Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
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この研究は、イスラエル科学財団からの助成金(MSC個人助成金)と、イスラエル科学財団と中国国家自然科学財団の共同プログラムによって支援されました。

以下に説明するすべての手順は、エルサレムのヘブライ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 試薬および緩衝液の調製
<ol><li>水浴を37°Cに予熱する。</li>
	<li>表1のすべての溶液を準備します。</li>
</ol>2.腸間葉系分離
<ol><li>マウスをCO2 吸入により安楽死させ、直ちに頸部脱臼させる。</li>
	<li>マウスを仰臥位に置き、腹部に70%EtOHをスプレーします。腹部の皮膚を持ち上げ、正中線に沿って縦方向に切断して腹腔を露出させます( 図1 I、IIを参照)。</li>
	<li>胃の位置を特定し、食道から切り取り、ゆっくりと腸を腹腔から引き出します。鉗子を使用して余分な脂肪と結合組織をきれいにします。十二指腸から盲腸から約0.5 cmまで小腸を切除します(図1 III、IV)。</li>
	<li>冷たい滅菌PBSを含むペトリ皿で腸を洗います。ボールチップハサミを使用して、腸管を縦方向に開き、糞便を洗い流します(図1 V)。腸を新鮮な冷たいPBSを含む新しい皿に移し、もう一度洗います。</li>
	<li>小腸を1cmの長さのセグメントに切断し、8mLのPBSで満たされた15mLのコニカルチューブに移します。チューブを1サイクルまたは2サイクル/秒で1分間手動で振ってください。</li>
	<li>鉗子を使用してセグメントを、20 mLの新しく作られた溶液Aで満たされた50 mLのコニカルチューブに移します( 表1を参照)。チューブを37°Cのオービタルシェーカーインキュベーターに20分間入れます。インキュベーション後、チューブを4〜5サイクル/秒で1分間手で激しく振って、上皮を解離させます。</li>
	<li>手順 2.6 を 1 回繰り返します。</li>
	<li>セグメントを10 mLの滅菌PBSで満たされた新しい50 mLチューブに移し、チューブを1または2サイクル/秒で1分間反転させます。</li>
	<li>セグメントを10 mLの滅菌PBSで満たされた新しい15 mLチューブに移し、1〜2サイクル/秒で2分間ゆっくりと上下に傾けます。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネットの下で、鉗子を使用してセグメントを滅菌ラボワイプに置き、乾燥させます。乾燥したら、セグメントをさらに0.5 cmの小片にカットします。</li>
	<li>鉗子を使用して、ウェルあたり4 mLの予熱消化溶液で満たされた6ウェルプレートに小さなセグメントを移します。37°Cで50分間インキュベートします。20分ごとにプレートを手でそっと振ってください。</li>
	<li>パスツールピペットを使用して、4 mLのDMEMで満たされた15 mLのコニカルチューブにセグメントを移します。チューブを4サイクルまたは5サイクル/秒で1分間手動で振とうして、シングルセル懸濁液を取得します。</li>
	<li>懸濁液を100 μmストレーナーを通して50 mLコニカルチューブにろ過します。ろ液を700 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引して廃棄し、細胞ペレットを5 mLの2%FBS/PBSに再懸濁します。懸濁液を700 × g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引により廃棄し、細胞ペレットを12 mLの培養液で再懸濁し、ウェルあたり1 mLを2つの6ウェルプレートにシードします。翌日、死にかけている細胞を洗浄して吸引し、使用済みの培地を新しい培地と交換します。 注:培養を最適に維持するために、2日ごとに培地を交換することをお勧めします。マウスの系統、遺伝的背景、年齢にもよりますが、間葉が共培養実験の準備が整うまでに4日から2週間かかります。さらなる共培養実験では、間葉系はコンフルエントに達し、 図2に示すように平らで完全に引き伸ばされた細胞形態を示すはずです。一般に、丸い形態を有する細胞は生存可能または機能的ではない。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> 図1:マウスの解剖 。 (I)マウスを仰臥位に置き、腹部に70%EtOHをスプレーします。腹部の皮膚を持ち上げます。(II)腹膜腔を正中線に沿って縦方向に開く。(III)胃をそっと引っ張りながら、食道を切断します。(IV)胃をつまんでゆっくりと腸を引き抜きます。(V)ボールチップハサミの先端を内腔に挿入し、腸管を縦方向に開きます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3.継代または共培養のための間葉再懸濁
<ol><li>間葉を2 mLの0.25%トリプシン-0.5 mM EDTA/ウェルで6ウェルプレートに再懸濁します。37°Cで5分間インキュベートします。 インキュベーション後、いくつかの細胞がまだ皿から剥離し始めていない場合は、さらに2分間インキュベートします。</li>
	<li>セルスクレーパーを使用して、ウェルの表面をそっとこすります。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。2 mLのDMEM-F12 /ウェルを追加し、懸濁液を上下に静かにピペットで固定します。 注意: チューブ容量の50%以上でチューブを過剰に充填しないことが重要です。したがって、2つのウェルごとに8 mLの懸濁液で満たされた15 mLのコニカルチューブを使用することをお勧めします。</li>
	<li>セルを数えます。 注:完全にコンフルエントなウェルでは、2 × 106 セルから2.5 × 106 セルが得られます。</li>
	<li>細胞懸濁液を希釈して、3〜5×105 細胞/ mLの播種密度を達成します。4°Cで500× gで5 分間遠心分離し、注意深い吸引により上清を捨てる。 注意: できるだけ多くの液体を取り除くことが重要です。</li>
	<li>細胞ペレットを予熱した培養培地およびプレートに再懸濁する。</li>
</ol>4. テロサイト精製のためのフローサイトメトリー解析
<ol><li>間葉系細胞ペレットを得る(工程2.14)。細胞ペレットを1 mLのFACSバッファーに再懸濁し、40 μmのストレーナーでろ過します。</li>
	<li>細胞懸濁液をアロフィコシアニン(APC)結合CD326(1:100)、CD45(1:400)、およびCD31(1:250)抗体とともに400 μLのFACSバッファー中で室温で15分間インキュベートし、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞をそれぞれソートから除外します。</li>
	<li>1 mLのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、700 × gで4°Cで5分間スピンダウンします。 フローサイトメトリー解析用に400 μLのFACSバッファーに再懸濁し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、5 mg/mL、1:1,000)を追加します。SSC面積によるSSC高さに応じて単一セルをゲートします。図3に示すように、DAPI-生細胞をゲートし、CD45+/CD31+/CD326+をゲートアウトしてGFP+テロサイトをソートします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

著者には、宣言する利益相反はありません。

ここでは、FOXL1-Cre:Rosa26-mTmGマウスモデルを使用してマウス小腸から間葉系を分離するためのプロトコルを開発し、テロサイトを他の間葉系細胞と区別できるようにしました。このプロトコルには、従うべきいくつかの重要な手順があります。まず、間葉分離中に上皮細胞の大部分を廃棄するために、4または5サイクル/秒でチューブを激しく振ることが重要です。酵素消化のためのインキュベーション時間は、消化効率に基づいて最適化する必要があります。インキュベーション中、プレートを20分ごとに数秒間水平に静かに振とうします。組織がフィラメント状になったら、プロトコルステップ2.12に進んでインキュベーションを停止する必要があります。消化時間を長くすると、細胞の生存率と収量が低くなる可能性があります。酵素消化に続いて、チューブを機械的に振って、より多くの単一細胞を懸濁液に放出する必要があります。理想的には、溶液は曇って見え、組織片は見えないはずです。そうでない場合は、酵素消化を60分に延長してください。
無菌状態を維持し、潜在的な細菌汚染を回避することは、初代組織培養を扱う際の重要なステップの1つです。滅菌解剖ツール、試薬、およびバッファーを使用する必要があります。手袋を交換し、動物を扱うときは作業エリアを掃除する必要があります。細胞懸濁液が得られたら、層流生物学的フードの下で作業を行う必要があります。プレーティング後、細胞は接着に影響を与える可能性があるため、乱れずに一晩インキュベートする必要があります。さらに、非接着細胞が培養生存率に影響を与える可能性があるため、播種後1日で培地を交換することが重要です。
このプロトコルで使用された表面マーカーは、それらのエピトープと強く反応しました。ただし、酵素消化が結合反応性に影響を与える可能性があるため、FACS分析結果に影響を与える可能性があります。このプロトコルの別の制限は、筋肉層の過小表現です。筋肉層細胞単離の効率を向上させるために、粘膜層から筋肉を機械的に分離し、各層に酵素消化を分離することをお勧めします。上皮を間質から解離させるために、機械的分離剤またはキレート剤(EDTAまたはDTT)のいずれかを使用することができる。しかしながら、単一細胞を得るための酵素消化は、このプロトコルにおいて最適化されている。
腸間葉系の単離は以前に説明されています8;カバーガラスで絨毛をこすり落とすと、絨毛と一緒にいくつかの間葉、特にLgr5+絨毛先端テロサイト13などの絨毛先端間葉系細胞が失われます。このプロトコルでは、ディスパーゼIIの代わりにコラゲナーゼVIII型を利用し、トリプシンをDNase Iと組み合わせて使用 することで、コラゲナーゼがマトリックスから間葉系細胞をより効率的に放出します。処理時間は延長されますが(>90分対35分)、2つのプロトコルは同様の細胞生存率をもたらしました。現在のプロトコルは、一般的に間葉系細胞、より具体的にはテロサイト画分の収量を改善しました。現在のプロトコルでは約10%のGFP+テロサイトが得られ、可視化とFACS分析の両方で確認されましたが、以前のプロトコルでは2%のGFP+テロサイトが得られました。現在のプロトコルと2つの参照プロトコルの主な違いを補足表S1に示します。
FOXL1+GFP+ 細胞を上皮下テロサイトとして同定することは、 in vivo 研究に基づいています。テロサイトのより高い収量を生成するために利用可能な間葉分離プロトコルを開発および変更する必要性とこれを達成する方法の知識は、上皮細胞に密接に付着した長い細胞突起を持つ大きな細胞としてのFOXL1+ テロサイトのin vivoの構造と機能に関する私たちの理解に基づいていました。
興味深いことに、 ex vivo GFP + テロサイトは、腸内の in vivo の特徴と同様の細胞特性を示すため、オルガノイド増殖の理想的なサポートとして機能することが示唆されています。このプロトコルは主に小腸からのテロサイト単離について説明していますが、最近記載されたMAP3K2調節腸間質細胞(MRISC)12などの結腸間葉系細胞にも、わずかな変更を加えた同様のプロトコルを使用して簡単に適用できます。
間葉系細胞が伸張してコンフルエントに達すると、成長因子を含まないマトリゲルを使用したマウスまたはヒト由来のオルガノイドとの3D共培養など、いくつかの追加アプリケーションに使用できます。間葉系は通常、外因性成長因子の補給なしにオルガノイドの形成と成長を完全にサポートするネットワークを形成します。腸間質は、上皮に機械的支持を提供することができる固有の3D特徴を有する14。したがって、このプロトコルを使用して間葉を分離し、3Dバイオプリント足場に統合し、さらなる異種移植実験に利用することもできます。

小腸と結腸はどちらも、増殖して再生を促進する幹細胞の存在により、再生性の高い組織です1。上皮を取り囲む間葉系は、細胞外マトリックスタンパク質とシグナル伝達分子2を分泌することにより、構造的および機能的なサポートを提供し、上皮細胞の応答を調節します。テロサイトは大きな間葉系細胞であり、これまで主に電子顕微鏡でテロポッドと呼ばれる長い細胞質プロセスを持つ細胞として説明されており、それらが重なり合って迷路ネットワークを作成します3,4,5,6,7。近年、転写因子FOXL1を発現する腸管テロサイトは、幹細胞および前駆細胞の機能に重要なWntタンパク質を提供する重要な幹細胞ニッチ成分として浮上しています。腸内テロサイトは、Wnt、Bmp、Tgfb、Shhなどの重要なシグナル伝達経路タンパク質と、多くの成長因子を高レベルで発現します8。
テロサイトがin vivoで重要な幹細胞ニッチ成分であることを考えると、それらをex vivoで分離および培養するためのプロトコルを開発することで、シグナル伝達分子および成長因子の供給源としての使用が可能になり、ex vivoでの成長と分化がサポートされます。十分に確立されたプロトコルを使用して、結腸または腸の上皮陰窩を単離し、オルガノイド9、10、11として知られる3D構造を形成することができます。三次元オルガノイドは、ex vivoで腸上皮の生理学と病理の両方を調査するための強力なツールです。ex vivoシステムでは、オルガノイドは生存と成長のための因子の外因性の補充に依存しています10。単離された間葉系は、マウスおよびヒト由来のオルガノイドの両方で培養し、外因性の補給の代わりに成長因子の供給源として使用して、元の組織の状況をよりよく反映することができます。ex vivoでテロサイトを研究することは、正常または病理学的な細胞挙動、組織の恒常性のメカニズム、および細胞間相互作用をより詳細に調査する上で多くの利点があります。
マウスの腸から間葉系を単離する方法を説明するプロトコルが利用可能であるが、これらの手順がテロサイトの効率的な単離をもたらすかどうかは明らかではない。テロサイトの単離を成功させるには、生存率に影響を与えることなく、テロサイトと隣接する細胞との間の強力な細胞間接触の解離を可能にする特別なプロトコル調整が必要です。これらの制限を克服するために、この論文は、十分に保存された抗原性および機能特性を有する比較的大量のテロサイトを含む、生存率の高い単一細胞懸濁液を一貫して生成する修正プロトコルを提示します。これらのテロサイトは、マウスまたはヒト由来のオルガノイドとの共培養を含むいくつかの用途に使用でき、成長因子の補給なしで成長をサポートします。これは、元の組織の状況をよりよく反映しています。
FOXL1-Cre:Rosa-mTmGマウスモデル8を使用し、テロサイトを緑色の緑色蛍光タンパク質(GFP)の膜結合バージョンで標識し、研究者がテロサイト全体を追跡できるようにします。他のすべての間葉系細胞は、膜結合したtdTomatoで赤色で標識されています。現在のプロトコルは、テロサイトの収量と生存率を改善するために腸間葉12 を単離するプロトコルから変更されました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

マウス小腸、または結腸間葉は非常に不均一であり、血液およびリンパ内皮、神経、線維芽細胞、筋線維芽細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、および最近特定された細胞型であるテロサイトを含む異なる細胞型を含みます。テロサイトは、細胞体から数十〜数百ミクロンの距離に達する、長い細胞質プロセスを持つユニークな間葉系細胞です。テロサイトは最近、重要な腸幹細胞ニッチ成分として浮上しており、幹細胞および前駆細胞の増殖に不可欠なWntタンパク質を提供しています。
マウスの腸から間葉を単離する方法に関するプロトコルが利用可能であるが、これらの手順がテロサイトの効率的な単離を可能にするかどうかは明らかではない。テロサイトを効率的に単離するには、テロサイトと隣接細胞との間の強力な細胞間接触を生存率に影響を与えることなく解離できるようにする特別なプロトコル調整が必要です。ここで、利用可能な腸間葉系単離プロトコルは、生存可能な単一細胞テロサイトの比較的高い収率を含む間葉系の単離および培養の成功を支持するように調整された。
得られた単一細胞懸濁液は、免疫染色、細胞選別、イメージング、およびmRNA実験などのいくつかの技術によって分析することができる。このプロトコルは、テロサイトの十分に保存された抗原性および機能特性を有する間葉系をもたらし、いくつかの用途に使用することができる。例えば、マウスまたはヒト由来のオルガノイドとの共培養に使用して、成長因子を補充せずにオルガノイドの成長をサポートし、元の組織の状況をよりよく反映することができます。

上記の腸間葉系分離プロトコルは、Wuら12およびShoshkes-Carmelら8の両方に記載されたプロトコルから改変された。Wuらに記載されているプロトコルは結腸用であり、Shoshkes-Carmelらのプロトコルは小腸用であるため、消化条件は酵素の組み合わせ、作業濃度、およびインキュベーション時間が異なります。ここで、記載されたプロトコールは、テロサイトを含む腸間葉系細胞を単離および培養するために首尾よく使用されている。簡単に説明すると、テロサイトを膜-GFP(緑)で標識し、他の間葉系細胞を膜-tdTomato(赤)で標識したFOXL1-Cre:Rosa-mTmGマウスモデル8を使用して、十二指腸から回腸まで小腸を解剖しました。消化酵素を用いて組織を解離させ、間葉を6ウェルプレートに播種した。解離後、テロサイトは細胞特性を失い、丸い細胞形態を示し(図2A)、これは1日目のGFP+細胞の定量不足に反映されています(図2F)。数日後、テロサイトは短い細胞突起を伴う小さな伸張細胞形態を示します(図2B、C)。しかし、播種後7〜10日で、テロサイトは細胞特性を取り戻し、長い細胞質プロセスを伴う大きな伸張細胞形態を示し(図2D、E)、オルガノイドとの共培養で使用して増殖をサポートする準備が整います。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> 図2:FOXL1Cre:Rosa-mTmGマウス腸から単離された培養間葉。FOXL1+テロサイトはGFPで標識されていますが、他の間葉系細胞はtdTomato+です。(A-E)現在のプロトコルを使用して単離された培養間葉の代表的な画像は、6ウェルプレートに播種され、1(A)、4(B、C)、および7(D、E)日の培養後に画像化されました。スケールバー= 100 μm。 (F)培養1、4、7日目における視野あたりのGFP/tdTomatoes細胞比率(パーセンテージ)の定量。略語:FOXL1 =フォークヘッドボックスL1タンパク質;GFP = 緑色蛍光タンパク質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
この単離プロトコルを評価し、細胞組成を明らかにするために、得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリーで分析しました(図3)。全体として、単離された細胞の69%がDAPI染色に基づいて生存可能でした(図3 III)。生細胞のうち、60.9%が上皮汚染と免疫細胞および内皮細胞(CD326+、CD45+、およびCD31+;図 3テロサイト画分(GFP +)は、それぞれ100kおよび70kのFSCおよびSSCの上に散在し(図3 VI)、ゲート付き間葉(生CD45-、CD326-、CD31-)からほぼ10%を表した(図3V)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> 図3:単離された成体マウス腸間葉からテロサイトを選別するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。 (I)低レベルの側方散乱事象は除外した。(II)単一細胞をSSC面積によってSSC高さに応じてゲーティングした。(III)DAPI+イベントは、死細胞をソートから除外するためにゲートアウトされました。(IV)DAPI−CD45+/CD326+/CD31+イベントは、免疫細胞、上皮細胞、および内皮細胞をそれぞれ除外するためにゲーティングアウトされた。(V)GFP +テロサイトは、DAPI-CD45-/CD326-/CD31-細胞の10.3%を占めた。(VI)バックゲーティング解析により、FSC-A/SSC-AプロットでGFP+テロサイトの座標が明らかになりました。略語: SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;GFP = 緑色蛍光タンパク質;APC =アロフィコシアニン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
並行して、野生型(WT)C57Bl6マウス腸から間葉を単離し、テロサイト画分をGFP標識したFOXL1Cre:Rosa-mTmGマウスモデルから分離した間葉で以前に分析した表面マーカーの組み合わせを使用して、テロサイト画分を評価しました。我々は、テロサイトのサブセットがCD201およびポドプラニン(GP38)に対する陽性染色によって定義できることを見出した(図4)。さらに、単離および培養1日後の免疫染色でこれらのマーカーを使用すると、細胞はまだ細胞特性を示していないものの、これらの分子マーカーの発現が得られ、GFP+ テロサイトの70%〜80%で染色を示すことを確認しました(図5)。
表面マーカーによって定義されるテロサイト画分は、FOXL1駆動レポーターマウスを使用して得られたものと同一ではありません。テロサイトは非常に不均一であり、いくつかのサブセットが含まれています。テロサイトの定義には、表面マーカーとFOXL1標識を組み合わせる必要があります。FOXL1Cre:Rosa-mTmGマウスの小腸では、GFP + 細胞の60%〜70%がCD201陽性であり、65%〜80%がGP38陽性です。表面マーカーを使用する場合、抗体の不適切な保存および反復的な凍結融解サイクルは結合効率を低下させることに注意することが重要です。さらに、酵素消化は表面マーカー発現を混乱させる可能性があります。間葉系細胞に発現する膜貫通プロテオグリカンであるCD138の発現が破壊され、解離とともに大幅に減少することを観察しました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> 図4:現在のプロトコルを用いたFOXL1Cre:Rosa-mTmGマウス小腸から単離された単一細胞間葉系懸濁液のFACS分析。(I-II)単一細胞、(III)DAPI-、(IV-VI)Lin-(CD45-、CD326-、CD31-)GFP+細胞に関するFACS分析では、(VII)GFP+の65.3%およびトマト+の31.2%がGP38に対して陽性であるのに対し、(VIII)GFP+の60.5%およびトマト+の22.6%がCD201に対して陽性であることを示している。略語: SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積;SSC-H = 側方散乱ピークの高さ;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;GFP = 緑色蛍光タンパク質;APC =アロフィコシアニン;PE =フィコエリスリン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> 図5:培養初日目の間葉系、固定、間葉系マーカーの染色。 (A-D)GP38について染色した培養間葉系の代表的な画像。(F-I)CD201について染色された培養間葉系の代表的な画像。スケールバー= 100 μm。 (E)トマト+GP38+とトマト+ CD201+のダブルポジティブを総トマト+から定量。(J)総GFP+からのGFP+ GP38+およびGFP+ CD201+のダブルポジティブの定量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ソリューション A:</td>
			<td colspan="4">HBSSには、2%FBS、1 mM DL-ジチオスレイトール(DTT)、2 mM EDTA(pH 8.0)を添加しました。</td>
		</tr><tr><td>補完培地1640(CM1640):</td>
			<td colspan="4">10%FBS、ペン/連鎖球菌(100単位ペニシリン/ mL、100μgストレプトマイシン/ mL)を添加したRPMI 1640培地。</td>
		</tr><tr><td>消化液:</td>
			<td colspan="4">100 U/mL コラゲナーゼ タイプVIII、75 mg/mL DNase I を 4 mL の予熱した CM1640 中。注:消化手順が始まる直前にコラゲナーゼとDNase Iを追加します。</td>
		</tr><tr><td>培地:</td>
			<td colspan="4">10 μg/mLのゲンタマイシン、10 mM HEPES、グルタミン、ペン/連鎖球菌(100単位のペニシリン/mL、100 μgのストレプトマイシン/mL)を添加したDMEM-F12培地。</td>
		</tr><tr><td>FACS バッファ:</td>
			<td colspan="4">PBSには5%FBSと1 mM EDTAを添加した。</td>
		</tr></tbody></table>表1:プロトコルで使用されるすべてのソリューションの構成。 
補足表S1:現在のプロトコルと2つの参照プロトコルの主な違いをここにリストします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

ここでは、テロサイトを含むマウス腸間葉系を単離するためのプロトコルを提示します。これらは、マウスまたはヒト由来のオルガノイドとの共培養など、いくつかの用途に使用して、成長をサポートし、元の組織の状況をよりよく反映することができます。

マウス腸間葉系の単離により、テロサイトの高収率が得られます

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

腸間葉系を単離するための当社のプロトコルは、テロサイトの高収率をもたらします。この方法は、恒常性および疾患におけるテロサイトを含む細胞間相互作用を研究するための最初のプラットフォームを提供します。テロサイトは、利用可能な組織解離プロトコルに感受性のあるユニークな細胞です。したがって、この技術の主な利点は、濃縮された生存可能なテロサイトを含む間葉の単離である。テロサイトを含む間葉系は、組織化された成長に必要なシグナル伝達分子および成長因子の源として、ex vivoで働き得る。はじめに、安楽死させたマウスから分離した腸を、冷たい滅菌PBSを含むペトリ皿で洗います。腸をペトリ皿に入れます。そして、ボールチップハサミを使用して、腸管を縦方向に開き、糞便を洗い流します。腸を新鮮で冷たいPBSを含む新しい皿に移します。もう一度腸を洗った後、小腸を1センチメートルの長さのセグメントに切断し、8ミリリットルのPBSで満たされた15ミリリットルの円錐形のチューブに移します。チューブを1秒間に1〜2サイクルで1分間手動で振ってください。溶液をペトリ皿に注ぎます。そして、鉗子を使用して、セグメントを20ミリリットルの溶液で満たされた50ミリリットルの円錐形のチューブに移します A.チューブを摂氏37度のオービタルシェーカーインキュベーターに20分間入れます。インキュベーション後、チューブを毎秒4〜5サイクルで1分間手で激しく振って上皮を解離させます。この手順をもう一度繰り返します。前に示したように断片を切断して洗浄した後、それらを10ミリリットルの滅菌PBSで満たされた新しい50ミリリットルのチューブに移し、1秒間に1〜2サイクルでチューブを1分間反転させます。溶液をペトリ皿に注ぎます。セグメントを10ミリリットルの滅菌PBSで満たされた新しい15ミリリットルのチューブに移し、毎秒1〜2サイクルで2分間穏やかに上下に傾けます。バイオセーフティキャビネットの下で、鉗子を使用してセグメントを滅菌ラボワイプに置き、乾燥させます。乾いたら、セグメントをさらに細かく切ります。鉗子を使用して切断片を、ウェルあたり4ミリリットルの予熱消化溶液で満たされた6ウェルプレートに移します。プレートを摂氏37度で50分間インキュベートし、20分ごとに手動でプレートを静かに振ってください。次に、パスツールピペットを使用して、4ミリリットルのDMEMで満たされた15ミリリットルの円錐管にピースを移します。チューブを毎秒4〜5サイクルで1分間手動で振って、単一の細胞懸濁液を取得します。懸濁液を100マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に濾過する。ろ液を700gで摂氏4度で5分間遠心分離します。吸引により上清を廃棄し、細胞ペレットを5ミリリットルの2%FBS/PBSに再懸濁します。懸濁液を700gで5分間でもう一度遠心分離した後、上清を捨て、細胞ペレットを12ミリリットルの培養液に再懸濁した。最後に、細胞懸濁液を6ウェルプレートに播種します。間葉系解離後、テロサイトは細胞特性を失い、丸い細胞形態を示し、初日には翌日に比べてGFP陽性細胞の数が少なくなります。数日後、テロサイトは短い細胞プロセスを伴う小さな伸張された細胞形態を示します。播種の7〜10日後、テロサイトは細胞特性を取り戻し、長い細胞質プロセスを伴う大きく伸びた細胞形態を示します。フローサイトメトリーは細胞組成を明らかにします。全体として、単離された細胞の69%がDAPI染色に基づいて生存可能であった。そしてこれらのうち、60.9%は上皮汚染と免疫細胞および内皮細胞を表しています。テロサイト画分はそれぞれ100kおよび70kFSCおよびSSCを超えて散在し、ゲート間葉のほぼ10%を占めた。FACS分析により、テロサイトのサブセットはCD201およびGP38への陽性染色によって定義できることが明らかになりました。これらのマーカーを用いた1日培養間葉の免疫染色は、細胞が細胞特性を示さないにもかかわらず、これらの分子マーカーの発現を示した。この手順により、間質細胞の生存可能な単一細胞懸濁液が得られ、2D培養だけでなく、オルガノイドとの3D共培養やバイオプリンティングなどの他のアプリケーションに使用できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

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