Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Israel Science Foundation (MSC personal grant) e dal programma congiunto tra la Israel Science Foundation e la National Natural Science Foundation of China.

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università Ebraica di Gerusalemme.
1. Preparazione di reagenti e tamponi
<ol><li>Preriscaldare un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Preparare tutte le soluzioni nella Tabella 1.</li>
</ol>2. Isolamento del mesenchima intestinale
<ol><li>Eutanasia del topo per inalazione di CO2 , immediatamente seguita da lussazione cervicale.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione supina e spruzzare l'addome con il 70% di EtOH. Sollevare la pelle addominale e tagliare longitudinalmente lungo la linea mediana per esporre la cavità peritoneale (vedi Figura 1 I,II).</li>
	<li>Individuare lo stomaco, tagliare dall'esofago e estrarre lentamente l'intestino dalla cavità peritoneale. Pulire il grasso in eccesso e il tessuto connettivo usando una pinza. Asportare l'intestino tenue dal duodeno a circa 0,5 cm dal cieco (Figura 1 III,IV).</li>
	<li>Lavare l'intestino in una capsula di Petri contenente PBS sterile freddo. Usando le forbici a sfera, aprire longitudinalmente il tubo intestinale e lavare le feci (Figura 1 V). Trasferire l'intestino in un nuovo piatto contenente PBS fresco freddo e lavare nuovamente.</li>
	<li>Tagliare l'intestino tenue in segmenti lunghi 1 cm e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL riempito con 8 mL di PBS. Agitare manualmente il tubo a uno o due cicli/i per 1 minuto.</li>
	<li>Trasferire i segmenti con una pinza in un tubo conico da 50 mL riempito con 20 mL di soluzione A appena fatta (vedi prospetto 1). Posizionare i tubi in un incubatore orbitale a 37 °C per 20 minuti. Dopo l'incubazione, agitare vigorosamente il tubo a mano a quattro o cinque cicli / s per 1 minuto per dissociare l'epitelio.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.6 una volta.</li>
	<li>Trasferire i segmenti in un nuovo tubo da 50 mL riempito con 10 mL di PBS sterile e capovolgere il tubo a uno o due cicli/s per 1 minuto.</li>
	<li>Trasferire i segmenti in un nuovo tubo da 15 mL riempito con 10 mL di PBS sterile e inclinare delicatamente su e giù a uno o due cicli / s per 2 minuti.</li>
	<li>Sotto un armadio di biosicurezza, utilizzare una pinza per posizionare i segmenti su una salvietta sterile da laboratorio per asciugarli. Una volta asciugati, tagliare ulteriormente gli spicchi in pezzi da 0,5 cm.</li>
	<li>Trasferire i piccoli segmenti usando una pinza in una piastra a 6 pozzetti riempita con 4 ml di soluzione di digestione preriscaldata per pozzetto. Incubare a 37 °C per 50 min. Agitare delicatamente il piatto a mano ogni 20 minuti.</li>
	<li>Trasferire i segmenti utilizzando una pipetta Pasteur in un tubo conico da 15 mL riempito con 4 mL di DMEM. Agitare il tubo manualmente a quattro o cinque cicli/s per 1 minuto per ottenere una sospensione a cella singola.</li>
	<li>Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 μm in un tubo conico da 50 ml. Centrifugare il filtrato a 700 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di FBS/PBS al 2%. Centrifugare la sospensione a 700 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante mediante aspirazione, risospendere il pellet cellulare con 12 ml di terreno di coltura e seminare 1 ml per pozzetto su due piastre da 6 pozzetti. Il giorno seguente, lavare e aspirare eventuali cellule morenti e sostituire il mezzo esaurito con il mezzo fresco. NOTA: Per un mantenimento ottimale della coltura, si consiglia di cambiare il terreno ogni 2 giorni. A seconda del ceppo di topo, del background genetico e dell'età, sono necessari da 4 giorni a 2 settimane affinché il mesenchima sia pronto per gli esperimenti di co-coltura. Per ulteriori esperimenti di co-coltura, il mesenchima dovrebbe raggiungere la confluenza, mostrando una morfologia cellulare piatta e completamente allungata, come mostrato nella Figura 2. In generale, le cellule con morfologia rotonda non sono vitali o funzionali.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> Figura 1: Dissezione del topo. (I) Posizionare il topo in posizione supina e spruzzare l'addome con il 70% di EtOH. Sollevare la pelle addominale. (II) Aprire la cavità peritoneale longitudinalmente lungo la linea mediana. (III) Mentre si tira delicatamente lo stomaco, recidere l'esofago. (IV) Pizzicare lo stomaco ed estrarre lentamente l'intestino. (V) Inserire la punta delle forbici a sfera nel lume e aprire il tubo intestinale longitudinalmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
3. Risospensione del mesenchima per passatura o co-coltura
<ol><li>Risospendere il mesenchima con 2 ml di tripsina-0,5 mM EDTA/pozzetto allo 0,25% in una piastra a 6 pozzetti. Incubare per 5 min a 37 °C. Dopo l'incubazione, se diverse cellule non hanno già iniziato a staccarsi dal piatto, incubare per altri 2 minuti.</li>
	<li>Usando un raschietto cellulare, raschiare delicatamente la superficie del pozzo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 2 mL di DMEM-F12/pozzetto e pipettare delicatamente la sospensione su e giù. NOTA: È importante non riempire eccessivamente il tubo con più del 50% del volume del tubo. Si consiglia pertanto di utilizzare un tubo conico da 15 mL riempito con 8 mL di sospensione per ogni due pozzetti.</li>
	<li>Contare le celle. NOTA: Un pozzo completamente confluente produce tra 2 × 10 6 cellule e 2,5 × 106 cellule.</li>
	<li>Diluire la sospensione cellulare per ottenere una densità di semina di 3-5 × 105 cellule/ml. Centrifugare per 5 minuti a 500 × g a 4 °C ed eliminare il surnatante mediante attenta aspirazione. NOTA: è importante rimuovere quanto più liquido possibile.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura preriscaldato e piastra.</li>
</ol>4. Analisi citometrica a flusso per la purificazione dei telociti
<ol><li>Ottenere il pellet di cellule mesenchimali (punto 2.14). Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone FACS e filtrare attraverso un filtro da 40 μm.</li>
	<li>Incubare la sospensione cellulare con anticorpi CD326 (1:100), CD45 (1:400) e CD31 (1:250) coniugati con allofoccianina (APC) in 400 μL di tampone FACS per 15 minuti a temperatura ambiente per escludere rispettivamente le cellule epiteliali, immunitarie ed endoteliali dal tipo.</li>
	<li>Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone FACS e centrifugare a 700 × g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere in 400 μL di tampone FACS e aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 5 mg/mL, 1:1.000) per le analisi di citometria a flusso. Gate le singole celle in base all'altezza SSC per area SSC. Controllare le cellule DAPI- vive e eliminare CD45+/CD31+/CD326+ per ordinare i telociti GFP+, come mostrato nella Figura 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare il mesenchima dall'intestino tenue del topo utilizzando il modello murino FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, che consente ai ricercatori di distinguere i telocytes da altre cellule mesenchimali. Ci sono alcuni passaggi critici da seguire in questo protocollo. In primo luogo, è importante agitare vigorosamente il tubo a quattro o cinque cicli, per scartare la maggior parte delle cellule epiteliali durante l'isolamento del mesenchima. Il tempo di incubazione per la digestione enzimatica deve essere ottimizzato in base all'efficienza della digestione. Durante l'incubazione, le piastre devono essere agitate delicatamente orizzontalmente per alcuni secondi ogni 20 minuti. Una volta che il tessuto diventa simile a un filamento, l'incubazione deve essere interrotta procedendo al passaggio del protocollo 2.12. L'esposizione del tessuto per lunghi tempi di digestione può comportare un basso tasso di vitalità cellulare e resa. Dopo la digestione enzimatica, il tubo deve essere scosso meccanicamente per rilasciare più singole cellule in sospensione; Idealmente, la soluzione dovrebbe apparire torbida e nessun frammento di tessuto dovrebbe essere visibile. In caso contrario, prolungare la digestione enzimatica a 60 minuti.
Mantenere condizioni sterili ed evitare potenziali contaminazioni batteriche è uno dei passaggi critici quando si lavora con la coltura di tessuti primari. Devono essere utilizzati strumenti di dissezione sterili, reagenti e tamponi; I guanti devono essere cambiati e l'area di lavoro deve essere pulita quando si lavora con gli animali. Una volta ottenuta la sospensione cellulare, il lavoro dovrebbe essere condotto sotto un cappuccio biologico laminare. Dopo la placcatura, le cellule devono essere incubate durante la notte senza disturbi, poiché ciò può influire sull'aderenza. Inoltre, è importante sostituire il terreno di coltura un giorno dopo la semina, poiché le cellule non aderenti possono influire sulla vitalità della coltura.
I marcatori di superficie utilizzati in questo protocollo hanno reagito fortemente con i loro epitopi; tuttavia, è possibile che la digestione enzimatica possa influenzare la reattività di legame e, quindi, i risultati dell'analisi FACS. Un'altra limitazione di questo protocollo è la sottorappresentazione dello strato muscolare. Per migliorare l'efficienza dell'isolamento delle cellule dello strato muscolare, raccomandiamo la separazione meccanica del muscolo dagli strati della mucosa e la digestione enzimatica separata per ciascuno degli strati. Per dissociare l'epitelio dallo stroma, possono essere utilizzati agenti di separazione meccanica o chelanti (EDTA o DTT); Tuttavia, la digestione enzimatica per ottenere singole cellule è stata ottimizzata in questo protocollo.
L'isolamento del mesenchima intestinale è stato precedentemente descritto8; raschiare via i villi con un coprislip causerebbe la perdita di alcuni mesenchimi accanto ai villi, in particolare le cellule mesenchimali della punta del villio come i telocytes13 della punta del villio Lgr5+. In questo protocollo, utilizziamo collagenasi di tipo VIII invece di dispasi II e tripsina in combinazione con DNasi I, poiché la collagenasi rilascia in modo più efficiente le cellule mesenchimali dalla matrice. Sebbene prolunghi il tempo di elaborazione (>90 minuti contro 35 minuti), i due protocolli hanno prodotto tassi di vitalità cellulare simili; L'attuale protocollo ha migliorato la resa delle cellule mesenchimali in generale, e più specificamente della frazione telocitaria. Il protocollo attuale ha prodotto circa il 10% di telociti GFP+, confermati sia dalla visualizzazione che dall'analisi FACS, mentre il protocollo precedente ha prodotto il 2% di telociti GFP+. Le principali differenze tra il protocollo attuale e i due protocolli di riferimento sono elencate nella tabella supplementare S1.
L'identificazione delle cellule FOXL1+GFP+ come telociti subepiteliali si basa su studi in vivo . La necessità di sviluppare e modificare i protocolli di isolamento dei mesenchimi disponibili per produrre rese più elevate di telociti e la conoscenza di come raggiungere questo obiettivo si basava sulla nostra comprensione della struttura e della funzione dei telocytes FOXL1+ in vivo, come grandi cellule con lunghe proiezioni cellulari strettamente attaccate alle cellule epiteliali.
È interessante notare che i telociti GFP+ ex vivo mostrano caratteristiche cellulari simili alle loro caratteristiche in vivo nell'intestino e sono, quindi, suggeriti per servire come supporto ideale per la crescita organoide. Sebbene questo protocollo discuta principalmente l'isolamento dei telociti dall'intestino tenue, un protocollo simile con piccole modifiche può essere utilizzato e facilmente applicato per le cellule mesenchimali del colon, come la cellula stromale intestinale (MRISC) regolata da MAP3K2 recentemente descritta12.
Una volta che le cellule mesenchimali si sono allungate e hanno raggiunto la confluenza, possono essere utilizzate per diverse applicazioni aggiuntive, come la co-coltura 3D con organoidi derivati da topi o umani, utilizzando Matrigel privo di fattori di crescita. Il mesenchima forma tipicamente una rete che supporta pienamente la formazione e la crescita degli organoidi senza supplementazione di fattori di crescita esogeni. Lo stroma intestinale ha caratteristiche 3D intrinseche che possono fornire all'epitelio un supporto meccanico14. Pertanto, questo protocollo può anche essere utilizzato per isolare il mesenchima da integrare in un'impalcatura bio-stampata 3D e utilizzato per ulteriori esperimenti di xenotrapianto.

Sia l'intestino tenue che il colon sono tessuti altamente rigenerativi a causa della presenza di cellule staminali, che proliferano e alimentano la rigenerazione1. Il mesenchima che circonda l'epitelio fornisce supporto strutturale e funzionale secernendo proteine della matrice extracellulare e molecole di segnalazione2, che modulano la risposta delle cellule epiteliali. I telociti sono grandi cellule mesenchimali, descritte principalmente al microscopio elettronico come cellule con lunghi processi citoplasmatici chiamati telopodi, che si sovrappongono per creare una rete labirintica 3,4,5,6,7. Recentemente, i telociti intestinali che esprimono il fattore di trascrizione FOXL1 sono emersi come un importante componente di nicchia delle cellule staminali che forniscono proteine Wnt, che sono cruciali per la funzione delle cellule staminali e progenitrici. I telociti intestinali esprimono alti livelli di proteine chiave della via di segnalazione come Wnt, Bmp, Tgfb e Shh, così come molti fattori di crescita8.
Dato che i telocytes sono un componente critico di nicchia delle cellule staminali in vivo, lo sviluppo di protocolli per isolarli e coltivarli ex vivo consentirà il loro uso come fonte di molecole di segnalazione e fattori di crescita, per supportare la crescita e la differenziazione ex vivo. Utilizzando protocolli consolidati, le cripte epiteliali del colon o dell'intestino possono essere isolate e formare strutture 3D note come organoidi 9,10,11. Gli organoidi tridimensionali rappresentano un potente strumento per indagare ex vivo sia la fisiologia che la patologia dell'epitelio intestinale. In un sistema ex vivo, gli organoidi si basano sull'integrazione esogena di fattori per la sopravvivenza e la crescita10. Il mesenchima isolato può essere coltivato con organoidi sia di topo che di derivazione umana e utilizzato come fonte di fattori di crescita, invece dell'integrazione esogena, per riflettere meglio la situazione nel tessuto originale. Lo studio dei telocytes ex vivo ha numerosi vantaggi nello studio dei comportamenti cellulari normali o patologici, dei meccanismi dell'omeostasi tissutale e delle interazioni cellula-cellula in modo più dettagliato.
Sebbene siano disponibili protocolli che descrivono come isolare il mesenchima dall'intestino del topo, non è chiaro se queste procedure portino all'isolamento efficiente dei telociti. Il successo dell'isolamento dei telocytes richiede speciali aggiustamenti del protocollo che consentirebbero la dissociazione del forte contatto cellula-cellula tra i telocytes e le cellule vicine, senza influire sulla loro vitalità. Per superare queste limitazioni, questo articolo presenta un protocollo modificato che produce costantemente una sospensione unicellulare altamente vitale contenente una quantità relativamente elevata di telociti con proprietà antigeniche e funzionali sufficientemente conservate. Questi telociti possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui la co-coltura con organoidi di origine murinaria o umana, per sostenere la crescita senza integrazione di fattori di crescita. Questo a sua volta riflette meglio la situazione nel tessuto originale.
Abbiamo utilizzato il modello 8 del topo FOXL1-Cre: Rosa-mTmG, in cui i telociti sono marcati con una versione legata alla membrana della proteina fluorescente verde (GFP) inverde, che consente allo sperimentatore di seguire i telociti nella loro interezza; tutte le altre cellule mesenchimali sono etichettate con un tdTomato legato alla membrana in rosso. L'attuale protocollo è stato modificato da un protocollo che isola il mesenchima intestinale12 per migliorare la resa e la vitalità dei telociti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

L'intestino tenue murino, o mesenchima del colon, è altamente eterogeneo, contenente tipi di cellule distinte tra cui sangue ed endotelio linfatico, nervi, fibroblasti, miofibroblasti, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e il tipo di cellula recentemente identificato, i telociti. I telociti sono cellule mesenchimali uniche con lunghi processi citoplasmatici, raggiungendo una distanza da decine a centinaia di micron dal corpo cellulare. I telociti sono recentemente emersi come un importante componente di nicchia delle cellule staminali intestinali, fornendo proteine Wnt essenziali per la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici.
Sebbene siano disponibili protocolli su come isolare il mesenchima dall'intestino del topo, non è chiaro se queste procedure consentano l'isolamento efficiente dei telociti. L'isolamento efficiente dei telocytes richiede speciali aggiustamenti del protocollo che consentirebbero la dissociazione del forte contatto cellula-cellula tra i telocytes e le cellule vicine senza influire sulla loro vitalità. Qui, i protocolli di isolamento del mesenchima intestinale disponibili sono stati adattati per supportare il successo dell'isolamento e della coltura del mesenchima contenente una resa relativamente elevata di telociti unicellulari vitali.
La sospensione monocellulare ottenuta può essere analizzata con diverse tecniche, come l'immunocolorazione, l'ordinamento cellulare, l'imaging e gli esperimenti di mRNA. Questo protocollo produce mesenchima con proprietà antigeniche e funzionali sufficientemente conservate dei telociti e può essere utilizzato per diverse applicazioni. Ad esempio, possono essere utilizzati per la co-coltura con organoidi derivati dal topo o dall'uomo per supportare la crescita degli organoidi senza integrazione di fattori di crescita, per riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.

Il suddetto protocollo di isolamento del mesenchima intestinale è stato modificato dai protocolli descritti sia in Wu et al.12 che in Shoshkes-Carmel et al.8. Il protocollo descritto in Wu et al. è per il colon, e quello di Shoshkes-Carmel et al. è per l'intestino tenue, quindi la condizione di digestione è diversa nella combinazione enzimatica, nella concentrazione del lavoro e nel tempo di incubazione tra questi due protocolli. Qui, il protocollo descritto è stato utilizzato con successo per isolare e coltivare cellule mesenchimali intestinali, compresi i telocytes. In breve, abbiamo sezionato l'intestino tenue dal duodeno all'ileo usando un modello murino FOXL1-Cre: Rosa-mTmG8, in cui i telociti sono stati etichettati con membrana-GFP (verde), mentre altre cellule mesenchimali sono state etichettate con membrana-tdTomato (rosso). Abbiamo dissociato il tessuto usando enzimi digerenti e seminato il mesenchima in una piastra a 6 pozzetti. Dopo la dissociazione, i telociti perdono le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare rotonda (Figura 2A) che si riflette nella sotto-quantificazione delle cellule GFP+ al giorno 1 rispetto ai giorni successivi (Figura 2F). Dopo alcuni giorni, i telociti mostrano una piccola morfologia cellulare allungata con processi cellulari brevi (Figura 2B,C). Tuttavia, 7-10 giorni dopo la semina, i telociti riacquistano le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare allungata di grandi dimensioni con lunghi processi citoplasmatici (Figura 2D,E), e sono pronti per essere utilizzati in co-coltura con organoidi e sostenere la loro crescita.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> Figura 2: Mesenchima in coltura isolato da FOXL1Cre: intestino di topo Rosa-mTmG. I telociti FOXL1+ sono marcati con GFP, mentre altre cellule mesenchimali sono tdTomato+. (A-E) Immagini rappresentative di mesenchima coltivato isolato utilizzando il protocollo corrente, placcato in una piastra a 6 pozzetti e ripreso dopo 1 (A), 4 (B, C) e 7 (D, E) giorni di coltura. Barre di scala = 100 μm. (F) Quantificazione del rapporto GFP/tdTomato cell per campo visivo (percentuali) ai giorni 1, 4 e 7 di coltura. Abbreviazioni: FOXL1 = Forkhead box L1 protein; GFP = proteina fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Per valutare questo protocollo di isolamento e rivelare la composizione cellulare, abbiamo analizzato la sospensione cellulare ottenuta mediante citometria a flusso (Figura 3). Nel complesso, il 69% delle cellule isolate era vitale sulla base della colorazione DAPI (Figura 3 III); tra le cellule vive, il 60,9% rappresentava la contaminazione epiteliale e le cellule immunitarie ed endoteliali (CD326+, CD45+ e CD31+; Figura 3 IV). La frazione telocitaria (GFP+) sparsa sopra 100k e 70k FSC e SSC, rispettivamente (Figura 3 VI), e rappresentava quasi il 10% dal mesenchima gated (CD45-, CD326-, CD31-) vivo (Figura 3 V).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> Figura 3: Strategia di gating della citometria a flusso per la selezione di telociti da mesenchima intestinale isolato di topo adulto. (I) Sono stati esclusi gli eventi di dispersione laterale di basso livello. (II) Le singole celle sono state recintate in base all'altezza SSC per area SSC. (III) Gli eventi DAPI+ sono stati eliminati per escludere le cellule morte dal sort. (IV) Gli eventi DAPI- CD45+/CD326+/CD31+ sono stati eliminati per escludere rispettivamente le cellule immunitarie, epiteliali ed endoteliali. (V) I telociti GFP+ rappresentavano il 10,3% delle cellule DAPI- CD45-/CD326-/CD31-. (VI) L'analisi di back-gating ha rivelato le coordinate dei telocytes GFP+ in un grafico FSC-A/SSC-A. Abbreviazioni: SSC-A = area laterale scatter-peak; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; SSC-H = altezza del picco di dispersione laterale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; GFP = proteina fluorescente verde; APC = alloficocianina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
In parallelo, abbiamo anche isolato il mesenchima da un intestino di topo C57Bl6 wild-type (WT), in cui la frazione telocitaria è stata valutata utilizzando una combinazione di marcatori di superficie precedentemente analizzati su mesenchima isolato da un modello murino FOXL1Cre: Rosa-mTmG, in cui la frazione telocitaria era marcata con GFP. Abbiamo scoperto che un sottogruppo dei telociti può essere definito da una colorazione positiva a CD201 e podoplanina (GP38) (Figura 4). Inoltre, l'uso di questi marcatori nell'immunocolorazione 1 giorno dopo l'isolamento e la coltura ha confermato che, sebbene le cellule non mostrassero ancora le loro caratteristiche cellulari, hanno ottenuto l'espressione di questi marcatori molecolari, mostrando colorazione nel 70% -80% dei telocytes GFP+ (Figura 5).
La frazione telocitaria definita dai marcatori di superficie non è identica a quella ottenuta utilizzando il mouse reporter guidato da FOXL1; Il telocita è altamente eterogeneo e contiene diversi sottoinsiemi. È necessario combinare il marcatore di superficie con l'etichettatura FOXL1 per la definizione dei telociti. Nell'intestino tenue del topo FOXL1Cre: Rosa-mTmG, il 60%-70% delle cellule GFP+ sono CD201 positive e il 65%-80% sono positive per GP38. Quando si utilizzano marcatori di superficie, è importante notare che la conservazione inappropriata e i cicli ripetitivi di congelamento-scongelamento degli anticorpi riducono l'efficienza di legame. Inoltre, la digestione enzimatica può interrompere l'espressione dei marcatori di superficie. Abbiamo osservato che l'espressione di CD138, un proteoglicano transmembrana espresso sulle cellule mesenchimali, è stata interrotta e notevolmente diminuita con la dissociazione.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> Figura 4: Analisi FACS di sospensione monocellulare di mesenchima isolata da FOXL1Cre: intestino tenue di topo Rosa-mTmG utilizzando il protocollo corrente. Analisi FACS su cellule singole (I-II), (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+, mostrando che (VII) il 65,3% del GFP+ e il 31,2% del Tomato+ sono positivi per GP38, mentre (VIII) il 60,5% del GFP+ e il 22,6% del Tomato+ sono positivi per CD201. Abbreviazioni: SSC-A = area laterale scatter-peak; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; SSC-H = altezza del picco di dispersione laterale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; GFP = proteina fluorescente verde; APC = alloficocianina; PE = ficoeritrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> Figura 5: Mesenchima coltivato del primo giorno, fissato e colorato per marcatori mesenchimali. (A-D) Immagini rappresentative di mesenchima coltivato colorato per GP38. (F-I) Immagini rappresentative di mesenchima coltivato colorato per CD201. Barre della scala = 100 μm. (E) Quantificazione di Tomato+ GP38+ e Tomato+ CD201+ doppio positivo dal Tomato+ totale. (J) Quantificazione del doppio positivo di GFP+ GP38+ e GFP+ CD201+ rispetto al totale di GFP+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Soluzione A:</td>
			<td colspan="4">HBSS integrato con 2% FBS, 1 mM DL-ditiotreitolo (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0).</td>
		</tr><tr><td>Mezzo complementare 1640 (CM1640):</td>
			<td colspan="4">RPMI 1640 medio integrato con 10% FBS, Pen / Strep (100 unità di penicillina / ml, 100 μg di streptomicina / ml).</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di digestione:</td>
			<td colspan="4">100 U/mL collagenasi tipo VIII, 75 mg/mL DNasi I in 4 mL di CM1640 preriscaldato. Nota: aggiungere collagenasi e DNasi I poco prima dell'inizio della procedura di digestione.</td>
		</tr><tr><td>Terreni di coltura:</td>
			<td colspan="4">Mezzi DMEM-F12 integrati con 10 μg/mL di gentamicina, 10 mM HEPES, glutammina, Pen/Streptococco (100 unità di penicillina/ml, 100 μg di streptomicina/ml).</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS:</td>
			<td colspan="4">PBS integrato con 5% FBS e 1 mM EDTA.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione di tutte le soluzioni utilizzate nel protocollo. 
Tabella supplementare S1: Le principali differenze tra il protocollo corrente e i due protocolli di riferimento sono elencate qui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Qui, presentiamo un protocollo per isolare il mesenchima intestinale murino, compresi i telocytes. Questi possono essere utilizzati per diverse applicazioni, come la co-coltura con topo o organoidi di derivazione umana, per sostenere la crescita e riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Il nostro protocollo per l'isolamento del mesenchima intestinale si traduce in un'alta resa di telociti. Questo metodo offre una piattaforma iniziale per studiare l'interazione cellula-cellula che coinvolge i telocytes nell'omeostasi e nella malattia. I telociti sono cellule uniche sensibili ai protocolli di dissociazione tissutale disponibili.Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica è l'isolamento del mesenchima, compresi i telociti vitali arricchiti. Il mesenchima, incluso il telocita, può servire come fonte per le molecole di segnalazione e i fattori di crescita necessari per la crescita organizzata ex vivo. Per iniziare, lavare l'intestino, separato da un topo eutanasiato, in una capsula di Petri contenente PBS freddo e sterile.Metti l'intestino in una capsula di Petri. E usando le forbici a sfera, apri il tubo intestinale longitudinalmente e lava le feci. Trasferire l'intestino in un nuovo piatto contenente PBS fresco e freddo.Dopo aver lavato l'intestino ancora una volta, tagliare l'intestino tenue in segmenti lunghi un centimetro e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri riempito con otto millilitri di PBS. Agitare il tubo manualmente a uno o due cicli al secondo per un minuto. Versare la soluzione in una capsula di Petri.E usando una pinza, trasferire il segmento in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 20 millilitri di soluzione A.Posizionare i tubi in un incubatore orbitale a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, agitare vigorosamente il tubo a mano a quattro o cinque cicli al secondo per un minuto per dissociare l'epitelio. Ripetere questo passaggio ancora una volta.Dopo aver tagliato e lavato i frammenti come dimostrato in precedenza, trasferirli in un nuovo tubo da 50 millilitri riempito con 10 millilitri di PBS sterile e invertire il tubo a uno o due cicli al secondo per un minuto. Versare la soluzione in una capsula di Petri. Trasferire i segmenti in un nuovo tubo da 15 millilitri riempito con 10 millilitri di PBS sterile e inclinare delicatamente su e giù a uno o due cicli al secondo per due minuti.Sotto un armadio di biosicurezza, utilizzare una pinza per posizionare i segmenti su una salvietta da laboratorio sterile per asciugarli. Una volta asciugati, tagliare ulteriormente gli spicchi a pezzi. Trasferire i pezzi tagliati usando una pinza in una piastra a sei pozzetti riempita con quattro millilitri di soluzione di digestione preriscaldata per pozzetto.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 50 minuti e agitare delicatamente la piastra manualmente ogni 20 minuti. Quindi, trasferire i pezzi utilizzando una pipetta Pasteur in un tubo conico da 15 millilitri riempito con quattro millilitri di DMEM. Agitare il tubo manualmente a quattro o cinque cicli al secondo per un minuto per ottenere una sospensione a cella singola.Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 700 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di 2% FBS / PBS.Dopo aver centrifugato la sospensione ancora una volta a 700 g per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 12 millilitri di terreno di coltura. Infine, seminare la sospensione cellulare in piastre a sei pozzetti. Dopo la dissociazione del mesenchima, i telociti perdono le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare rotonda, e riflettono meno cellule GFP-positive il primo giorno rispetto ai giorni successivi.Pochi giorni dopo, i telocytes mostrano una morfologia cellulare piccola e allungata con processi cellulari brevi. Dopo sette-10 giorni di semina, i telocytes riacquistano le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare ampia e allungata con lunghi processi citoplasmatici. La citometria a flusso rivela la composizione cellulare.Nel complesso, il 69% delle cellule isolate era vitale sulla base della colorazione DAPI. E di questi, il 60,9% rappresentava la contaminazione epiteliale e le cellule immunitarie ed endoteliali. La frazione telocitaria si è diffusa sopra 100k e 70k FSC e SSC, rispettivamente, e rappresentava quasi il 10% del mesenchima gated.L'analisi FACS ha rivelato che il sottogruppo di telociti può essere definito mediante colorazione positiva a CD201 e GP38. L'immunocolorazione del mesenchima coltivato di un giorno utilizzando questi marcatori ha mostrato l'espressione di questi marcatori molecolari, nonostante le cellule non presentino le loro caratteristiche cellulari. Questa procedura si traduce in una sospensione monocellulare praticabile di cellule stromali, che può essere utilizzata non solo per la coltura 2D ma per qualsiasi altra applicazione, come la co-coltura 3D con organoidi o bioprinting.

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