Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
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这项工作得到了以色列科学基金会（MSC个人资助）的资助以及以色列科学基金会与中国国家自然科学基金的联合项目。

下面描述的所有程序都得到了耶路撒冷希伯来大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 试剂和缓冲液的制备
<ol><li>将水浴预热至37°C。</li>
	<li>准备 表1中的所有溶液。</li>
</ol>2.肠道间充质分离
<ol><li>通过吸入CO2 对小鼠实施安乐死，然后立即进行颈椎脱位。</li>
	<li>将鼠标置于仰卧位，并用70%的EtOH喷洒腹部。提起腹部皮肤并沿中线纵向切割以暴露腹膜腔（见 图1I ，II）。</li>
	<li>找到胃，从食道切开，然后慢慢将肠从腹膜腔中拉出。用镊子清洁多余的脂肪和结缔组织。从十二指肠切除小肠至距盲肠约0.5厘米（图1 III，IV）。</li>
	<li>在含有冷无菌PBS的培养皿中清洗肠道。使用球尖剪刀，纵向打开肠管并冲洗粪便（图1 V）。将肠道转移到含有新鲜冷PBS的新盘中，然后再次清洗。</li>
	<li>将小肠切成 1 cm 长的段，然后转移到装有 8 mL PBS 的 15 mL 锥形管中。以一个或两个循环/秒的速度手动摇动试管1分钟。</li>
	<li>使用镊子将分段转移到装有20 mL新鲜溶液A的50 mL锥形管中（见 表1）。将试管置于37°C的轨道振荡器培养箱中20分钟。孵育后，用手以四或五个循环/秒的速度剧烈摇动试管1分钟以解离上皮。</li>
	<li>重复步骤 2.6 一次。</li>
	<li>将片段转移到装有 10 mL 无菌 PBS 的新 50 mL 管中，并以一个或两个循环/秒的速度倒置管 1 分钟。</li>
	<li>将分段转移到装有 10 mL 无菌 PBS 的新 15 mL 管中，并以一个或两个循环/秒的速度轻轻上下倾斜 2 分钟。</li>
	<li>在生物安全柜下，用镊子将片段放在无菌实验室湿巾上以使其干燥。干燥后，将段进一步切成 0.5 厘米的小块。</li>
	<li>使用镊子将小段转移到每孔填充有 4 mL 预热消化溶液的 6 孔板中。在37°C孵育50分钟。每20分钟用手轻轻摇动盘子。</li>
	<li>使用巴斯德移液管将分段转移到装有 4 mL DMEM 的 15 mL 锥形管中。以四或五个循环/秒手动摇动试管 1 分钟以获得单细胞悬液。</li>
	<li>通过 100 μm 过滤器将悬浮液过滤到 50 mL 锥形管中。将滤液在4°C下以700× g 离心5分钟。</li>
	<li>通过抽吸弃上清液并将细胞沉淀重悬于 5 mL 的 2% FBS/PBS 中。在4°C下以700× g 离心悬浮液5分钟。</li>
	<li>通过抽吸弃上清液，用 12 mL 培养基重悬细胞沉淀，并将每孔接种 1 mL 到两个 6 孔板上。第二天，清洗并吸出任何垂死的细胞，并用新鲜培养基替换用过的培养基。 注意：为了保持培养物的最佳效果，建议每2天更换一次培养基。根据小鼠品系、遗传背景和年龄，间充质需要 4 天到 2 周才能准备好进行共培养实验。对于进一步的共培养实验，间充质应达到汇合，显示平坦且完全拉伸的细胞形态，如图 2所示。一般来说，具有圆形形态的细胞是不可存活或无功能的。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> 图1：小鼠解剖 。 （I）将小鼠仰卧位，用70%EtOH喷洒腹部。提起腹部皮肤。（二）沿中线纵向打开腹膜腔。（三）轻轻拉胃的同时，切断食道。（四）捏胃，慢慢拉出肠子。（五）将球尖剪刀的尖端插入腔内，纵向打开肠管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
3. 间充质重悬用于传代或共培养
<ol><li>用 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-0.5 mM EDTA/孔重悬间充质在 6 孔板中。在37°C孵育5分钟。 孵育后，如果几个细胞尚未开始从培养皿中分离，请再孵育2分钟。</li>
	<li>使用细胞刮刀，轻轻刮擦孔表面。将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。加入 2 mL DMEM-F12/孔，轻轻上下移液悬浮液。 注意： 重要的是不要用超过管体积的 50% 过度填充管子。因此，建议每两个孔使用装有 8 mL 悬浮液的 15 mL 锥形管。</li>
	<li>计数细胞。 注意：完全汇合的孔产生2×106 细胞和2.5×106 细胞。</li>
	<li>稀释细胞悬液以达到 3-5 × 105 个细胞/mL 的接种密度。在4°C下以500× g 离心5分钟，并通过小心抽吸弃上清液。 注意：尽可能多地去除液体很重要。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于预热的培养基和平板中。</li>
</ol>4. 用于端细胞纯化的流式细胞术分析
<ol><li>获得间充质细胞沉淀（步骤2.14）。将细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，并通过 40 μm 过滤器过滤。</li>
	<li>将细胞悬液与别藻蓝蛋白 （APC） 偶联的 CD326 （1：100）、CD45 （1：400） 和 CD31 （1：250） 抗体在 400 μL FACS 缓冲液中在室温下孵育 15 分钟，以分别从分类中排除上皮细胞、免疫细胞和内皮细胞。</li>
	<li>通过加入1mL FACS缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以700×g旋转5分钟。 重悬于 400 μL FACS 缓冲液中，加入 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，5 mg/mL，1：1，000）用于流式细胞术分析。根据SSC高度按SSC区域对单个细胞进行门控。门控DAPI-活细胞并门出CD45 + / CD31 + / CD326 +以分选GFP +端细胞，如图3所示。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

作者没有利益冲突需要声明。

在这里，我们开发了一种使用FOXL1-Cre：Rosa26-mTmG小鼠模型从小鼠小肠中分离间充质的方案，该模型使研究人员能够将端细胞与其他间充质细胞区分开来。此协议中有一些关键步骤要遵循。首先，重要的是以四到五个周期/秒的速度剧烈摇动试管，以在间充质分离期间丢弃大部分上皮细胞。酶消化的孵育时间必须根据消化效率进行优化。在孵育期间，每20分钟轻轻水平摇动板几秒钟。一旦组织变成细丝状，必须通过继续方案步骤2.12来停止孵育。长时间暴露组织可能会导致细胞活力率和产量低。酶消化后，必须机械摇动管以释放更多的单细胞悬浮液;理想情况下，溶液应该看起来浑浊，并且不应该看到任何组织碎片。如果不是这种情况，请将酶消化延长至60分钟。
保持无菌条件并避免潜在的细菌污染是使用原代组织培养时的关键步骤之一。必须使用无菌解剖工具、试剂和缓冲液;与动物一起工作时必须更换手套，并且必须清洁工作区域。获得细胞悬液后，应在层流生物罩下进行工作。接种后，细胞应在不受干扰的情况下孵育过夜，因为这会影响粘附。此外，重要的是在接种后一天更换培养基，因为非贴壁细胞可能会影响培养活力。
本协议中使用的表面标志物与其表位发生强烈反应;然而，酶消化可能会影响结合反应性，因此影响FACS分析结果。该协议的另一个限制是肌肉层的代表性不足。为了提高肌肉层细胞分离的效率，我们建议将肌肉与粘膜层机械分离，并对每一层进行分离酶消化。为了将上皮与基质解离，可以使用机械分离剂或螯合剂（EDTA或DTT）;然而，用于获得单细胞的酶消化已在该方案中得到优化。
肠道间充质的分离先前已有报道8;用盖玻片刮掉绒毛会导致绒毛旁边的一些间充质丢失，尤其是绒毛尖端间充质细胞，例如 Lgr5+ 绒毛尖端端细胞13。在该协议中，我们利用VIII型胶原酶而不是分散酶II和胰蛋白酶与DNase I相结合，因为胶原酶更有效地从基质中释放间充质细胞。虽然它延长了处理时间（>90分钟对35分钟），但两种方案产生了相似的细胞活力率;目前的方案一般提高了间充质细胞的产量，更具体地说是端细胞部分的产量。目前的方案产生约10%的GFP +端细胞，通过可视化和FACS分析确认，而早期的方案产生2%的GFP +端细胞。补充表S1列出了当前协议与两种参考协议之间的主要区别。
FOXL1 + GFP+细胞作为上皮下端细胞的鉴定基于体内研究。需要开发和修改可用的间充质分离方案以产生更高产量的端细胞，以及如何实现这一目标的知识是基于我们对体内FOXL1 +端细胞的结构和功能的理解，作为具有长细胞投影的大细胞紧密附着在上皮细胞上。
有趣的是， 离体 GFP+ 端细胞表现出与其 在肠道 体内特征相似的细胞特征，因此建议作为类器官生长的理想支持。尽管该协议主要讨论从小肠中分离端细胞，但可以使用具有微小修改的类似方案并轻松应用于结肠间充质细胞，例如最近描述的MAP3K2调节的肠基质细胞（MRISC）12。
一旦间充质细胞拉伸并达到汇合，它们就可以用于几种其他应用，例如使用无生长因子的基质胶与小鼠或人源类器官进行3D共培养。间充质通常形成一个完全支持类器官形成和生长的网络，无需补充外源性生长因子。肠基质具有固有的3D特征，可以为上皮提供机械支持14。因此，该协议也可用于分离间充质以集成到3D生物打印支架中，并用于进一步的异种移植实验。

由于干细胞的存在，小肠和结肠都是高度再生的组织，干细胞会增殖并推动再生1。上皮周围的间充质通过分泌调节上皮细胞反应的细胞外基质蛋白和信号分子2提供结构和功能支持。端细胞是大的间充质细胞，到目前为止主要通过电子显微镜描述为具有长细胞质过程的细胞，称为端足，它们重叠以形成迷宫网络3，4，5，6，7。最近，表达转录因子FOXL1的肠端细胞已成为提供Wnt蛋白的重要干细胞生态位成分，Wnt蛋白对干细胞和祖细胞功能至关重要。肠端细胞表达高水平的关键信号通路蛋白，如Wnt、Bmp、Tgfb和Shh，以及许多生长因子8。
鉴于端细胞是体内关键的干细胞生态位成分，开发离体分离和培养它们的方案将允许它们用作信号分子和生长因子的来源，以支持体外生长和分化。使用完善的方案，可以分离结肠或肠上皮隐窝并形成称为类器官的3D结构9，10，11。三维类器官是研究体外肠上皮生理和病理学的有力工具。在离体系统中，类器官依赖于外源性补充因子的生存和生长10。分离的间充质可以用小鼠和人源性类器官培养，并用作生长因子的来源，而不是外源性补充剂，以更好地反映原始组织中的情况。离体研究端细胞在更详细地研究正常或病理细胞行为、组织稳态机制和细胞间相互作用方面有许多好处。
尽管有描述如何从小鼠肠道中分离间充质的方案，但尚不清楚这些程序是否会导致端细胞的有效分离。成功分离端细胞需要特殊的方案调整，以允许解离端细胞和邻近细胞之间的强细胞 - 细胞接触，而不影响其活力。为了克服这些限制，本文提出了一种改进的方案，该方案始终如一地产生高度活泼的单细胞悬液，其中包含相对大量的具有足够保守的抗原和功能特性的端细胞。这些端细胞可用于多种应用，包括与小鼠或人源性类器官共培养，以支持生长而无需补充生长因子。这反过来又更好地反映了原始组织中的情况。
我们使用FOXL1-Cre：Rosa-mTmG小鼠模型8，其中端细胞用绿色绿色荧光蛋白（GFP）的膜结合版本标记，这允许研究人员跟踪整个端细胞;所有其他间充质细胞都用红色的膜结合tdTomato标记。目前的方案是从分离肠间充质12 的方案修改而来的，以提高端细胞产量和活力。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

小鼠小肠或结肠间充质是高度异质的，包含不同的细胞类型，包括血液和淋巴内皮、神经、成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、免疫细胞和最近鉴定的细胞类型端细胞。端细胞是独特的间充质细胞，具有长细胞质过程，距离细胞体达到数十至数百微米的距离。端细胞最近已成为重要的肠道干细胞生态位成分，提供对干细胞和祖细胞增殖至关重要的Wnt蛋白。
尽管有关如何从小鼠肠道中分离间充质的方案是可用的，但尚不清楚这些程序是否允许有效分离端细胞。有效地分离端细胞需要特殊的方案调整，这将允许解离端细胞和邻近细胞之间的强细胞 - 细胞接触，而不会影响其活力。在这里，调整了可用的肠道间充质分离方案，以支持成功分离和培养含有相对高产量的活单细胞端细胞的间充质。
获得的单细胞悬液可以通过多种技术进行分析，例如免疫染色、细胞分选、成像和 mRNA 实验。该方案产生具有足够保守的端细胞抗原和功能特性的间充质，可用于多种应用。例如，它们可用于与小鼠或人源性类器官共培养，以支持类器官生长，无需补充生长因子，以更好地反映原始组织中的情况。

上述肠道间充质分离方案是从Wu等人12 和Shoshkes-Carmel等人8中描述的方案修改而来的。Wu等人描述的方案是针对结肠的，Shoshkes-Carmel等人描述的方案是针对小肠的，因此这两种方案之间的酶组合，工作浓度和孵育时间的消化条件不同。在这里，所描述的方案已成功用于分离和培养肠间充质细胞，包括端细胞。简而言之，我们使用FOXL1-Cre：Rosa-mTmG小鼠模型8解剖了从十二指肠到回肠的小肠，其中端细胞用膜-GFP（绿色）标记，而其他间充质细胞用膜-tdTomato（红色）标记。我们使用消化酶解离组织并将间充质接种在6孔板中。解离后，端细胞失去其细胞特征，显示出圆形细胞形态（图2A），这反映在第1天与随后几天相比GFP + 细胞的定量不足（图2F）。几天后，端细胞表现出具有短细胞过程的小拉伸细胞形态（图2B，C）。然而，接种后7-10天，端细胞恢复其细胞特征，显示出具有长细胞质过程的大拉伸细胞形态（图2D，E），并准备用于与类器官共培养并支持其生长。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> 图2：从FOXL1Cre分离的培养间充质：Rosa-mTmG小鼠肠道。FOXL1+端细胞用GFP标记，而其他间充质细胞是tdTomato+。（A-E）使用当前方案分离的培养间充质的代表性图像，接种在 6 孔板中，并在培养 1 （A）、4 （B，C） 和 7 （D，E） 天后成像。比例尺 = 100 μm。 （F） 培养第 1、4 和 7 天每个视野的 GFP/tdTomato 细胞比率（百分比）的定量。缩写：FOXL1 = 叉头盒 L1 蛋白;GFP = 绿色荧光蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
为了评估该分离方案并揭示细胞组成，我们通过流式细胞术分析了获得的细胞悬液（图3）。总体而言，基于DAPI染色，69%的分离细胞是活的（图3 III）;在活细胞中，60.9%代表上皮污染以及免疫和内皮细胞（CD326+，CD45+和CD31 +;图3端细胞部分（GFP+）分别分散在100k和70k FSC和SSC以上（图3 VI），并且几乎占门控间充质（活CD45-，CD326-，CD31-）的10%（图3 V）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> 图 3：流式细胞术门控策略，用于从分离的成年小鼠肠道间充质中分选端细胞。 （I）排除低水平侧向散射事件。（II）按SSC高度按SSC面积对单细胞进行门控。（III）将DAPI+事件门控以从分类中排除死细胞。（IV）将DAPI-CD45 + / CD326 + / CD31 +事件分别门控以排除免疫细胞，上皮细胞和内皮细胞。（五）GFP+端细胞占DAPI-CD45-/CD326-/CD31-细胞的10.3%。（VI）反向门控分析揭示了GFP+端细胞在FSC-A/SSC-A图中的坐标。缩写：SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-H = 侧散射峰高度;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;GFP = 绿色荧光蛋白;APC = 别藻蓝蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
同时，我们还从野生型（WT）C57Bl6小鼠肠道中分离出间充质，其中使用先前在从FOXL1Cre：Rosa-mTmG小鼠模型中分离的间充质上分析的表面标志物的组合来评估端细胞部分，其中端细胞部分被GFP标记。我们发现端细胞的亚群可以通过CD201和鬼臼拉宁（GP38）的阳性染色来定义（图4）。此外，在分离和培养后1天使用这些标记物进行免疫染色证实，尽管细胞尚未表现出其细胞特征，但它们获得了这些分子标记物的表达，在70%-80%的GFP + 端细胞中显示染色（图5）。
由表面标记物定义的端细胞分数与使用FOXL1驱动的报告小鼠获得的端细胞分数不同;端细胞具有高度异质性，包含多个亚群。有必要将表面标志物与FOXL1标记相结合以进行端细胞定义。在FOXL1Cre：Rosa-mTmG小鼠的小肠中，60%-70%的GFP+ 细胞为CD201阳性，65%-80%为GP38阳性。使用表面标志物时，重要的是要注意抗体的不适当储存和重复冻融循环会降低结合效率。此外，酶消化可能会破坏表面标志物的表达。我们观察到CD138（一种在间充质细胞上表达的跨膜蛋白聚糖）的表达被破坏并随着解离而大大降低。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> 图 4：使用当前方案从 FOXL1Cre 分离的单细胞间充质悬浮液的 FACS 分析：Rosa-mTmG 小鼠小肠。对（I-II）单细胞、（III）DAPI-、（IV-VI）Lin-（CD45-、CD326-、CD31-）GFP+细胞的FACS分析显示，（VII）65.3%的GFP+和31.2%的番茄+对GP38呈阳性，而（VIII）60.5%的GFP+和22.6%的番茄+对CD201呈阳性。缩写：SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-H = 侧散射峰高度;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;GFP = 绿色荧光蛋白;APC = 别藻蓝蛋白;PE = 藻红蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> 图 5：第一天培养的间充质，固定并染色以检测间充质标志物。 （A-D）为GP38染色的培养间充质的代表性图像。（F-I）CD201染色培养间充质的代表性图像。比例尺 = 100 μm。 （E） 番茄+ GP38 +和番茄+ CD201 +总番茄+双阳性的定量。（J）GFP+ GP38+和GFP + CD201 +与总GFP +的双阳性定量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>解决方案 A：</td>
			<td colspan="4">HBSS补充有2%FBS，1 mM DL-二硫苏糖醇（DTT），2 mM EDTA（pH 8.0）。</td>
		</tr><tr><td>补充培养基 1640 （CM1640）：</td>
			<td colspan="4">补充有 10% FBS、笔/链球菌（100 单位青霉素/mL，100 μg 链霉素/mL）的 RPMI 1640 培养基。</td>
		</tr><tr><td>消化液：</td>
			<td colspan="4">100 U/mL VIII 型胶原酶，75 mg/mL 脱氧核糖核酸酶 I 在 4 mL 预热的 CM1640 中。注意：在消化程序开始之前添加胶原酶和脱氧核糖核酸酶I。</td>
		</tr><tr><td>培养基：</td>
			<td colspan="4">DMEM-F12 培养基补充有 10 μg/mL 庆大霉素、10 mM HEPES、谷氨酰胺、笔/链球菌（100 单位青霉素/mL，100 μg 链霉素/mL）。</td>
		</tr><tr><td>FACS 缓冲液：</td>
			<td colspan="4">PBS补充了5%FBS和1mM EDTA。</td>
		</tr></tbody></table>表1：协议中使用的所有溶液的组成。 
补充表S1：此处列出了当前协议与两种参考协议之间的主要区别。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

在这里，我们提出了一种分离小鼠肠间充质（包括端细胞）的方案。这些可用于多种应用，例如与小鼠或人源性类器官共培养，以支持生长并更好地反映原始组织中的情况。

小鼠肠间充质分离导致端细胞高产量

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

我们分离肠道间充质的方案导致端细胞的高产量。该方法为研究体内平衡和疾病中涉及端细胞的细胞 - 细胞相互作用提供了一个初始平台。端细胞是对可用的组织解离方案敏感的独特细胞。因此，该技术的主要优点是分离间充质，包括富集的活端细胞。间充质，包括端细胞，可以作为有组织的离体生长所需的信号分子和生长因子的来源。首先，在含有冷无菌PBS的培养皿中清洗与安乐死小鼠分离的肠道。将肠放入培养皿中。并使用球尖剪刀，纵向打开肠管，冲洗粪便。将肠道转移到含有新鲜冷PBS的新盘中。再次清洗肠道后，将小肠切成一厘米长的段，然后将它们转移到装有八毫升PBS的15毫升锥形管中。以每秒一个或两个周期手动摇动试管一分钟。将溶液倒入培养皿中。并使用镊子将段转移到装有20毫升溶液A的50毫升锥形管中，将管置于37摄氏度的轨道振荡器培养箱中20分钟。孵育后，用手以每秒四到五个周期剧烈摇动试管一分钟以解离上皮。再次重复此步骤。如前所述切割和洗涤碎片后，将它们转移到装有10毫升无菌PBS的新50毫升管中，并以每秒一个或两个循环的速度倒置管一分钟。将溶液倒入培养皿中。将段转移到装有10毫升无菌PBS的新15毫升管中，并以每秒一到两个循环的速度轻轻上下倾斜两分钟。在生物安全柜下，用镊子将切片放在无菌实验室湿巾上以干燥它们。干燥后，将段进一步切成块。使用镊子将切好的碎片转移到每孔装有四毫升预热消化溶液的六孔板中。将板在 37 摄氏度下孵育 50 分钟，每 20 分钟手动轻轻摇动一次板。然后，使用巴斯德移液管将碎片转移到装有 4 毫升 DMEM 的 15 毫升锥形管中。以每秒四到五个周期手动摇动试管一分钟以获得单细胞悬液。通过 100 微米过滤器将悬浮液过滤到 50 毫升锥形管中。将滤液在 700 克下在 4 摄氏度下离心五分钟。通过抽吸丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升2%FBS / PBS中。将悬浮液在700g下再次离心5分钟后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于12毫升培养基中。最后，将细胞悬液接种在六孔板中。间充质解离后，端细胞失去其细胞特征，呈现圆形细胞形态，并且与随后几天相比，第一天反映的GFP阳性细胞数量较少。几天后，端细胞表现出小的、拉伸的细胞形态，细胞过程短。接种7至10天后，端细胞恢复其细胞特征，显示出具有长细胞质过程的大而拉伸的细胞形态。流式细胞术揭示细胞组成。总体而言，基于DAPI染色，69%的分离细胞是活的。其中，60.9%代表上皮污染以及免疫和内皮细胞。端细胞分数分别分散在100k和70k FSC和SSC以上，几乎占门控间充质的10%。FACS分析显示，端细胞亚群可以通过CD201和GP38阳性染色来定义。使用这些标记物对一天培养的间充质进行免疫染色，尽管细胞没有表现出其细胞特征，但这些分子标记物的表达。该过程产生可存活的基质细胞单细胞悬浮液，其不仅可用于2D培养，还可用于任何其他应用，例如与类器官进行3D共培养或生物打印。

Research

JoVE Journal

Medicine

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小鼠胰岛的分离和包膜下肾移植的方法

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

科研

医学

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