Name: destabilization of the medial meniscus and cartilage scratch murine model of accelerated osteoarthritis
Uploaded: 2022-07-06T14:30:00
Duration: 7 min 6 s
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この出版物で使用されているμCT画像を取得したリバプール大学のジェマ・チャールズワースとマンディ・プライアーの研究に感謝したいと思います。作業はVersus Arthritis(助成金20199および22483)によって資金提供されました。リネット・ダニングは、対関節炎(助成金20199)によって資金提供されました。ケンダルマカロックは、UWS博士課程の奨学金によって資金提供されました。カルメンウエサは、Versus Arthritis(助成金20199および22483)によって資金提供されました。

すべての実験手順は、グラスゴー大学とスコットランド西部大学の倫理審査委員会によって承認され、1986年動物(科学的手順)法(英国)のガイドラインに従って実施されました。体重約25gの10週齢のC57Bl6/J雄マウスを本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1.動物の準備
注:心的外傷後OAモデルは性別によって重要な違いを示すため、研究の目的に関してマウスの性別を考慮してください8,9,10。
<ol><li>麻酔試薬(2%イソフルラン)の準備ができていることを確認してください。 注:注射可能な麻酔も使用できます11。手術の時間が短いことを考えると、吸入麻酔の使用が推奨されます。</li>
	<li>外科的コントロールとして、別の偽手術の年齢一致グループを使用します。. 注:反対側の膝を外科的コントロール(反対側の脚の偽の手術)として使用してはなりません。これは動物福祉の面で問題があるかもしれません、そしてそれは歩行と歩行測定に影響を与える可能性があります。反対側の膝は、内因性骨パラメータ12 を正常化し、誘発性疼痛試験13の対比較として機能する。</li>
	<li>骨格成熟マウスを使用する。 注:ほとんどの文献は8〜12週齢でOAを誘発します。本研究では、マウスは10週齢である。</li>
</ol>2.術前ケア(外科助手が実施)
<ol><li>別の施設から輸送する場合は、マウスが新しい環境に順応するための外科的介入の少なくとも1週間前に待ちます。</li>
	<li>適切に指定された無菌室で手術を行い、すべての表面が無菌であることを確認します(たとえば、手術の領域を覆うために滅菌ドレープを使用します)。 注:手術は無菌です。</li>
	<li>滅菌器具を滅菌ドレープに配置して配置します。</li>
	<li>マウスの重量を量ります。</li>
	<li>麻酔ケージにマウスを導入し、次に標準的な麻酔リグを使用して2%イソフルオランを最大15分間導入することにより、麻酔を誘発します(材料の表を参照)。 注意: ケージには、マウスを導入する前に「残留」麻酔があってはなりません。</li>
	<li>麻酔をかけたら、マウスを麻酔室から取り出し、小さなバリカンで膝、すねの中部から太ももの中央までの前面、側面に毛皮をクリップします。 注:後肢の膝の選択は、手術を行うのが簡単だと思う側のオペレーターの好み次第です。このプロトコルは左脚で作動した。</li>
	<li>マウスが完全に麻酔をかけられていることを確認します(足をつまんでも反応しません)。</li>
	<li>剃毛された露出した皮膚に抗菌性皮膚洗浄剤(例えば、クロルヘキシジンまたはヨードフォアを含む、 材料の表を参照)を適用して皮膚を消毒する。</li>
	<li>鎮痛の場合は、0.05 mg / kgのブプレノルフィンを皮下投与します。.</li>
	<li>マウスを背側に置き、膝を上向きに操作し、麻酔リグに接続されたノズルにマウスの鼻を置きます。</li>
	<li>小さな鍵穴開口部のある滅菌ドレープでマウスを覆います。</li>
	<li>膝蓋骨靭帯を上に向けて、手術する脚を90°未満に曲げ、足をサージカルテープで固定します。</li>
</ol>3.内側半月板手術の不安定化とそれに続く軟骨の引っかき傷
<ol><li>顕微鏡を調整して、膝蓋骨靭帯に焦点を合わせます。</li>
	<li>鋸歯状の鉗子で外側の膝の皮膚をつまみ( 材料の表を参照)、外科用ハサミを使用して遠位膝蓋腱に平行に小さな切り込みを入れ、はさみを導入して切り込みを約1 cmに広げます。皮膚を内側に移動し、膝蓋骨靭帯と近位脛骨プラトーを露出させます(図1)。</li>
	<li>11番の刃で、膝蓋靭帯の内側に沿って、靭帯の上から下に切開します(図1A)。膝蓋靭帯の底に達したら、ブレードを90°回転させ、切開部を膝蓋靭帯から内側に向かって伸ばして、関節包にアクセスします。 注意: 出血は、このステップまたは後続のステップで発生する可能性があります。出血が発生した場合は、滅菌綿棒を使用し、数秒(5〜30秒)圧力をかけます。</li>
	<li>鈍い先端鉗子で膝蓋靭帯をつまみ、手首を回転させて膝蓋骨靭帯を外側に移動し、膝蓋骨下脂肪パッド(IFP)を露出させるのに十分です。 注意: 膝蓋靭帯への損傷を最小限に抑えるために、ピンセットをきつく締めすぎず、靭帯を横に保つのに十分な量です。</li>
	<li>膝蓋靭帯を軽く持ちながら、IFPをマイクロピンセット( 材料表を参照)でつまんで持ち上げ、少し上に動かします。これにより、内側半月板靭帯を視覚化できます。</li>
	<li>内側半月板の頭蓋角を前脛骨プラトーに固定する内側半月板の内側半月板靭帯(MMTL)を特定します(図1B)。</li>
	<li>脛骨プラトーまたは大腿骨顆での損傷および長期の軟骨曝露を避けてください。</li>
	<li>MMTLを小さな2mmブレードのバンナススプリングはさみで慎重に切断し、内側半月板やその他の靭帯をそのまま残します。この時点で、DMMモデルの外科的処置は完了です(図1C)。</li>
	<li>3 mmの顕微手術ナイフを使用して、脛骨関節軟骨の3つの等間隔のくぼみを後部から前部への方向にマークします。 注意: スコアの長さは約1 mmで、軟骨の表面のみを損傷します(図2D)。<ol><li>ブレードを軟骨に無理な力を加えないでください(つまり、引っかき傷が表面的であることを確認してください)。この追加のステップは軟骨損傷を与え、DCSモデルを誘発します。</li>
	</ol></li>
	<li>2つまたは3つの小さな7 mm創傷閉鎖金属クリップまたは吸収性6-0皮下外科用縫合糸で皮膚を閉じます( 材料の表を参照)。 注:皮下外科用縫合糸は、それ以上の介入を避けるため優れていますが、手術期間を延長します。外部縫合糸は、マウスのかじりによる創傷開放のリスクを高める。</li>
	<li>偽手術のために内側半月板の内側半月板靭帯を特定しますが、切断しないでください。</li>
	<li>軟骨の傷のみを受けたマウスの場合は、靭帯を切断せずに3つの表面的な引っかき傷を作ります。 注:各マウスの間で、手袋を交換し、オートクレーブ を介して 器具を滅菌します。再利用する前に、機器が冷えていることを確認することを忘れないでください。</li>
</ol>4.術後のケア
<ol><li>出血が発生した場合(>50 uL)、500 μLの温かい滅菌生理食塩水を皮下(マウスの背面)に注射します。. 注:私たちの経験では、マウスにはわずかな出血がありますが、それは小さな滴を超えることはないため、水分を補充する必要はありません。</li>
	<li>手術後、マウスを清潔な紙ティッシュの回復ケージに入れ、麻酔からの回復(5〜10分)させます。</li>
	<li>手術後、完全に意識のあるマウスを新鮮な寝具のある清潔なケージに移します。</li>
	<li>外科的介入後72時間以内に、痛みや苦痛の兆候がないか監視します。.次の点に注意してください。<ol><li>体重の変化。体重は1日目と2日目に減少する可能性がありますが、これは通常、術前の体重の5%以下です。</li>
		<li>切開部の周りのグルーミングまたは過剰なグルーミングの一般的な欠如。</li>
		<li>猫背姿勢、顔をしかめ、異常な呼吸など、一般的な健康状態の悪化の兆候。</li>
		<li>創傷の腫脹、分泌物、または開口部によって示される創傷感染。 注:手術創が開くと感染が起こることがあります。外科的創傷修復(欠落している金属クリップの交換や再縫合など)は規制された手順であるため、修復を行う前に関連する承認が得られていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>手術後5〜7日の間に金属クリップを取り外します。</li>
	<li>マウスは、研究デザインに応じて、術後2〜52週間で通常維持します。</li>
	<li>研究中の任意の時点で痛み/歩行を評価します。 注:本研究では、ステップ5.1で説明されているように動的体重負荷を使用します。</li>
	<li>国内のライセンス契約、地域のガイドライン、および実験的承認に従って、承認された方法で動物を安楽死させます。 注:本研究では、動物は終末麻酔下での放血(心臓穿刺)とそれに続く頸部脱臼 によって 安楽死させました14。</li>
</ol>5.変形性関節症の評価
<ol><li>以下の手順に従って、痛みの代理測定として動的体重負荷を測定します。 注:マウスは獲物であるため、痛みの行動を隠す傾向があります。これは痛みの測定を困難にします。誘発性疼痛を測定するには、フォン・フレイ15 や歩行分析16など、多くの方法があります。本研究では、マウスがケージに入っている間に、圧力マット上で手術された変形性関節炎の脚と操作されていないコントロールレッグの間の差荷重を測定しました( 材料の表、 図2Aを参照)。<ol><li>マウスの重量を量ります。メーカーの特定の指示に従って、圧力マットを風袋引きして校正します( 材料表の動的重量負荷装置を参照)。ケージにマウスを入れます。</li>
		<li>ケージ内のマウスの動きと足の圧力を5分間記録します。取得したデータを分析して、製造元の指示に従って1分間検証します。 注意: DWBソフトウェアに関するメーカーの自動分析( 材料表の動的体重負荷機器を参照)は、総体重、各足がマットに留まった検証時間、および各足が占めるマット面積の推定に比例して各足の測定値を提供します。これにより、2つの後足間の差動荷重、前足と後足の間の差荷重、前足荷重の増加(同じマウスが一定期間にわたって測定された場合)、反対側の脚および足の表面と比較してOA脚を持ち上げるのに費やされた時間の計算が可能になります。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)による石灰化組織の定量化。 注:軟骨下骨硬化症と骨棘形成は組織学的切片で測定できますが、μCTは3次元で定量する機会を提供します。5μmのμCTでの画像キャプチャの解像度は、骨棘などの小さな構造の視覚化を可能にするため十分ですが、解像度が高いほど優れています。<ol><li>膝関節を4%パラホルムアルデヒド溶液で24時間固定し、70%EtOHに移します。</li>
		<li>μCTスキャナーで膝関節をスキャンします。 注:本研究では、サンプルはμCTスキャナー( 材料表を参照)でスキャンされ、50kVおよび200μAに設定された0.5アルミニウムフィルターを使用してスキャンされました。 サンプルは4.5μmのボクセルサイズで検査されました。2 μm、イメージング用の回転角度は0.2°、定量用の回転角度は0.5°です。</li>
		<li>スキャンを再構築して、3Dビジュアライゼーションを可能にします。ここに示すスキャンは、互換性のあるソフトウェアを使用して再構築されました(材料表を参照)。</li>
		<li>以下の手順に従って、軟骨下骨硬化症(図2B)を分析します。<ol><li>内側脛骨プラトー17の荷重の中心にある0.5 mm×0.9 mm×0.9 mmの関心体積(VOI)を選択します。</li>
			<li>マウスの内因性骨表現型に対して、手術を受けていない脚を分析することによって正規化します。</li>
			<li>CTanソフトウェアを使用して、脛骨骨端、軟骨下プレート、またはスタックの2次元冠状ビュー内の軟骨下骨全体の構造を描写する関心領域(ROI)を選択することにより、軟骨下骨密度とマイクロアーキテクチャを決定します( 材料の表を参照)。 注:疾患が進行するにつれて、軟骨下プレートと軟骨下小柱領域との間の分離は区別がより困難になる。次に、関節腔から成長板まで選択された軟骨下骨の領域を分析することをお勧めします。</li>
		</ol></li>
		<li>以下の手順に従って骨棘を定量します(図2C)。<ol><li>CTvolソフトウェアを使用して、再構築された3次元画像スタック内の骨棘を特定します( 材料の表を参照)。 注:石灰化骨棘は、軟骨下骨18の内側に見える織骨に似た突起である。これらの例は、 図2Cに黄色の矢印で示されています。</li>
			<li>膝関節の内側で識別された骨棘の数を手動で数えます。</li>
			<li>2Dシーケンシャル画像解析(CTアナライザーを使用)で骨棘の体積を測定し、骨棘のエッジを手動で描写し、分析用の関心領域(ROI)として軟骨下プレートから突き出します。</li>
			<li>CTアナライザーソフトウェアを使用して、骨棘の体積に対する骨の体積の比率として骨棘の骨密度を計算します( 材料の表を参照)。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>パラフィン包埋6μm切片のOARSI軟骨損傷スコア19および滑膜炎スコア20に従って、軟骨損傷および滑膜炎(図2D)を評価します。<ol><li>スキャン後、膝関節を10%EDTAで4°Cで最低2週間脱灰し、週に2回溶液を交換します。</li>
		<li>サンプルをパラフィンに埋め込みます。治療と潜伏期間については、 補足ファイル1を参照してください。</li>
		<li>パラフィン包埋サンプルの5 μmコロナ切片を回転式ミクロトーム上で切断します( 材料表を参照)。</li>
		<li>脛骨と大腿骨の顆が出会う領域のセクションを選択します(図2D)。ジョイントの 3 つの等距離の領域で 2 つの断面を選択します。 注:本研究で採点されたセクションは、80〜100μm離れた領域で選択されました。</li>
		<li>以下の手順に従って、サフラニン-Oとファストグリーン( 材料表を参照)でセクションを染色します。<ol><li>切片をキシレンに5分間(2x)、100%エタノールで2分間、95%エタノールで2分間、80%エタノールで2分間、70%エタノールで2分間沈めることにより、切片を脱パラフィンします。</li>
			<li>ろ過したヘマトキシリン( 材料の表を参照)で30秒間染色します。その後、水道水で5分間(3回)すすいでください。</li>
			<li>スコット緩衝液(1 Lの蒸留水に2 gの重炭酸ナトリウムと10 gの硫酸マグネシウム)で2分間洗浄します。「水道水」で5分間(3回)すすぎます。</li>
			<li>0.2%ファストグリーンで4分間染色します。1%氷酢酸に5回浸します(各セッションで作りたて)。水道水ですばやくすすいでください。</li>
			<li>0.5%サフラニン-Oで5分間染色します。95%エタノールですすいでください。切片を100%エタノールで3分間脱水した後、キシレンで3分間脱水します。</li>
		</ol></li>
		<li>軟骨19 についてはGlassonら、滑膜炎についてはJacksonらに記載されているスコアセクション20。 注:Pinamontらによるコンピュータベースの定量など、他の定量方法も存在します21。</li>
		<li>実験を知らされていない2つの異なるスコアラーでスコアリングシステムを検証します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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著者は開示するものは何もありません。

心的外傷後変形性関節症(PTOA)の外科的導入を行うには、アシスタントからのサポートが強く推奨されます(たとえば、オペレーターが手術に集中している間にマウスを準備する)。これにより、無菌手術が容易になり、それによって感染のリスクが軽減され、大規模な実験での介入がより効率的になります。手術中に焦点が合ってしまいやすいため、ピント合わせ用のペダルを備えた顕微鏡は、手術中ずっと無菌性を維持するのに役立つ貴重な機能です。マウスと膝の位置は非常に重要です。膝は上向きで、膝関節腔の開口部を最大化するのに十分に曲げられなければならず、顆葉表面を引っ掻くためにマイクロブレードを導入するための靭帯へのアクセスを容易にする。MMTLの特定は、特に脂肪パッドが通常よりも大きい場合や小さな出血がある場合、困難な場合があります。出血を避けるために、脂肪パッドを上に押して、涙やその後の出血を防ぎます。ファットパッドが大きい場合、これには少し時間がかかる場合がありますが、辛抱強く上向きに押し続けます。
MMTLは脛骨顆に非常に近いため、湾曲したスプリングはさみの下刃をMMTLの下に配置するときは、軟骨を傷つけないように注意する必要があります。湾曲したブレードは、顆と平行に内側とわずかに上向きに向いている必要があります。MMTLの最良のセクショニングのために、はさみが鋭利であることを確認してください。靭帯を切断した後、半月板が内側に動くことができることを確認してください。マイクロブレードを導入して顆を傷つけるときは、顆に対して垂直でなければなりません。最初の引っかき傷を関節の中央に近づけますが、前十字靭帯を傷つけないように注意してください。次に、内側に向かって移動し、次に半月板の後ろに移動します。傷は軟骨にかすかな白い線として見えるかもしれません。普段はクリップを使うので、最初の切開は外側におこなうので、傷口を閉じた後、クリップは脚の側面に配置されます。これにより、マウスの動きを取り戻すときにクリップが膝をこするのを防ぐことができます。縫合糸を使用する場合は、皮下ステッチの使用を強くお勧めします。外部ステッチを使用する場合、マウスはステッチをかじって傷口を開く可能性があり、感染の可能性が高まります。正しく行われた場合、この手術は切開から創傷閉鎖まで5〜10分以上かかってはならないため、軟骨の露出と発生する可能性のある追加の制御不能な損傷を最小限に抑えることができます。手術後、マウスは非常に迅速に回復し、ほとんどすぐにケージに登って正常に動き回ることができます。マウスがアクティブでない場合は、ユニットの適切な専門家に相談する必要があります。
疼痛の行動評価のために、動的体重負荷を評価した。ただし、この方法は、フォンフレイテスト15などの他の誘発性疼痛テストよりも感度が低いと見なされる場合があります。痛みを監視および評価するために複数の方法を使用することをお勧めします。DCSへの介入の2週間後に観察された変化は、一時的であっても、健康な脚と比較してOA脚の負荷が一般的に減少していることを示しています。したがって、DCS介入の2週間後に、マウスモデルにおける早期の変形性関節炎または損傷性疼痛を評価するために使用され得る。μCTによる石灰化骨棘の視覚化は、組織学的切片12にも一致させることができる3次元定量を可能にし、骨棘の出現と進化の研究に別の次元を追加します。我々のグループでは、DMMモデルでは、オペレーター間およびオペレーター内で骨棘の存在が変動し(2.3 ± 1 vs 1.2 ± 1、n > 7、P = 0.0183)、DCSの誘導は、オペレーターに関係なくすべてのケースで骨棘の生成に堅牢につながりました(2.6 ± 0.7 vs 2.4 ± 0.5、n > 7、P = 0.711)。 また、DCSモデルには、DMMと比較して有意に多くの骨棘があります。したがって、DCSは骨棘形成の研究に理想的なモデルです。軟骨下骨の負荷領域に限定された骨硬化症の定量化も、小さな変化の検出における改善である。手術された脚の内側コンパートメントを反対側の脚と比較することも、その特定のマウスの固有の骨表現型に対して正常化する方法を提供する12。DCSモデルにおける軟骨の引っかき傷の追加は、疾患の多くの側面を加速する手術中に集中的な軟骨損傷を誘発する制御された手段である。軟骨自体への意図的な損傷を含む実験手順の結果の1つは、この人工的な損傷を軟骨グレーディングシステムで除外または調整する必要があることです。この制限のため、研究の主な目的が軟骨自体に対する変形性関節症の影響を理解することである場合、このモデルはお勧めしません。最後に、少なくとも2人の盲検スコアラーに軟骨損傷と滑膜炎のスコアを評価させることを強くお勧めします。これにより、スコアリングシステムの標準化が検証され、強化されます。
この研究の限界は、DCSモデルとDMMモデルを比較するすべてのパラメータにわたる変動の程度が完全に評価されていなかったことです。これは将来、より広範な研究で対処され、異なる機関のオペレーター間の変動性の評価も含まれる可能性があります。
結論として、現在のDCSモデルにおける加速されたOA病因は、心的外傷後OAの表現を可能にし、この慢性衰弱性関節疾患を引き起こす根底にあるOA病態生理学的メカニズムを調査および解明するための強力で堅牢な研究ツールを提供します。さらに、骨植物形成、OAの痛み、および関節全体に対する軟骨損傷の影響に焦点を当てて、OAをより短い時間枠で探索することができます。

変形性関節症(OA)は、45歳以上の人々に最も蔓延している筋骨格系疾患であり、英国では875万人以上が治療を求めています1。この病気の有病率の増加は、経済的および社会的コストの増加につながり、障害の主な原因であり、患者の生活の質を低下させています1。利用可能な治療法がなければ、病気の発症と進行を理解するための研究を加速することが急務です。この病気は複雑であり、その性質上多因子性でもあります。この疾患の主な臨床測定値は疼痛と関節可動性2であり、OAは軟骨3だけでなく関節のすべての組織に影響を与えます。OAを理解する上での主な課題の1つは、最初の症状/損傷から痛みや不動を伴う症候性疾患の進行まで、数年、時には数十年かかる可能性があることです。 
げっ歯類の変形性関節症をモデル化することで、OA病態生理学の知識が深まり、はるかに短い時間枠で、関与する組織の詳細な検査で開始と進行を理解できるようになりました。変形性関節症のマウスモデルは、遺伝子組み換え動物から外科的介入モデルまで多数あります。心的外傷後OAの最も広く使用されているマウスモデルは、内側半月板(DMM)の不安定化です4,5。このモデルの注意点は、異なる演算子間のばらつきです。経験豊富な外科医は最小限の関節損傷で手順を実行できますが、経験の浅いオペレーターは関節包を長期間露出させ、軟骨に損傷を与えます。プロセスのこの変動性はモデルの重症度に影響を与え、初期損傷が多いほど軟骨損傷スコアと骨棘形成が増加します。オペレーター間の変動を減らし、臨床介入による軟骨損傷を模倣することを意図して、このモデルの修正バージョンが開発され、それによって3つの表面的な引っかき傷の形で軟骨表面に制御された追加の損傷が与えられます6。これにより、いくつかの臨床介入によって引き起こされた軟骨損傷に起因するOA進行をモデル化することもできます。標準的なDMMモデルと比較して、直接誘発された軟骨損傷は、雄マウスにおいて一貫して加速された突出した骨棘形成、軟骨損傷および炎症の増加、および測定可能な代理痛をもたらす。
このモデルは、骨棘形成、疼痛症状(雄マウス)、滑膜炎、および骨パラメータの早期変化に焦点を当てた、初期段階の心的外傷後OAの研究に特に適しています。このモデルにおける骨棘形成の一貫性は、骨棘形成が軟骨内骨化 による 修復のプロセスであるため、骨修復と軟骨内骨化の研究に適切です7。このモデルは、関節鏡視下手術などの臨床介入中に軟骨に直接導入される損傷も模倣しているため、関節全体に対する軟骨損傷の影響の研究にも適しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 scalpel blade (and scalpel handle).</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500240</td>
			<td>access the joint capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15&#176; Cutting Angle microsurgical stab knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>REF7503</td>
			<td>scratch the cartilage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 vicryl rapide</td>
			<td>Any medical supplies provider</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative method to close wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic rig</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibacterial skin clenser (Hibiscrub)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>-</td>
			<td>To sterilise surgical skin area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator for 7 mm clips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500343</td>
			<td>close the wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>To weigh mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>500232</td>
			<td>move the patellar ligament to the side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Vetergesic)</td>
			<td>Supplied by unit as it is a prescription drug</td>
			<td>-</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT analyser</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>3D.SUITE software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctvol</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>3D.SUITE software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data viewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>3D.SUITE software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic weight bearing equipment</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>BIO-DWB-DUAL</td>
			<td>Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E9884</td>
			<td>10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>for embedding decalcified bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7252</td>
			<td>For staining sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1005706</td>
			<td>For stianing sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haematoxylin solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td>Nuclear staining in paraffin sections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoskins #21 micro-tweezers.</td>
			<td>Cameron surgical limited</td>
			<td>PHF1085</td>
			<td>move the fat pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Supplied by unit as it is a prescription drug</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>-</td>
			<td>C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcomputed tomography scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>SKYSCAN 1272 CMOS</td>
			<td>&#181;CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore surgical paper tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12787597</td>
			<td>hold leg in position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>for embedding decalcified bones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips or</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>12032-07</td>
			<td>close the wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remover for 7 mm clips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500347</td>
			<td>remove wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>To cut section of Paraffin embedded tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2255</td>
			<td>For staining sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>15915</td>
			<td>hold the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>To ensure sterility of surgical area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape with key hole</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>To cover mouse and expose leg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>maintain sterile environment for surgical tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape with key hole</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>cover the mouse and keep leg through key hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>open the wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope.</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable focus.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors with 2 mm blades.</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>15000-04</td>
			<td>cut the MMTL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Generic (many different suppliers)</td>
			<td>-</td>
			<td>for embedding decalcified bones</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

destabilization of the medial meniscus and cartilage scratch murine model of accelerated osteoarthritis

変形性関節症は、45歳以上の人々に最も蔓延している筋骨格系疾患であり、経済的および社会的コストの増加につながります。動物モデルは、病気の多くの側面を模倣するために使用されます。本プロトコルは、心的外傷後変形性関節症の不安定化および軟骨引っ掻きモデル(DCS)を記載する。広く使用されている内側半月板(DMM)モデルの不安定化に基づいて、DCSは軟骨表面に3つの引っかき傷を導入します。現在の記事では、内側半月板靭帯を横断し、続いて関節軟骨に3つの意図的な表在性引っかき傷を負わせることによって膝を不安定にする手順を強調しています。動的体重負荷、マイクロコンピューター断層撮影、および組織学による可能な分析方法も示されています。DCSモデルは、軟骨に対する変形性関節症の影響に焦点を当てた研究には推奨されませんが、(1)骨棘の形成、(2)変形性関節炎および損傷の痛み、および(3)関節全体の軟骨損傷の影響に特に焦点を当てて、より短い時間枠で変形性関節症の発症の研究を可能にします。

後方手術/OA脚の総体重あたりの荷重率を対側/対照脚と比較した。外科的介入後の前足負荷の増加など、他のパラメータも有意差を与える可能性があるが、後足負荷の一貫した変化は、片方の脚をもう一方の脚よりも使用することを好むことを示し、OA発達によるマウスの重大な不快感のより直接的な指標である。導入後8週間以内にDMMモデルでは後脚負荷に有意な変化はありませんでしたが、DCSマウスは介入後2週間で対側/対照脚に有意に有利です(図3A)。
軟骨下骨は、脛骨顆の内側負荷領域の下の体積に着目して分析した。ここでは、関心領域内の石灰化骨の割合を決定することによってこの領域の骨密度を評価し、反対側と同側の脚の比率を計算しました。この比率は、両方のモデルが誘導後4週間で患肢の骨密度が増加したことを示しています(図3B)。骨棘の出現はDCSモデルでより顕著であり、介入後2週間でDMMモデルと比較して数と体積が大幅に増加します(図3C、D)。DCSは、誘発後4週間で内側脛骨および大腿骨コンパートメントおよび滑膜炎(図3E、F)に軟骨損傷の上昇を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig01.jpg"> 図1:マウスの心的外傷後OAを誘発するための外科的介入。 シーケンシャル画像は、手順のさまざまな段階を表します。(A)膝蓋靭帯の内側に11番メスの刃を挿入し、靭帯から離して膝の周りの表膜を切断する関節包の露出。これにより、膝蓋骨下脂肪パッドが露出します。(B)内側半月板靭帯の識別と切断。靭帯を特定するには、膝蓋骨靭帯を外側に向かって動かしてから、脂肪パッドを上に押し上げます。これにより、靭帯を脛骨顆のすぐ上の小さな水平の白い線として視覚化できます(ここでは黒い矢印で示されています)。靭帯を切断するには、スプリングハサミの下刃を靭帯の下に置き、軟骨を傷つけないように注意します。半月板を内側に向かって動かして、脛骨顆を視覚化します。(C)露出した軟骨の表面を引っ掻き、傷口を閉じる。軟骨を引っ掻くために、マイクロブレードは後側に向かって挿入され、そこで軟骨に接触し、次に関節の前部に向かって前方に移動します。引っかき傷ができたら、皮膚を膝の上に引っ張り、皮下縫合または創傷クリップで傷を閉じます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig02.jpg"> 図2:マウスにおける変形性関節症の評価 。 (A)動的体重負荷は、圧力マットの荷重を対応する足に合わせることで構成されます。荷重は、総重量に対する割合として表されます。(B)軟骨下骨は、内側脛骨顆の負荷領域における対象体積を選択し、軟骨下プレートまたは骨梁を選択することによって測定される。これらの画像は4.5μmの解像度です。 (C)骨棘を同定し、取得したμCT画像の3次元ビューで定量化します。骨棘の体積は、骨棘の縁を描写するROIを選択することによって測定されます。骨密度は、骨棘体積あたりの骨体積として計算されます。ここに示されている画像は2 μmの分解能で撮影されていますが、定量化は通常4.5 μmの解像度で行われます。(D)軟骨および滑膜炎のスコアは、サフラニン-Oおよびファストグリーンで染色された6μm切片から採取されます。黒いボックスでマークされたすべての象限がスコアリングのために表示され、内側の倍率が示されているマウス膝の冠状断面。膝関節の内側を囲む滑膜炎も、特に変位した半月板の上下に見えます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig03.jpg"> 図3:DMMモデルとDCSモデルにおけるOAの代表的な評価。 (A)同じ専門オペレーターによって実施された実験で導入後8週間まで測定されたDWB。負荷は、運転/OA負荷と対側/制御負荷の比率として表されます。両脚の対応のあるt検定は、シャム(灰色)、DMM(青)、およびDCS(ピンク)モデルにも示されています。外科的介入の4週間後のμCT分析。(B)軟骨下骨は外科的介入の4週間後に分析され、対側%BV / TVに対する同側の比率として表されました。(C)骨棘数および(D)骨棘量は、誘導後2週間で分析した。(E)内側脛骨および大腿関節軟骨の軟骨損傷および(F)滑膜炎の誘導4週間後の組織学的評価を標準化法19、20でスコア化した。データは、平均値±標準偏差、n≥5で表されます。データは、反復測定ANOVAとŠídák検定補正(A)、対応のあるt検定(A)、または標準的なスチューデントのt検定(B-F)によって比較されました。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = 有意ではない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:パラフィン包埋のための治療およびインキュベーション条件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Destabilization of the Medial Meniscus and Cartilage Scratch Murine Model of Accelerated Osteoarthritis

本プロトコルは、内側ミニスコティビアル靭帯を切断することによってマウス膝を不安定化させた後の関節軟骨の表面における制御されたマイクロブレードの引っかき傷を記載する。この動物モデルは、骨棘形成、骨硬化症、および初期段階の痛みの研究に適した変形性関節症(OA)の加速型を提示します。

加速変形性関節症の内側半月板および軟骨スクラッチマウスモデルの不安定化

Osteoarthritis is the most prevalent musculoskeletal disease in people over 45, leading to an increasing economic and societal cost. Animal models are ...

この方法は、ヒトの心的外傷後変形性関節症の多くの側面をモデル化し、より短い時間枠で疾患と可能な治療法の影響を調査する方法を可能にします。この技術の主な利点は、介入後わずか2週間の短期的に、マウスが一貫した測定可能な骨棘形成と、痛みを示す患部の脚の負荷の変化を示したことです。骨棘形成と軟骨内骨化、および傷害による痛みの研究のこのモデルを使用することをお勧めします。内側半月板靭帯の識別と切断は困難な場合があるため、自信が持てるまで死体でこれを練習することをお勧めします。手順のデモンストレーションを支援するのは、筋骨格科学センターの研究助手であるリネット・ダニングです。まず、手術を行うための無菌室を指定し、すべての表面が無菌であることを確認します。滅菌器具を滅菌ドレープに配置して配置します。次に、マウスの重量を量ります。麻酔をかけたマウスの毛皮を、小さなバリカンで、脛の中央から太ももの中央まで、膝、前面、側面にクリップします。剃毛した露出した肌に抗菌スキンクレンザーを塗って肌を消毒します。鎮痛のために、ブプレノルフィンの1キログラムあたり0.05ミリグラムを皮下投与します。マウスを背側に置き、操作する膝を上向きにして、麻酔リグに接続されたノズルにマウスの鼻を置きます。小さな鍵穴開口部のある滅菌ドレープでマウスを覆います。膝蓋骨靭帯を上向きにし、足をサージカルテープで固定した状態で、膝を90度未満の角度に固定して、操作する脚を配置します。顕微鏡を調整して、膝蓋骨靭帯に焦点を合わせます。鋸歯状の鉗子で外側の膝の皮膚をつまむ。外科用ハサミを使用して遠位膝蓋腱と平行に小さな切り込みを入れます。はさみを導入し、カットを約10ミリメートルに広げます。皮膚を内側に移動し、膝蓋骨靭帯と近位脛骨プラトーを露出させます。11番の刃を使用して、膝蓋靭帯の内側に沿って上から下に切開します。膝蓋靭帯の底に達したら、ブレードを90度回転させ、切開部を膝蓋靭帯から内側に向かって伸ばして、関節包にアクセスできるようにします。鈍い先端の鉗子で膝蓋靭帯をつまみ、手首を回転させて膝蓋骨を外側に移動し、IFPを露出させるのに十分なだけにします。膝蓋靭帯を軽く持ったまま、IFPをマイクロピンセットでつまんで持ち上げ、少し上に動かします。出血がある場合は、綿棒で圧力をかけます。内側半月板の頭蓋角を前脛骨プラトーに固定する内側半月板のMMTLを特定します。MMTLを小さな2ミリメートルのブレードスプリングハサミで慎重に切断し、内側半月板やその他の靭帯を無傷のままにします。3ミリメートルの顕微手術ナイフで、後方から前部への方向に脛骨関節軟骨の3つの等間隔のくぼみをマークします。2〜3個の小さな7ミリメートルの創傷閉鎖金属クリップで皮膚を閉じます。手術後5〜7日の間に金属クリップを取り外します。次に、研究中の任意の時点で痛みや歩行を評価します。膝関節のマイクロCTスキャンを分析することにより、石灰化した組織を定量化します。軟骨下骨硬化症を分析するには、内側脛骨プラトー負荷の中心にあるVOIを選択します。次に、CTアナライザソフトウェアを使用して、脛骨骨端、軟骨下プレート、または総軟骨下骨をスタックの2次元冠状視野で描写する関心領域を選択することにより、軟骨下骨密度とマイクロアーキテクチャを決定します。CTVolソフトウェアを使用して、再構築された3次元画像スタック内の骨棘を特定します。パラフィン包埋された5マイクロメートルの切片で、OARSI軟骨損傷スコア19および滑膜炎スコア20に従って軟骨損傷および滑膜炎を評価します。導入後8週間以内にDMMモデルでは後脚荷重に有意な変化はなかったが、DCSマウスは介入後2週間で対側または対照脚を有意に支持した。対側脚と同側脚の比率は、両方のモデルが導入後4週間で患肢の軟骨下骨負荷領域の骨密度を増加させたことを示しました。骨棘の出現はDCSマウスでより顕著であり、介入後2週間でDMMモデルと比較して数と体積が大幅に増加しました。DCSは、内側脛骨および大腿骨コンパートメントの軟骨損傷の上昇、および誘発の4週間後の滑膜炎を示します。損傷は、意図的に影響を与えたい構造に限定する必要があるため、他のすべての構造を無傷に維持し、軟骨の露出を最小限に抑えるために特別な注意が必要です。意図的な軟骨傷を含むように修正することで、骨植物形成、早期変形性関節症、または損傷痛、および軟骨損傷が関節全体に及ぼす影響に焦点を当てて変形性関節症を調査することができます。

Research

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