Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation israélienne des sciences (subvention personnelle MSC) et le programme conjoint entre la Fondation israélienne des sciences et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine.

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université hébraïque de Jérusalem.
1. Préparation des réactifs et des tampons
<ol><li>Préchauffer un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Préparez toutes les solutions du tableau 1.</li>
</ol>2. Isolement du mésenchyme intestinal
<ol><li>Euthanasier la souris par inhalation de CO2 , immédiatement suivie d’une luxation cervicale.</li>
	<li>Placez la souris en décubitus dorsal et vaporisez l’abdomen avec 70% d’EtOH. Soulevez la peau abdominale et coupez longitudinalement le long de la ligne médiane pour exposer la cavité péritonéale (voir Figure 1 I,II).</li>
	<li>Localisez l’estomac, coupez de l’œsophage et retirez lentement l’intestin de la cavité péritonéale. Nettoyez l’excès de graisse et de tissu conjonctif à l’aide de forceps. Extrayez l’intestin grêle du duodénum à environ 0,5 cm du caecum (Figure 1 III,IV).</li>
	<li>Lavez l’intestin dans une boîte de Petri contenant du PBS stérile froid. À l’aide de ciseaux à bille, ouvrir le tube intestinal longitudinalement et laver les matières fécales (figure 1 V). Transférer l’intestin dans un nouveau plat contenant du PBS froid frais et laver à nouveau.</li>
	<li>Couper l’intestin grêle en segments de 1 cm de long et transférer dans un tube conique de 15 mL rempli de 8 mL de PBS. Agiter le tube manuellement à un ou deux cycles/s pendant 1 min.</li>
	<li>Transférer les segments à l’aide d’une pince dans un tube conique de 50 mL rempli de 20 mL de solution A fraîchement préparée (voir le tableau 1). Placer les tubes dans un incubateur à agitateur orbital à 37 °C pendant 20 min. Après l’incubation, agiter vigoureusement le tube à la main à quatre ou cinq cycles/s pendant 1 min pour dissocier l’épithélium.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.6 une fois.</li>
	<li>Transférer les segments dans un nouveau tube de 50 mL rempli de 10 mL de PBS stérile et retourner le tube à un ou deux cycles/s pendant 1 min.</li>
	<li>Transférer les segments dans un nouveau tube de 15 mL rempli de 10 mL de PBS stérile et incliner doucement de haut en bas à un ou deux cycles/s pendant 2 min.</li>
	<li>Sous une enceinte de biosécurité, utilisez des pinces pour placer les segments sur une lingette de laboratoire stérile afin de les sécher. Une fois séchés, coupez les segments en morceaux de 0,5 cm.</li>
	<li>Transférer les petits segments à l’aide d’une pince dans une plaque de 6 puits remplie de 4 mL de solution de digestion préchauffée par puits. Incuber à 37 °C pendant 50 min. Secouez doucement l’assiette à la main toutes les 20 minutes.</li>
	<li>Transférer les segments à l’aide d’une pipette Pasteur dans un tube conique de 15 mL rempli de 4 mL de DMEM. Secouez le tube manuellement à quatre ou cinq cycles/s pendant 1 min pour obtenir une suspension unicellulaire.</li>
	<li>Filtrer la suspension à travers une crépine de 100 μm dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger le filtrat à 700 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant par aspiration et remettre en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de FBS/PBS à 2 %. Centrifuger la suspension à 700 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant par aspiration, remettre en suspension la pastille cellulaire avec 12 mL de milieu de culture et ensemencer 1 mL par puits sur deux plaques de 6 puits. Le lendemain, lavez et aspirez toutes les cellules mourantes et remplacez le milieu usé par un milieu frais. NOTE: Pour un entretien optimal de la culture, il est recommandé de changer le milieu tous les 2 jours. Selon la souche de souris, le bagage génétique et l’âge, 4 jours à 2 semaines sont nécessaires pour que le mésenchyme soit prêt pour des expériences de co-culture. Pour d’autres expériences de co-culture, le mésenchyme devrait atteindre la confluence, affichant une morphologie cellulaire plate et complètement étirée, comme le montre la figure 2. En général, les cellules à morphologie ronde ne sont ni viables ni fonctionnelles.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> Figure 1 : Dissection de souris. (I) Placer la souris en décubitus dorsal et pulvériser sur l’abdomen avec 70% d’EtOH. Soulevez la peau abdominale. (II) Ouvrir la cavité péritonéale longitudinalement le long de la ligne médiane. (III) Tout en tirant doucement l’estomac, sectionner l’œsophage. (IV) Pincez l’estomac et retirez lentement l’intestin. (V) Insérez l’extrémité des ciseaux à bout de bille dans la lumière et ouvrez le tube intestinal longitudinalement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Resuspension du mésenchyme pour le passage ou la co-culture
<ol><li>Resuspendre le mésenchyme avec 2 mL de trypsine-0,5 mM d’EDTA/puits à 0,25 % dans une plaque à 6 puits. Incuber pendant 5 min à 37 °C. Après l’incubation, si plusieurs cellules n’ont pas déjà commencé à se détacher de la boîte, incuber pendant 2 minutes supplémentaires.</li>
	<li>À l’aide d’un grattoir de cellule, grattez doucement la surface du puits. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 2 mL de DMEM-F12/puits et pipeter doucement la suspension de haut en bas. REMARQUE: Il est important de ne pas trop remplir le tube avec plus de 50% du volume du tube. Il est donc recommandé d’utiliser un tube conique de 15 mL rempli de 8 mL de suspension pour deux puits.</li>
	<li>Comptez les cellules. REMARQUE: Un puits entièrement confluent donne entre 2 × 106 cellules et 2,5 × 106 cellules.</li>
	<li>Diluer la suspension cellulaire pour obtenir une densité d’ensemencement de 3-5 × 105 cellules/mL. Centrifuger pendant 5 min à 500 × g à 4 °C et éliminer le surnageant par aspiration soigneuse. REMARQUE: Il est important d’éliminer autant de liquide que possible.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture et une plaque préchauffés.</li>
</ol>4. Analyse par cytométrie de flux pour la purification des ténocytes
<ol><li>Obtenir la pastille de cellules mésenchymateuses (étape 2.14). Resuspendre la pastille de cellule dans 1 mL de tampon FACS et filtrer à travers une crépine de 40 μm.</li>
	<li>Incuber la suspension cellulaire avec des anticorps CD326 (1:100), CD45 (1:400) et CD31 (1:250) conjugués à l’allophycocyanine (APC) dans 400 μL de tampon FACS pendant 15 minutes à température ambiante pour exclure les cellules épithéliales, immunitaires et endothéliales, respectivement, du type.</li>
	<li>Lavez les cellules en ajoutant 1 ml de tampon FACS et faites tourner vers le bas à 700 × g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendre dans 400 μL de tampon FACS et ajouter le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 5 mg/mL, 1:1 000) pour les analyses de cytométrie en flux. Ouvrir les cellules individuelles en fonction de la hauteur SSC par zone SSC. Fermez les cellules vivantes DAPI et sortez CD45+/CD31+/CD326+ pour trier les télocytes GFP+, comme illustré à la figure 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Ici, nous avons développé un protocole pour isoler le mésenchyme de l’intestin grêle de souris en utilisant le modèle murin FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, qui permet aux chercheurs de distinguer les télocytes des autres cellules mésenchymateuses. Il y a quelques étapes critiques à suivre dans ce protocole. Tout d’abord, il est important de secouer vigoureusement le tube à quatre ou cinq cycles/s, pour éliminer la majorité des cellules épithéliales pendant l’isolement du mésenchyme. Le temps d’incubation pour la digestion enzymatique doit être optimisé en fonction de l’efficacité de la digestion. Pendant l’incubation, les plaques doivent être doucement agitées horizontalement pendant quelques secondes toutes les 20 minutes. Une fois que le tissu devient filamenteux, l’incubation doit être arrêtée en passant à l’étape du protocole 2.12. L’exposition du tissu pendant de longues périodes de digestion peut entraîner un faible taux de viabilité cellulaire et un faible rendement. Après la digestion enzymatique, le tube doit être agité mécaniquement pour libérer plus de cellules individuelles en suspension; Idéalement, la solution devrait avoir l’air trouble et aucun fragment de tissu ne devrait être visible. Si ce n’est pas le cas, prolongez la digestion enzymatique à 60 min.
Maintenir des conditions stériles et éviter une contamination bactérienne potentielle est l’une des étapes critiques lorsque l’on travaille avec une culture tissulaire primaire. Des outils de dissection, des réactifs et des tampons stériles doivent être utilisés; Les gants doivent être changés et la zone de travail doit être nettoyée lorsque le travail avec des animaux est terminé. Une fois la suspension cellulaire obtenue, les travaux doivent être effectués sous une hotte biologique laminaire. Après le placage, les cellules doivent être incubées pendant la nuit sans perturbations, car cela peut affecter l’observance. De plus, il est important de remplacer le milieu de culture un jour après l’ensemencement, car les cellules non adhérentes peuvent affecter la viabilité de la culture.
Les marqueurs de surface utilisés dans ce protocole ont fortement réagi avec leurs épitopes; cependant, il est possible que la digestion enzymatique affecte la réactivité de liaison et, par conséquent, les résultats de l’analyse FACS. Une autre limitation de ce protocole est la sous-représentation de la couche musculaire. Pour améliorer l’efficacité de l’isolation cellulaire de la couche musculaire, nous recommandons la séparation mécanique du muscle des couches muqueuses et la digestion enzymatique séparée pour chacune des couches. Pour dissocier l’épithélium du stroma, une séparation mécanique ou des agents chélatants (EDTA ou DTT) peuvent être utilisés; Cependant, la digestion enzymatique pour obtenir des cellules uniques a été optimisée dans ce protocole.
L’isolement du mésenchyme intestinal a déjà été décrit8 ; gratter les villosités avec une lamelle de couverture entraînerait la perte d’une partie du mésenchyme le long des villosités, en particulier des cellules mésenchymateuses de l’extrémité des villosités telles que les télocytes de l’extrémité des villosités Lgr5+ 13. Dans ce protocole, nous utilisons la collagénase de type VIII au lieu de la dispase II et de la trypsine en combinaison avec la DNase I, car la collagénase libère plus efficacement les cellules mésenchymateuses de la matrice. Bien qu’il prolonge le temps de traitement (>90 min contre 35 min), les deux protocoles ont donné des taux de viabilité cellulaire similaires; Le protocole actuel a amélioré le rendement des cellules mésenchymateuses en général, et plus particulièrement de la fraction téloucytaire. Le protocole actuel a produit environ 10% de télocytes GFP+, confirmés à la fois par visualisation et par analyse FACS, tandis que le protocole précédent a produit 2% de télocytes GFP+. Les principales différences entre le protocole actuel et les deux protocoles de référence sont énumérées dans le tableau supplémentaire S1.
L’identification des cellules FOXL1+GFP+ en tant que télocytes sous-épithéliaux est basée sur des études in vivo . La nécessité de développer et de modifier les protocoles d’isolement des mésenchymes disponibles pour produire des rendements plus élevés de télocytes, et la connaissance de la façon d’y parvenir était basée sur notre compréhension de la structure et de la fonction des télocytes FOXL1+ in vivo, en tant que grandes cellules avec de longues projections cellulaires étroitement attachées aux cellules épithéliales.
Fait intéressant, les télocytes GFP+ ex vivo présentent des caractéristiques cellulaires similaires à leurs caractéristiques in vivo dans l’intestin et sont donc suggérés pour servir de support idéal pour la croissance organoïde. Bien que ce protocole traite principalement de l’isolement des ténocytes de l’intestin grêle, un protocole similaire avec des modifications mineures peut être utilisé et facilement appliqué pour les cellules mésenchymateuses du côlon, telles que les cellules stromales intestinales régulées MAP3K2 (MRISC) récemment décrites récemment.
Une fois que les cellules mésenchymateuses se sont étirées et ont atteint la confluence, elles peuvent être utilisées pour plusieurs applications supplémentaires, telles que la co-culture 3D avec des organoïdes dérivés de souris ou d’humains, en utilisant Matrigel sans facteur de croissance. Le mésenchyme forme généralement un réseau soutenant pleinement la formation et la croissance organoïdes sans supplémentation en facteur de croissance exogène. Le stroma intestinal a des caractéristiques 3D intrinsèques qui peuvent fournir à l’épithélium un soutien mécanique14. Par conséquent, ce protocole peut également être utilisé pour isoler le mésenchyme à intégrer dans un échafaudage bio-imprimé 3D et utilisé pour d’autres expériences de xénogreffe.

L’intestin grêle et le côlon sont des tissus hautement régénérateurs en raison de la présence de cellules souches, qui prolifèrent et alimentent la régénération1. Le mésenchyme entourant l’épithélium apporte un soutien structurel et fonctionnel en sécrétant des protéines de la matrice extracellulaire et des molécules de signalisation2, qui modulent la réponse des cellules épithéliales. Les télocytes sont de grandes cellules mésenchymateuses, principalement décrites jusqu’à présent par microscopie électronique comme des cellules avec de longs processus cytoplasmiques appelés télopodes, qui se chevauchent pour créer un réseau labyrinthique 3,4,5,6,7. Récemment, les télocytes intestinaux exprimant le facteur de transcription FOXL1 sont apparus comme un composant important de niche des cellules souches fournissant des protéines Wnt, qui sont cruciales pour la fonction des cellules souches et progénitrices. Les télocytes intestinaux expriment des niveaux élevés de protéines clés de la voie de signalisation telles que Wnt, Bmp, Tgfb et Shh, ainsi que de nombreux facteurs de croissance8.
Étant donné que les télocytes sont un composant essentiel de niche des cellules souches in vivo, le développement de protocoles pour les isoler et les cultiver ex vivo permettra leur utilisation comme source de molécules de signalisation et de facteurs de croissance, afin de soutenir la croissance et la différenciation ex vivo. En utilisant des protocoles bien établis, les cryptes épithéliales du côlon ou de l’intestin peuvent être isolées et former des structures 3D connues sous le nom d’organoïdes 9,10,11. Les organoïdes tridimensionnels représentent un outil puissant pour étudier à la fois la physiologie et la pathologie de l’épithélium intestinal ex vivo. Dans un système ex vivo, les organoïdes reposent sur la supplémentation exogène de facteurs pour la survie et la croissance10. Le mésenchyme isolé peut être cultivé avec des organoïdes dérivés de souris et d’humains et utilisé comme source de facteurs de croissance, au lieu d’une supplémentation exogène, pour mieux refléter la situation dans le tissu d’origine. L’étude des télocytes ex vivo présente de nombreux avantages pour étudier plus en détail les comportements cellulaires normaux ou pathologiques, les mécanismes de l’homéostasie tissulaire et les interactions cellule-cellule.
Bien que des protocoles décrivant comment isoler le mésenchyme de l’intestin de souris soient disponibles, il n’est pas clair si ces procédures entraînent l’isolement efficace des télocytes. L’isolement réussi des télocytes nécessite des ajustements de protocole spéciaux qui permettraient la dissociation du fort contact cellule-cellule entre les télocytes et les cellules voisines, sans affecter leur viabilité. Pour surmonter ces limitations, cet article présente un protocole modifié qui produit systématiquement une suspension unicellulaire hautement viable contenant une quantité relativement élevée de télocytes avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées. Ces télocytes peuvent être utilisés pour plusieurs applications, y compris la co-culture avec des organoïdes dérivés de souris ou d’humains, pour soutenir la croissance sans supplémentation en facteur de croissance. Cela reflète mieux la situation dans le tissu d’origine.
Nous avons utilisé le modèle de souris FOXL1-Cre: Rosa-mTmG modèle 8, dans lequel les télocytes sont marqués avec une version membranaire de la protéine fluorescente verte (GFP) en vert, ce qui permet à l’investigateurde suivre les télocytes dans leur intégralité; Toutes les autres cellules mésenchymateuses sont marquées avec une tdTomate liée à la membrane en rouge. Le protocole actuel a été modifié à partir d’un protocole isolant le mésenchyme intestinal12 afin d’améliorer le rendement et la viabilité des ténocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

L’intestin grêle murin, ou mésenchyme du côlon, est très hétérogène, contenant des types de cellules distincts, y compris l’endothélium sanguin et lymphatique, les nerfs, les fibroblastes, les myofibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires et le type cellulaire récemment identifié, les télocytes. Les télocytes sont des cellules mésenchymateuses uniques avec de longs processus cytoplasmiques, atteignant une distance de dizaines à des centaines de microns du corps cellulaire. Les télocytes sont récemment apparus comme un composant important de niche des cellules souches intestinales, fournissant des protéines Wnt essentielles à la prolifération des cellules souches et progénitrices.
Bien que des protocoles sur la façon d’isoler le mésenchyme de l’intestin de souris soient disponibles, il n’est pas clair si ces procédures permettent l’isolement efficace des télocytes. L’isolement efficace des télocytes nécessite des ajustements de protocole spéciaux qui permettraient la dissociation du fort contact cellule-cellule entre les télocytes et les cellules voisines sans affecter leur viabilité. Ici, les protocoles d’isolement des mésenchymes intestinaux disponibles ont été ajustés pour soutenir l’isolement et la culture réussis de mésenchymes contenant un rendement relativement élevé de télocytes unicellulaires viables.
La suspension unicellulaire obtenue peut être analysée par plusieurs techniques, telles que l’immunomarquage, le tri cellulaire, l’imagerie et les expériences d’ARNm. Ce protocole produit des mésenchymes avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées des télocytes, et peut être utilisé pour plusieurs applications. Par exemple, ils peuvent être utilisés pour la co-culture avec des organoïdes dérivés de souris ou d’humains pour soutenir la croissance organoïde sans supplémentation en facteur de croissance, afin de mieux refléter la situation dans le tissu d’origine.

Le protocole d’isolement des mésenchymes intestinaux ci-dessus a été modifié par rapport aux protocoles décrits dans Wu et coll.12 et Shoshkes-Carmel et coll.8. Le protocole décrit dans Wu et al. est pour le côlon, et celui de Shoshkes-Carmel et al. est pour l’intestin grêle, donc les conditions de digestion sont différentes dans la combinaison enzymatique, la concentration de travail et le temps d’incubation entre ces deux protocoles. Ici, le protocole décrit a été utilisé avec succès pour isoler et cultiver des cellules mésenchymateuses intestinales, y compris des télocytes. Brièvement, nous avons disséqué l’intestin grêle du duodénum à l’iléon à l’aide d’une souris FOXL1-Cre: Rosa-mTmG modèle8, dans laquelle les télocytes ont été marqués avec la membrane-GFP (vert), tandis que d’autres cellules mésenchymateuses ont été marquées avec la membrane-tdTomate (rouge). Nous avons dissocié le tissu à l’aide d’enzymes de digestion et ensemencé le mésenchyme dans une plaque à 6 puits. Suite à la dissociation, les télocytes perdent leurs caractéristiques cellulaires, montrant une morphologie cellulaire ronde (Figure 2A) qui se traduit par la sous-quantification des cellules GFP+ au jour 1 par rapport aux jours suivants (Figure 2F). Après quelques jours, les télocytes présentent une morphologie cellulaire étirée avec des processus cellulaires courts (Figure 2B,C). Cependant, 7 à 10 jours après l’ensemencement, les télocytes retrouvent leurs caractéristiques cellulaires, montrant une morphologie de grandes cellules étirées avec de longs processus cytoplasmiques (Figure 2D,E), et sont prêts à être utilisés en co-culture avec des organoïdes et à soutenir leur croissance.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> Figure 2 : Mésenchyme cultivé isolé de FOXL1Cre : intestin de souris Rosa-mTmG. Les télocytes FOXL1+ sont marqués avec GFP, tandis que d’autres cellules mésenchymateuses sont tdTomato+. (A-E) Images représentatives de mésenchymes cultivés isolés à l’aide du protocole actuel, plaqués dans une plaque à 6 puits et imagés après 1 (A), 4 (B, C) et 7 (D, E) jours de culture. Barres d’échelle = 100 μm. (F) Quantification du rapport GFP/tdTomato cell par champ de vision (pourcentages) aux jours 1, 4 et 7 de la culture. Abréviations : FOXL1 = protéine L1 de la boîte de fourche; GFP = protéine fluorescente verte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour évaluer ce protocole d’isolement et révéler la composition cellulaire, nous avons analysé la suspension cellulaire obtenue par cytométrie en flux (Figure 3). Dans l’ensemble, 69 % des cellules isolées étaient viables d’après la coloration DAPI (figure 3 III); parmi les cellules vivantes, 60,9 % représentaient une contamination épithéliale et des cellules immunitaires et endothéliales (CD326+, CD45+ et CD31+; Graphique 3 IV). La fraction ténocytaire (GFP+) diffusée au-dessus de 100k et 70k FSC et SSC, respectivement (Figure 3 VI), et représentait près de 10% du mésenchyme fermé (CD45-, CD326-, CD31-) vivant (Figure 3 V).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> Figure 3 : Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour le tri des télocytes du mésenchyme intestinal isolé de souris adultes. (I) Les événements de diffusion latérale de faible intensité ont été exclus. (II) Les cellules individuelles ont été fermées en fonction de la hauteur de la SSC par zone de SSC. (III) Les événements DAPI+ ont été exclus pour exclure les cellules mortes du tri. (IV) Les événements DAPI-CD45+/CD326+/CD31+ ont été exclus pour exclure les cellules immunitaires, épithéliales et endothéliales, respectivement. (V) Les télocytes GFP+ représentaient 10,3 % des cellules DAPI- CD45-/CD326-/CD31-. (VI) L’analyse rétrospective a révélé les coordonnées des télocytes GFP+ dans un graphique FSC-A/SSC-A. Abréviations : SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; SSC-H = hauteur du pic de diffusion latérale; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; GFP = protéine fluorescente verte; APC = allophycocyanine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
En parallèle, nous avons également isolé le mésenchyme d’un intestin de souris C57Bl6 de type sauvage (WT), dans lequel la fraction ténoticytaire a été évaluée en utilisant une combinaison de marqueurs de surface précédemment analysés sur un mésenchyme isolé à partir d’un modèle murin FOXL1Cre: Rosa-mTmG, dans lequel la fraction ténocytaire était marquée GFP. Nous avons constaté qu’un sous-ensemble des télocytes peut être défini par une coloration positive à CD201 et podoplanine (GP38) (Figure 4). De plus, l’utilisation de ces marqueurs dans l’immunomarquage 1 jour après l’isolement et la culture a confirmé que, bien que les cellules ne présentaient pas encore leurs caractéristiques cellulaires, elles ont obtenu l’expression de ces marqueurs moléculaires, montrant une coloration dans 70%-80% des télocytes GFP+ (Figure 5).
La fraction ténoticytaire définie par les marqueurs de surface n’est pas identique à celle obtenue à l’aide de la souris rapporteure pilotée par FOXL1; Le téloticytaire est très hétérogène et contient plusieurs sous-ensembles. Il est nécessaire de combiner le marqueur de surface avec le marquage FOXL1 pour la définition des télomés. Dans l’intestin grêle de la souris FOXL1Cre: Rosa-mTmG, 60% à 70% des cellules GFP+ sont CD201 positives et 65% à 80% sont positives pour GP38. Lors de l’utilisation de marqueurs de surface, il est important de noter que le stockage inapproprié et les cycles répétitifs de congélation-décongélation des anticorps diminuent l’efficacité de liaison. De plus, la digestion enzymatique peut perturber l’expression des marqueurs de surface. Nous avons observé que l’expression de CD138, un protéoglycane transmembranaire exprimé sur les cellules mésenchymateuses, était perturbée et fortement diminuée avec la dissociation.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse FACS de suspension de mésenchyme unicellulaire isolée de FOXL1Cre : Rosa-mTmG souris intestin grêle à l’aide du protocole actuel. Analyse FACS sur des cellules individuelles (I-II), (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+, montrant que (VII) 65,3% des GFP+ et 31,2% de la Tomato+ sont positifs pour GP38, tandis que (VIII) 60,5% des GFP+ et 22,6% des Tomato+ sont positifs pour CD201. Abréviations : SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; SSC-H = hauteur du pic de diffusion latérale; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; GFP = protéine fluorescente verte; APC = allophycocyanine; PE = phycoérythrine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> Figure 5 : Mésenchyme cultivé le premier jour, fixé et coloré pour les marqueurs mésenchymateux. (A-D) Images représentatives de mésenchymes cultivés colorés pour GP38. (F-I) Images représentatives de mésenchymes cultivés colorés pour CD201. Barres d’échelle = 100 μm. (E) Quantification de Tomato+ GP38+ et Tomato+ CD201+ double-positif à partir de Tomato+ total. (J) Quantification des GFP+ GP38+ et GFP+ CD201+ doublement positifs à partir du total GFP+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solution A :</td>
			<td colspan="4">HBSS complété par 2% FBS, 1 mM DL-dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0).</td>
		</tr><tr><td>Complément médium 1640 (CM1640) :</td>
			<td colspan="4">RPMI 1640 milieu complété par 10% FBS, Pen/Strep (100 unités de pénicilline/mL, 100 μg de streptomycine/mL).</td>
		</tr><tr><td>Solution de digestion:</td>
			<td colspan="4">100 U/mL de collagénase de type VIII, 75 mg/mL de DNase I dans 4 mL de CM1640 préchauffée. Remarque: Ajoutez la collagénase et la DNase I juste avant le début de la procédure de digestion.</td>
		</tr><tr><td>Milieux de culture :</td>
			<td colspan="4">Milieu DMEM-F12 supplémenté avec 10 μg/mL de gentamicine, 10 mM HEPES, glutamine, Pen/Streptocoque (100 unités de pénicilline/mL, 100 μg de streptomycine/mL).</td>
		</tr><tr><td>Tampon FACS :</td>
			<td colspan="4">PBS complété avec 5% FBS et 1 mM EDTA.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition de toutes les solutions utilisées dans le protocole. 
Tableau supplémentaire S1 : Les principales différences entre le protocole actuel et les deux protocoles de référence sont énumérées ici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Ici, nous présentons un protocole pour isoler le mésenchyme intestinal murin, y compris les télocytes. Ceux-ci peuvent être utilisés pour plusieurs applications, telles que la co-culture avec des organoïdes de souris ou d’origine humaine, pour soutenir la croissance et mieux refléter la situation dans le tissu d’origine.

Isolement du mésenchyme intestinal murin entraînant un rendement élevé en télocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Notre protocole d’isolement du mésenchyme intestinal se traduit par un rendement élevé en télocytes. Cette méthode offre une plate-forme initiale pour étudier l’interaction cellule-cellule impliquant les télocytes dans l’homéostasie et la maladie. Les télocytes sont des cellules uniques sensibles aux protocoles de dissociation tissulaire disponibles.Par conséquent, le principal avantage de cette technique est l’isolement du mésenchyme, y compris les télocytes viables enrichis. Le mésenchyme, y compris le ténocyte, peut servir de source pour les molécules de signalisation et les facteurs de croissance nécessaires à une croissance organisée ex vivo. Pour commencer, lavez l’intestin, séparé d’une souris euthanasiée, dans une boîte de Petri contenant du PBS froid et stérile.Placez l’intestin dans une boîte de Pétri. Et à l’aide de ciseaux à bout de bille, ouvrez le tube intestinal longitudinalement et lavez les matières fécales. Transférer l’intestin dans un nouveau plat contenant du PBS frais et froid.Après avoir lavé l’intestin une fois de plus, coupez l’intestin grêle en segments d’un centimètre de long et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres rempli de huit millilitres de PBS. Secouez le tube manuellement à un ou deux cycles par seconde pendant une minute. Versez la solution dans une boîte de Pétri.Et à l’aide de forceps, transférez le segment dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 20 millilitres de Solution A.Placez les tubes dans un incubateur à agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, secouez vigoureusement le tube à la main à quatre ou cinq cycles par seconde pendant une minute pour dissocier l’épithélium. Répétez cette étape une fois de plus.Après avoir coupé et lavé les fragments comme démontré précédemment, transférez-les dans un nouveau tube de 50 millilitres rempli de 10 millilitres de PBS stérile et inversez le tube à un ou deux cycles par seconde pendant une minute. Verser la solution dans une boîte de Pétri. Transférez les segments dans un nouveau tube de 15 millilitres rempli de 10 millilitres de PBS stérile et inclinez-les doucement de haut en bas à un ou deux cycles par seconde pendant deux minutes.Sous une enceinte de biosécurité, utilisez des pinces pour placer les segments sur une lingette de laboratoire stérile afin de les sécher. Une fois séchés, coupez les segments en morceaux. Transférer les morceaux coupés à l’aide d’une pince dans une plaque de six puits remplie de quatre millilitres de solution de digestion préchauffée par puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes et agiter doucement la plaque manuellement toutes les 20 minutes. Ensuite, transférez les morceaux à l’aide d’une pipette Pasteur dans un tube conique de 15 millilitres rempli de quatre millilitres de DMEM. Secouez le tube manuellement à quatre ou cinq cycles par seconde pendant une minute pour obtenir une suspension à une seule cellule.Filtrez la suspension à travers une crépine de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le filtrat à 700 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant par aspiration et remettre en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de FBS / PBS à 2%.Après avoir centrifugé la suspension une fois de plus à 700 g pendant cinq minutes, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 12 millilitres de milieu de culture. Enfin, ensemencez la suspension cellulaire dans des plaques à six puits. Après la dissociation des mésenchymes, les télocytes perdent leurs caractéristiques cellulaires, montrant une morphologie cellulaire ronde, et réfléchissent moins de cellules GFP-positives le premier jour par rapport aux jours suivants.Quelques jours plus tard, les télocytes présentent une petite morphologie cellulaire étirée avec des processus cellulaires courts. Après sept à 10 jours d’ensemencement, les télocytes retrouvent leurs caractéristiques cellulaires, montrant une morphologie cellulaire grande et étirée avec de longs processus cytoplasmiques. La cytométrie en flux révèle la composition cellulaire.Dans l’ensemble, 69% des cellules isolées étaient viables sur la base de la coloration DAPI. Et parmi ceux-ci, 60,9% représentaient la contamination épithéliale et les cellules immunitaires et endothéliales. La fraction ténoticytaire dispersée au-dessus de 100k et 70k FSC et SSC, respectivement, et représentait près de 10% du mésenchyme fermé.L’analyse FACS a révélé que le sous-ensemble des télocytes peut être défini par une coloration positive à CD201 et GP38. L’immunomarquage de mésenchymes cultivés d’un jour à l’aide de ces marqueurs a montré l’expression de ces marqueurs moléculaires, bien que les cellules ne présentent pas leurs caractéristiques cellulaires. Cette procédure aboutit à une suspension unicellulaire viable de cellules stromales, qui peut être utilisée non seulement pour la culture 2D, mais pour toute autre application, telle que la co-culture 3D avec organoïdes ou la bio-impression.

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