtgärdas genom användning av syregenomsläppliga material såsom polydimetylsiloxan (PDMS) i en ALI-odlingsapparat (luft-vätskegränssnitt). Många konventionella mikrofluidiska odlingskanaler, såsom de i ECIS-systemet (Electric Cell-Substrate Impedance Impedance Sensing), är emellertid till sin natur syreogenomträngliga med tanke på den tillverkade inneslutningens natur10. Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en teknik för att analysera cellskikt odlade i en syreogenomtränglig inneslutning.
Vid jämförelse av odlingsförhållandenas livskraft är observationer av specifika skiktegenskaper, såsom närvaron av ett monolager, yttopologi, sammanflöde och skikttjocklekens enhetlighet, nödvändiga för att bestämma om cellskiktet som produceras av en viss uppsättning odlingsförhållanden uppfyller de önskade specifikationerna och verkligen är relevanta för den experimentella designen. En begränsad utvärdering kan utföras med metoder som ECIS, som använder mätningar av elektrisk potential (spänning) skapad av motstånd mot högfrekvent växelström (AC) (impedans) som införs av elektriskt isolerande membran av celler odlade på guldelektroder inom flödesmatrisen. Genom att modulera frekvensen av AC som appliceras på celler kan specifika frekvensberoende cellulära egenskaper hos cellerna och cellskikten, såsom ytvidhäftningsstyrka, täthetsbildning och cellproliferation eller sammanflöde riktas och undersökas11. Dessa indirekta former av mätningar är emellertid något svåra att tolka vid början av ett experiment och kanske inte kvantifierar alla relevanta aspekter av cellskiktet. Att helt enkelt observera cellskiktet under ett faskontrastmikroskop kan avslöja arten av vissa egenskaper, såsom sammanflöde; Många relevanta egenskaper, såsom närvaron av ett monolager och skikttjocklekens enhetlighet, kräver dock en tredimensionell (3D) utvärdering som inte är möjlig med ljusfält, faskontrast eller fluorescerande mikroskopisk avbildning12.
Syftet med denna studie var att utveckla en filamentös aktinfärgningsteknik för att möjliggöra bildbaserad verifiering av ett monolager och utvärdering av cellskiktets enhetlighet med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM). Filamentöst aktin (F-aktin) ansågs vara ett lämpligt mål för fluoroforkonjugatet, delvis på grund av det sätt som F-aktin tätt följer cellmembranet, vilket möjliggör en visuell approximation av hela cellvolymen13. En annan viktig fördel med att rikta F-aktin är det sätt på vilket färgning av F-aktin visuellt belyser cytoskeletala störningar eller förändringar som orsakas av de spänningar och stammar som cellerna upplever. Tvärbindningsfixering med metanolfri formaldehyd användes för att bevara cellernas morfologi och cellskiktet, eftersom dehydratiserande fixeringsmedel såsom metanol tenderar att platta celler, grovt snedvrida cellskiktet och förändra dess egenskaper14,15.
För att bestämma lagerutvärderingsteknikens förmåga att mildra dessa utmaningar odlades celler i traditionella åtta brunnsodlingskammare såväl som i mikrofluidiska kanaler för att utvärdera skillnaderna, om några, i cellskikten som producerades. För fasta kulturbrunnar användes åtta brunnskammare täckglasenheter. För mikrofluidisk odling optimerades flödesmatriser (kanallängd 50 mm, bredd 5 mm, djup 0,6 mm) för att odla odödliga humana lungepitelceller (NCI-H441) i en miljö med dimensioner fysiologiskt relevanta för de terminala bronkiolerna närvarande i andningszonen i den mänskliga lungan16. Även om detta protokoll utvecklades med odlingsmiljön för ECIS-flödesmatriser i åtanke, kan det tillämpas på alla syreogenomträngliga dynamiska odlingsmiljöer för vilka utvärdering av odlade cellskiktegenskaper eller odlingsförhållanden är nödvändig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A1R HD25 Confocal Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37110</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Transfer Tape Double Linered</td>
			<td>3M</td>
			<td>468MP</td>
			<td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite&#160;HSW Soft-Ject Disposable Syringes</td>
			<td>Air-Tite RL5</td>
			<td>14-817-53</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet</td>
			<td>BAISDY</td>
			<td>AS022</td>
			<td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics&#160;M Series Ultrasonic Cleaning Bath</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>15-336-100</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Fibronectin, Human</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array</td>
			<td>Applied BioPhysics</td>
			<td>1F8x10E PC</td>
			<td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White</td>
			<td>Enterprise Technology Solutions</td>
			<td>50-211-1163</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4642090</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-21</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Cover Glasses: Rectangles (#1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-GP</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Syringes for Single Use</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>FB002</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>ImageJ Fiji</td>
			<td>https://imagej.net/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil F 30 cc</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Capacity Reach-In CO2&#160;Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>LMC3BF1</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>ZY-45505-31</td>
			<td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&#38;persist=true&#38;ip=no&#38; 
			gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC 
			UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k 
			pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 
			udmwaAuDHEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>0016</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>National Target All-Plastic Disposable Syringes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>03-377-24</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-174</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-1600</td>
			<td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37441</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch</td>
			<td>PendoTech</td>
			<td>ZY-19406-49</td>
			<td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3890401</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Aluminum Wrap Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td>458742928317</td>
			<td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td>
			<td>47036</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36917-5X2ML</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-100-752PM</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16&#34; ID x 1/8&#34; OD; 50 Ft</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-01</td>
			<td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and structural evaluation of epithelial cell monolayers in a physiologically sized microfluidic culture device

In vitro mikrofluidiska experiment har stor potential att avslöja många insikter i de mikrofysiologiska fenomen som förekommer vid tillstånd som akut respiratorisk nödsyndrom (ARDS) och ventilatorinducerad lungskada (VILI). Studier i mikrofluidiska kanaler med dimensioner fysiologiskt relevanta för de terminala bronkiolerna i den mänskliga lungan står dock för närvarande inför flera utmaningar, särskilt på grund av svårigheter att fastställa lämpliga cellodlingsförhållanden, inklusive medieflödeshastigheter, inom en given odlingsmiljö. Det presenterade protokollet beskriver ett bildbaserat tillvägagångssätt för att utvärdera strukturen hos NCI-H441 humana lungepitelceller odlade i en syreogenomtränglig mikrofluidisk kanal med dimensioner fysiologiskt relevanta för de terminala bronkiolerna i den mänskliga lungan. Med hjälp av falloidinbaserad filamentös aktinfärgning avslöjas cellernas cytoskeletala strukturer genom konfokal laserskanningsmikroskopi, vilket möjliggör visualisering av såväl enskilda som skiktade celler. Efterföljande kvantifiering avgör om de cellodlingsförhållanden som används producerar enhetliga monolager som är lämpliga för vidare experiment. Protokollet beskriver cellodling och lagerutvärderingsmetoder i mikrofluidiska kanaler och traditionella fasta brunnsmiljöer. Detta inkluderar kanalkonstruktion, cellodling och nödvändiga förhållanden, fixering, permeabilisering och färgning, konfokalmikroskopisk avbildning, bildbehandling och dataanalys.

Den presenterade metoden möjliggör visualisering av epitelcellskikt odlade i mikrofluidiska odlingskanaler och använder en demonstration i traditionella cellodlingsmiljöer med fast brunn som validering. Bilder som förvärvas kommer att finnas på ett spektrum av kvalitet, signalintensitet och cellulär målspecificitet. Framgångsrika bilder kommer att visa hög kontrast, vilket möjliggör bildanalys och kvantifiering av data för efterföljande statistisk utvärdering. Misslyckade bilder blir svaga, suddiga, suddi...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device at JoVE.com

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

Det presenterade protokollet beskriver utvecklingen och användningen av en falloidinbaserad filamentös aktinfärgningsteknik med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) för att visualisera vidhäftande cellskiktstruktur i mikrofluidiska dynamiska odlingskanaler och traditionella statiska odlingskammare med fasta brunnar. Detta tillvägagångssätt hjälper till att utvärdera cellskiktets sammanflöde, monolagerbildning och skikttjocklekens enhetlighet.

Beredning och strukturell utvärdering av epitelcellmonolager i en fysiologiskt dimensionerad mikrofluidisk odlingsanordning

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Detta protokoll tjänar till att sänka en inträdesbarriär för cellodlingsexperiment och gör det möjligt för forskare att utvärdera och karakterisera vidhäftande cellmonolager odlade i dynamiska mikrofluidiska miljöer. Den främsta fördelen med denna teknik är att den möjliggör både kvalitativ och kvantitativ utvärdering av cellmonolageregenskaper för att tjäna som grund för ytterligare monolagerberoende experiment. Denna metod möjliggör rekapitulation av ett alveolärt epitel in vitro, vilket möjliggör utforskning av de dynamiska svaren under akut andnödssyndrom, ARDS, samt ventilatorinducerad lungskada, VILI.Börja med att skaffa en enkanals flödesmatris. Rengör täckglasytan i ett ultraljudsbad. Sänk ner täckglaset i poly-d-lysin vid rumstemperatur i fem minuter.Torka sedan vid 60 grader Celsius i 30 minuter. Anbringa sedan dubbelsidiga lim i Mylar-distanser. Laserskär enligt beskrivningen i manuskriptet till täckglaset och se till att kanalutskärningarna är exakt inriktade.Fäst ett rektangulärt täckglas på den nedersta självhäftande remsan. Använd de skalade självhäftande papperen för att täcka de delar av limmet som fortfarande exponeras. När monteringen är klar, applicera fast och lika tryck på konstruktionen.Skölj kanalen med en spruta fylld med avjoniserat vatten. Sterilisera kanalhöljet i en ultraviolett sterilisator i 30 minuter. Behandla kanalen med human fibronektinlösning beredd i PBS med en steril teknik och inkubera i minst 30 minuter vid 37 grader Celsius.I den sterila laminära flödeshuven, förbered NCI H441 cellsuspension med RPMI 1640-medium med 10% FBS. Använd 0,25 ml av denna cellsuspension för att fylla kanalen och en del av portarna. Använd brightfield-mikroskopi för att verifiera att cellerna har fördelats jämnt inom kanalerna.Lägg till mediebehållaren och stoppkranen i kanalen. Börja odla kanalen vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Använd en programmerbar sprutpump för att dra ut använt media från kanalen och färska medier till kanalen från en steril mediebehållare fäst vid kanalinloppet.I en kemisk dragskåp, späd en 4% formaldehydlösning i DPBS för att skapa en 1% lösning och förvara i ett lämpligt märkt rör. Förbered 2% formaldehydlösningen på liknande sätt. Överför formaldehydlösningarna till lämpligt märkta fem milliliter sprutor.Dra upp 20 ml DPBS i en separat 20 ml spruta som kommer att användas för tvättstegen. Ta sedan bort den mikrofluidiska kanalen från odlingsapparaten och säkra den i den kemiska dragskåpet. För att montera fixerings- och färgningsapparaten, fäst ett segment av överföringsslangar på sidoporten på en trevägs stoppkran via hane Luer-lås till slangbarbadapter.Anslut sedan stoppkranen till flödesmatrisens inloppsport. Fäst ett annat segment av överföringsslangar till utloppsporten på den befintliga stoppkranen med samma typ av slangbarbadapter. Slutligen säkra de fria ändarna av båda överföringsrören som nu betecknas som avfallslinjer i en kemisk och biologisk risk lämplig avfallsbehållare.Se till att stoppkranen blockerar flödesmatrisens inloppsport och spola avfallsledningen med DPBS. Vrid sedan stoppkranen för att blockera avfallslinjen och tvätta långsamt cellerna med två milliliter DPBS. Tryck långsamt två milliliter 1% fixativ genom kanalen.Låt det sitta i fem minuter och upprepa med 2% fixativ. Tvätta sedan cellerna tre gånger med färsk DPBS som visats tidigare. Bered 0,1% saponinlösning enligt beskrivningen i manuskriptet.Dra upp ytterligare DPBS i en 20 ml spruta för användning i tvättstegen. Täck röret med aluminiumfolie. Tillsätt det trådformiga aktinfärgningsfalloidinreagenset och ett Hoechst-reagens med kärnfärgning till 0,1% saponinlösningen.Överför sedan lösningen till en folietäckt spruta. Spola avfallslinjen med en liten mängd permeabiliserande och färgningslösning. För sedan in två milliliter av lösningen till den mikrofluidiska kanalen.Täck kanalen med aluminiumfolie för att blockera ljuset. Efter 30 minuter, spola ut den permeabiliserande lösningen med två milliliter DPBS två gånger i fem minuter vardera innan du försiktigt torkar kanalen. Använd en mikropipett, för in en minimal mängd av ett mjukt inställt anti-fade mountant till mikrofluidikkanalen så att den täcker bottenytan helt.Försegla sedan änden till kanalen. Använd ett ljusfältmikroskop, verifiera snabbt cellskiktets integritet innan du lagrar kanalen i en behållare för att skydda den från ljus. Testa avbildningsplatser genom att ta referensskanningar och z-staplar tills önskade bildparametrar och villkor har uppfyllts.Med hjälp av basplattan för flödesmatrisen som referens konstruerar du z-staplar på olika platser längs kanalens längd. Slutligen analysera tvärsnittsdata, djupschemadata och andra relevanta egenskaper för att utvärdera celllageregenskaper. Den framgångsrika användningen av tekniken demonstreras i den mikrofluidiska dynamiska odlingsmiljön genom bildförvärv minst en centimeter från inloppet och utloppet.I ett representativt odlingsvaraktighetsexperiment observerades framgångsrik enskiktsproduktion när cellerna odlades i 24 timmar. Men när man odlade i 48 timmar sågs oönskad flerskiktsbildning. Data som samlats in från var och en av de fem mikrofluidiska kanalavbildningsplatserna avslöjar också förhållandet mellan ökad kulturvaraktighet och ökad tvärsnittsarea, vilket tyder på ojämn lagerbildning eller överväxt sker inom 48 timmar efter kulturen.Djupkartan över en central plats inom den mikrofluidiska kanalen odlad i 24 timmar erhölls, vilket är användbart för kvalitativ utvärdering av lageregenskaper. Detta protokolls tre viktigaste aspekter är korrekt kanalkonstruktion, exakta kultur- och medieflödesförhållanden och noggrann användning av fixerings- och färgningsapparaten. Efter denna procedur kan andra metoder användas parallellt för att validera den experimentella viabiliteten hos de producerade cellmonolagren, såsom elektrisk cell-substratimpedansavkänning, ECIS, eller transepitelial elektrisk resistans, TEER.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Mikroflödessystem enhet för att återskapa en tumör mikromiljö<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikroflödessystem enheten för att studera flera olika stammar

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protokoll för Biofilm Streamer Bildning i ett mikroflödessystem enhet med Micro-stolparna

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Analysera Blandning homogen i en mikroflödessystem enhet med Micro Schlieren Teknik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitelceller Återplantering och framställning av gnagare Extracellular Matrix Byggnadsställningar för njurvävnad utveckling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Torr Film fotoresist-baserade elektrokemiska mikroflödessystem Biosensor plattform: Enhet Fabrication, On-chip Assay förberedelse och systemdrift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable vaskulär nätverk med en vävnad modell i en mikroflödessystem enhet

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primärt förtydligande av CHO skördad cellodlingsvätska med hjälp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...