Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Israel Science Foundation (MSC personlig stipend) og fellesprogrammet mellom Israel Science Foundation og National Natural Science Foundation of China.

Alle prosedyrene beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Det hebraiske universitetet i Jerusalem.
1. Fremstilling av reagenser og buffere
<ol><li>Forvarm et vannbad til 37 °C.</li>
	<li>Forbered alle løsningene i tabell 1.</li>
</ol>2. Intestinal mesenkym isolasjon
<ol><li>Avlive musen ved innånding av CO2 , umiddelbart etterfulgt av cervikal dislokasjon.</li>
	<li>Plasser musen i liggende stilling og spray magen med 70% EtOH. Løft bukhuden og skjær i lengderetningen langs midtlinjen for å eksponere bukhulen (se figur 1 I,II).</li>
	<li>Finn magen, kutt fra spiserøret, og sakte trekke tarmen ut av bukhulen. Rengjør overflødig fett og bindevev ved hjelp av tang. Skjær tynntarmen fra tolvfingertarmen til ca. 0,5 cm fra cecum (figur 1 , III,IV).</li>
	<li>Vask tarmen i en petriskål som inneholder kald steril PBS. Bruk kulespisssaks, åpne tarmrøret i lengderetningen og vask ut avføringen (figur 1 V). Overfør tarmen til en ny tallerken som inneholder fersk kald PBS og vask igjen.</li>
	<li>Klipp tynntarmen i 1 cm lange segmenter og overfør til et 15 ml konisk rør fylt med 8 ml PBS. Rist røret manuelt i en eller to sykluser/s i 1 min.</li>
	<li>Overfør segmentene med tang til et 50 ml konisk rør fylt med 20 ml nylaget oppløsning A (se tabell 1). Plasser rørene i en orbital shaker inkubator ved 37 ° C i 20 minutter. Etter inkubering, rist røret kraftig for hånd i fire eller fem sykluser/s i 1 min for å dissosiere epitelet.</li>
	<li>Gjenta trinn 2.6 én gang.</li>
	<li>Overfør segmentene til et nytt 50 ml rør fylt med 10 ml steril PBS, og snu slangen på en eller to sykluser/s i 1 min.</li>
	<li>Overfør segmentene til et nytt 15 ml rør fylt med 10 ml steril PBS, og vipp forsiktig opp og ned i en eller to sykluser/s i 2 minutter.</li>
	<li>Under et biosikkerhetsskap, bruk tang for å plassere segmentene på en steril laboratorieserviett for å tørke dem ut. Når de er tørket, kutt segmentene videre i 0,5 cm stykker.</li>
	<li>Overfør de små segmentene ved hjelp av tang til en 6-brønnsplate fylt med 4 ml forvarmet fordøyelsesløsning per brønn. Inkuber ved 37 °C i 50 minutter. Rist tallerkenen forsiktig for hånd hvert 20. minutt.</li>
	<li>Overfør segmentene ved hjelp av en Pasteur-pipette til et 15 ml konisk rør fylt med 4 ml DMEM. Rist røret manuelt ved fire eller fem sykluser / s i 1 min for å få en encelle suspensjon.</li>
	<li>Filtrer suspensjonen gjennom en 100 μm sil til et 50 ml konisk rør. Sentrifuger filtratet ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Kast supernatanten ved aspirasjon og resuspender cellepelleten i 5 ml med 2 % FBS/PBS. Sentrifuger suspensjonen ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Kast supernatanten ved aspirasjon, resuspender cellepelleten med 12 ml kulturmedium og frø 1 ml per brønn på to 6-brønnsplater. Neste dag, vask og aspirer eventuelle døende celler og erstatt det brukte mediet med friskt medium. NOTAT: For optimal vedlikehold av kulturen anbefales det å bytte medium hver 2. Avhengig av musestamme, genetisk bakgrunn og alder, er det nødvendig med 4 dager til 2 uker for at mesenkymet skal være klar for samkultureksperimenter. For videre samkultureksperimenter bør mesenkymet nå konfluens, og vise flat og fullt strukket cellulær morfologi som vist i figur 2. Generelt er celler med rund morfologi ikke levedyktige eller funksjonelle.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> Figur 1: Disseksjon av mus . (I) Plasser musen i liggende stilling og spray magen med 70% EtOH. Løft bukhuden. (II) Åpne bukhulen i lengderetningen langs midtlinjen. (III) Mens du forsiktig trekker magen, kutt spiserøret. (IV) Klem magen og trekk sakte ut tarmen. (V) Sett spissen av kulespisssaksen inn i lumen og åpne tarmrøret i lengderetningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
3. Mesenkyme-resuspensjon for passasje eller samkultur
<ol><li>Resuspender mesenkymet med 2 ml 0,25% trypsin-0,5 mM EDTA / brønn i en 6-brønnplate. Inkuber i 5 minutter ved 37 °C. Etter inkubering, hvis flere celler ikke allerede har begynt å løsne fra parabolen, inkuber i ekstra 2 minutter.</li>
	<li>Bruk en celleskraper, skrap forsiktig overflaten av brønnen. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør. Tilsett 2 ml DMEM-F12/brønn og pipetter suspensjonen forsiktig opp og ned. MERK: Det er viktig å ikke overfylle røret med mer enn 50% av rørvolumet. Det anbefales derfor å bruke et 15 ml konisk rør fylt med 8 ml suspensjon for annenhver brønn.</li>
	<li>Tell cellene. MERK: En fullstendig konfluent brønn gir mellom 2 × 10 6 celler og 2,5 × 106 celler.</li>
	<li>Fortynn cellesuspensjonen for å oppnå en såtetthet på 3-5 × 105 celler/ml. Sentrifuge i 5 minutter ved 500 × g ved 4 °C og kast supernatanten ved forsiktig aspirasjon. MERK: Det er viktig å fjerne så mye væske som mulig.</li>
	<li>Suspender cellepelleten i forvarmet kulturmedium og plate.</li>
</ol>4. Flowcytometrianalyse for telocyttrensing
<ol><li>Oppnå mesenkymalcellepellet (trinn 2.14). Resuspender cellepelleten i 1 ml FACS-buffer og filtrer gjennom en 40 μm sil.</li>
	<li>Inkuber cellesuspensjonen med allophycocyanin (APC)-konjugert CD326 (1:100), CD45 (1:400) og CD31 (1:250) antistoffer i 400 μL FACS-buffer i 15 minutter ved romtemperatur for å utelukke henholdsvis epitel-, immun- og endotelceller fra typen.</li>
	<li>Vask cellene ved å tilsette 1 ml FACS-buffer og sentrifugerer ved 700 × g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender i 400 μL FACS-buffer og legg til 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 5 mg/ml, 1:1000) for flowcytometrianalyser. Gate enkeltcellene i henhold til SSC-høyde etter SSC-område. Gate DAPI-levende celler og gate ut CD45 + / CD31 + / CD326 + for å sortere GFP + telocytter, som vist i figur 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Her utviklet vi en protokoll for å isolere mesenkym fra musens tynntarm ved hjelp av FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG musemodell, som gjør det mulig for forskere å skille telocytter fra andre mesenkymale celler. Det er noen kritiske trinn å følge i denne protokollen. Først er det viktig å riste røret kraftig i fire eller fem sykluser/s, for å kaste de fleste epitelceller under mesenkyisolering. Inkubasjonstiden for enzymatisk fordøyelse må optimaliseres basert på fordøyelseseffektivitet. Under inkubering skal platene ristes forsiktig horisontalt i noen sekunder hvert 20. minutt. Når vevet blir filamentlignende, må inkubasjonen stoppes ved å gå videre til protokolltrinn 2.12. Eksponering av vevet for lange fordøyelsestider kan føre til lav celle levedyktighet og utbytte. Etter enzymatisk fordøyelse må røret ristes mekanisk for å frigjøre flere enkeltceller i suspensjon; Ideelt sett bør løsningen se overskyet ut, og ingen vevfragmenter skal være synlige. Hvis dette ikke er tilfelle, forleng den enzymatiske fordøyelsen til 60 minutter.
Å holde sterile forhold og unngå potensiell bakteriell forurensning er et av de kritiske trinnene når du arbeider med primær vevskultur. Sterile dissekeringsverktøy, reagenser og buffere må brukes; Hansker må skiftes, og arbeidsområdet må rengjøres når arbeid med dyr er gjort. Når cellesuspensjonen er oppnådd, bør arbeidet utføres under en laminær biologisk hette. Etter plettering bør cellene inkuberes over natten uten forstyrrelser, da dette kan påvirke adherens. I tillegg er det viktig å erstatte kulturmediet en dag etter såing, siden ikke-adherente celler kan påvirke dyrkingens levedyktighet.
Overflatemarkører brukt i denne protokollen reagerte sterkt med sine epitoper; Det er imidlertid mulig at enzymatisk fordøyelse kan påvirke bindingsreaktiviteten, og derfor resulterer FACS-analyse. En annen begrensning av denne protokollen er underrepresentasjonen av muskellaget. For å forbedre effektiviteten av muskellagscelleisolering, anbefaler vi mekanisk separasjon av muskelen fra slimhinnelagene, og separat enzymatisk fordøyelse for hvert av lagene. For å dissosiere epitelet fra stroma, kan enten mekanisk separasjon eller chelateringsmidler (EDTA eller DTT) brukes; Imidlertid har enzymatisk fordøyelse for å oppnå enkeltceller blitt optimalisert i denne protokollen.
Isolering av intestinal mesenkym er tidligere beskrevet8; Skraping av villi med en coverslip ville føre til tap av noen mesenkym sammen med villus, spesielt villus spiss mesenkymale celler som Lgr5 + villus spiss telocytter13. I denne protokollen bruker vi kollagenase type VIII i stedet for dispase II og trypsin i kombinasjon med DNase I, da kollagenase mer effektivt frigjør mesenkymale celler fra matrisen. Selv om det forlenger behandlingstiden (>90 min vs. 35 min), ga de to protokollene lignende cellelevedyktighetsrater; Den nåværende protokollen forbedret utbyttet av mesenkymale celler generelt, og mer spesifikt av telocytfraksjonen. Den nåværende protokollen ga omtrent 10% GFP + telocytter, bekreftet både ved visualisering og ved FACS-analyse, mens den tidligere protokollen ga 2% GFP + telocytter. De største forskjellene mellom gjeldende protokoll og de to referanseprotokollene er listet opp i tilleggstabell S1.
Identifiseringen av FOXL1+GFP+ -celler som subepiteliale telocytter er basert på in vivo-studier . Behovet for å utvikle og modifisere tilgjengelige mesenkymeisolasjonsprotokoller for å produsere høyere utbytte av telocytter, og kunnskapen om hvordan man oppnår dette var basert på vår forståelse av strukturen og funksjonen til FOXL1+ telocytter in vivo, som store celler med lange cellulære projeksjoner nært festet til epitelceller.
Interessant nok utviser ex vivo GFP + telocytter cellulære egenskaper som ligner deres egenskaper in vivo i tarmen og er derfor foreslått å tjene som en ideell støtte for organoid vekst. Selv om denne protokollen hovedsakelig omhandler telocytterisolering fra tynntarmen, kan en lignende protokoll med mindre modifikasjoner brukes og enkelt påføres for kolonmesenkymale celler, slik som den nylig beskrevne MAP3K2-regulerte intestinale stromale cellen (MRISC)12.
Når mesenkymale celler har strukket seg og nådd sammenløp, kan de brukes til flere tilleggsapplikasjoner, for eksempel 3D-samkultur med mus- eller menneskeavledede organoider, ved bruk av vekstfaktorfri Matrigel. Mesenkymet danner vanligvis et nettverk som fullt ut støtter organoiddannelse og vekst uten eksogent vekstfaktortilskudd. Tarmstroma har iboende 3D-funksjoner som kan gi epitelet mekanisk støtte14. Derfor kan denne protokollen også brukes til å isolere mesenkym som skal integreres i et 3D bio-trykt stillas og brukes til videre xenografteksperimenter.

Både tynntarmen og tykktarmen er svært regenerative vev på grunn av tilstedeværelsen av stamceller, som sprer seg og brenner regenerering1. Mesenkymet som omgir epitelet gir strukturell og funksjonell støtte ved å utskille ekstracellulære matriksproteiner og signalmolekyler2, som modulerer responsen til epitelceller. Telocytter er store mesenkymale celler, hovedsakelig beskrevet så langt ved elektronmikroskopi som celler med lange cytoplasmatiske prosesser kalt telopoder, som overlapper for å skape et labyrintisk nettverk 3,4,5,6,7. Nylig har intestinale telocytter som uttrykker transkripsjonsfaktoren FOXL1 dukket opp som en viktig stamcellenisjekomponent som gir Wnt-proteiner, som er avgjørende for stam- og stamcellefunksjon. Intestinale telocytter uttrykker høye nivåer av viktige signalveiproteiner som Wnt, Bmp, Tgfb og Shh, samt mange vekstfaktorer8.
Gitt at telocytter er en kritisk nisjekomponent i stamceller in vivo, vil utvikling av protokoller for å isolere og dyrke dem ex vivo tillate bruk som kilde til signalmolekyler og vekstfaktorer, for å støtte vekst og differensiering ex vivo. Ved hjelp av veletablerte protokoller kan kolon- eller tarmepitelkrypter isoleres og danne 3D-strukturer kjent som organoider 9,10,11. Tredimensjonale organoider representerer et kraftig verktøy for å undersøke både fysiologi og patologi i tarmepitelet ex vivo. I et ex vivo-system er organoider avhengige av eksogen tilskudd av faktorer for overlevelse og vekst10. Isolert mesenkym kan dyrkes med både mus og human-avledede organoider og brukes som en kilde til vekstfaktorer, i stedet for eksogent tilskudd, for bedre å reflektere situasjonen i det opprinnelige vevet. Å studere telocytter ex vivo har mange fordeler ved å undersøke normal eller patologisk cellulær atferd, mekanismer for vevshomeostase og celle-celle-interaksjoner i større detalj.
Selv om protokoller som beskriver hvordan man isolerer mesenkym fra musetarmen er tilgjengelige, er det ikke klart om disse prosedyrene resulterer i effektiv isolering av telocytter. Vellykket isolering av telocytter krever spesielle protokolljusteringer som vil tillate dissosiasjon av den sterke cellecellekontakten mellom telocytter og naboceller uten å påvirke deres levedyktighet. For å overvinne disse begrensningene presenterer denne artikkelen en modifisert protokoll som konsekvent gir en svært levedyktig, encellet suspensjon som inneholder en relativt høy mengde telocytter med tilstrekkelig konserverte antigene og funksjonelle egenskaper. Disse telocytter kan brukes til flere applikasjoner, inkludert samkultur med mus- eller menneskeavledede organoider, for å støtte vekst uten vekstfaktortilskudd. Dette reflekterer i sin tur bedre situasjonen i det opprinnelige vevet.
Vi brukte FOXL1-Cre: Rosa-mTmG musemodell8, der telocytter er merket med en membranbundet versjon av grønt fluorescerende protein (GFP) i grønt, noe som gjør at etterforskeren kan følge telocytter i sin helhet; alle de andre mesenkymale cellene er merket med en membranbundet tdTomato i rødt. Den nåværende protokollen ble modifisert fra en protokoll som isolerer intestinal mesenkym12 for å forbedre telocytutbyttet og levedyktigheten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

Murine tynntarmen, eller kolon mesenkym, er svært heterogen, og inneholder forskjellige celletyper, inkludert blod og lymfatisk endotel, nerver, fibroblaster, myofibroblaster, glatte muskelceller, immunceller og den nylig identifiserte celletypen, telocytter. Telocytter er unike mesenkymale celler med lange cytoplasmatiske prosesser, og når en avstand på titalls til hundrevis av mikron fra cellekroppen. Telocytter har nylig dukket opp som en viktig intestinal stamcelle nisjekomponent, og gir Wnt-proteiner som er essensielle for stam- og stamcelleproliferasjon.
Selv om protokoller om hvordan man isolerer mesenkym fra musetarmen er tilgjengelige, er det ikke klart om disse prosedyrene tillater effektiv isolering av telocytter. Effektiv isolering av telocytter krever spesielle protokolljusteringer som vil tillate dissosiasjon av den sterke cellecellekontakten mellom telocytter og naboceller uten å påvirke deres levedyktighet. Her ble tilgjengelige intestinale mesenkymeisolasjonsprotokoller justert for å støtte den vellykkede isoleringen og kulturen av mesenkym som inneholdt et relativt høyt utbytte av levedyktige encelletelocytter.
Den oppnådde enkeltcellesuspensjonen kan analyseres ved flere teknikker, for eksempel immunfarging, cellesortering, bildebehandling og mRNA-eksperimenter. Denne protokollen gir mesenkym med tilstrekkelig konserverte antigene og funksjonelle egenskaper til telocytter, og kan brukes til flere applikasjoner. For eksempel kan de brukes til samkultur med mus- eller menneskeavledede organoider for å støtte organoid vekst uten vekstfaktortilskudd, for bedre å reflektere situasjonen i det opprinnelige vevet.

Ovennevnte intestinale mesenkymeisolasjonsprotokoll ble modifisert fra protokoller beskrevet i både Wu et al.12 og Shoshkes-Carmel et al.8. Protokollen beskrevet i Wu et al. er for tykktarmen, og den av Shoshkes-Carmel et al. er for tynntarmen, og dermed er fordøyelsestilstanden forskjellig i enzymkombinasjon, arbeidskonsentrasjon og inkubasjonstid mellom disse to protokollene. Her har den beskrevne protokollen blitt brukt til å isolere og dyrke intestinale mesenkymale celler, inkludert telocytter. Kort fortalt dissekerte vi tynntarmen fra tolvfingertarmen til ileum ved hjelp av en FOXL1-Cre: Rosa-mTmG musemodell8, der telocytter ble merket med membran-GFP (grønn), mens andre mesenkymale celler ble merket med membran-tdTomato (rød). Vi dissosierte vevet ved hjelp av fordøye enzymer og frø mesenkymet i en 6-brønnsplate. Etter dissosiasjon mister telocytter sine cellulære egenskaper, og viser rund cellulær morfologi (figur 2A) som gjenspeiles i underkvantifiseringen av GFP+-celler ved dag 1 sammenlignet med påfølgende dager (figur 2F). Etter noen dager viser telocytter en liten strukket cellemorfologi med korte cellulære prosesser (figur 2B,C). Imidlertid, 7-10 dager etter såing, gjenvinner telocytter sine cellulære egenskaper, viser stor strukket cellemorfologi med lange cytoplasmatiske prosesser (figur 2D, E), og er klare til bruk i samkultur med organoider og støtter veksten.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> Figur 2 Dyrket mesenkym isolert fra FOXL1Cre: Rosa-mTmG musetarm. FOXL1+ telocytter er merket med GFP, mens andre mesenkymale celler er tdTomato+. (A-E) Representative bilder av kultivert mesenkym isolert ved hjelp av gjeldende protokoll, belagt i en 6-brønns plate, og avbildet etter 1 (A), 4 (B, C) og 7 (D, E) dager med kultur. Skalastenger = 100 μm. (F) Kvantifisering av GFP / tdTomatcelleforhold per synsfelt (prosenter) på dag 1, 4 og 7 i kultur. Forkortelser: FOXL1 = Forkhead box L1 protein; GFP = grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å evaluere denne isolasjonsprotokollen og avdekke cellesammensetningen, analyserte vi den oppnådde cellesuspensjonen ved flowcytometri (figur 3). Totalt sett var 69% av de isolerte cellene levedyktige basert på DAPI-farging (figur 3 III); ut av de levende cellene representerte 60,9% epitelforurensning og immun- og endotelceller (CD326+, CD45+ og CD31+; Figur 3 IV). Telocyttfraksjonen (GFP+) spredt over henholdsvis 100k og 70k FSC og SSC (figur 3 VI), og representerte nesten 10 % fra det inngjerdede mesenkymet (live CD45-, CD326-, CD31-) (figur 3 V).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> Figur 3: Flowcytometri gatingstrategi for sortering av telocytter fra isolert voksen mus intestinal mesenkym. (I) Hendelser med lav sidespredning ble ekskludert. (II) Enkeltceller ble styrt i henhold til SSC-høyde etter SSC-område. (III) DAPI+-hendelser ble inngjerdet for å ekskludere døde celler fra sorteringen. (IV) DAPI-CD45+/CD326+/CD31+-hendelser ble kontrollert for å ekskludere henholdsvis immun-, epitel- og endotelceller. (V) GFP+ telocytter utgjorde 10,3% av DAPI- CD45-/CD326-/CD31- cellene. (VI) Back-gating-analyse avslørte koordinatene til GFP+-telocytter i et FSC-A/SSC-A-plott. Forkortelser: SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-H = side scatter-peak høyde; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein; APC = allophycocyanin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Parallelt isolerte vi også mesenkym fra en villtype (WT) C57Bl6 musetarm, hvor telocyttfraksjonen ble evaluert ved å bruke en kombinasjon av overflatemarkører tidligere analysert på mesenkym isolert fra en FOXL1Cre: Rosa-mTmG musemodell, der telocyttfraksjonen var GFP-merket. Vi fant at en undergruppe av telocytter kan defineres ved positiv farging av CD201 og podoplanin (GP38) (figur 4). Videre bekreftet bruk av disse markørene i immunfarging 1 dag etter isolasjon og kultur at selv om cellene ennå ikke viste sine cellulære egenskaper, oppnådde de uttrykket av disse molekylære markørene, som viste farging i 70% -80% av GFP + telocytter (figur 5).
Telocytfraksjonen definert av overflatemarkører er ikke identisk med den som oppnås ved bruk av den FOXL1-drevne reportermusen; Telocytten er svært heterogen og inneholder flere undergrupper. Det er nødvendig å kombinere overflatemarkøren med FOXL1-merking for telocytdefinisjon. I tynntarmen til FOXL1Cre: Rosa-mTmG-musen er 60%-70% av GFP+ -cellene CD201-positive, og 65%-80% er positive for GP38. Ved bruk av overflatemarkører er det viktig å merke seg at uhensiktsmessig lagring og repeterende frysetinesykluser av antistoffer reduserer bindingseffektiviteten. I tillegg kan enzymatisk fordøyelse forstyrre overflatemarkøruttrykk. Vi observerte at uttrykket av CD138, et transmembranproteoglykan uttrykt på mesenkymale celler, ble forstyrret og sterkt redusert med dissosiasjon.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> Figur 4: FACS-analyse av encellet mesenkymesuspensjon isolert fra FOXL1Cre: Rosa-mTmG-mus tynntarm ved bruk av gjeldende protokoll. FACS-analyse på (I-II) enkeltceller, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+-celler, som viser at (VII) 65,3 % av GFP+ og 31,2 % av Tomato+ er positive for GP38, mens (VIII) 60,5 % av GFP+ og 22,6 % av Tomato+ er positive for CD201. Forkortelser: SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-H = side scatter-peak høyde; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> Figur 5: Dag én kultivert mesenkym, fiksert og farget for mesenkymale markører. (A-D) Representative bilder av kultivert mesenkym farget for GP38. (F-I) Representative bilder av kultivert mesenkym farget for CD201. Skalastenger = 100 μm. (E) Kvantifisering av Tomato+ GP38+ og Tomato+ CD201+ dobbeltpositiv fra totalt Tomato+. (J) Kvantifisering av GFP+ GP38+ og GFP+ CD201+ dobbeltpositiv fra total GFP+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Løsning A:</td>
			<td colspan="4">HBSS supplert med 2% FBS, 1 mM DL-dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8,0).</td>
		</tr><tr><td>Komplementert medium 1640 (CM1640):</td>
			<td colspan="4">RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, penn/streptokokker (100 enheter penicillin/ml, 100 μg streptomycin/ml).</td>
		</tr><tr><td>Fordøyelse løsning:</td>
			<td colspan="4">100 U/ml kollagenase type VIII, 75 mg/ml DNase I i 4 ml forvarmet CM1640. Merk: Legg til kollagenase og DNase I like før fordøyelsesprosedyren starter.</td>
		</tr><tr><td>Kultur medier:</td>
			<td colspan="4">DMEM-F12 medier supplert med 10 μg/ml gentamicin, 10 mM HEPES, glutamin, penn/streptokokker (100 enheter penicillin/ml, 100 μg streptomycin/ml).</td>
		</tr><tr><td>FACS-buffer:</td>
			<td colspan="4">PBS supplert med 5% FBS og 1 mM EDTA.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Sammensetning av alle løsningene som brukes i protokollen. 
Tilleggstabell S1: De største forskjellene mellom gjeldende protokoll og de to referanseprotokollene er listet opp her. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes at JoVE.com

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Her presenterer vi en protokoll for å isolere murine intestinal mesenkym, inkludert telocytter. Disse kan brukes til flere applikasjoner, for eksempel samkultur med mus eller menneskeavledede organoider, for å støtte vekst og bedre reflektere situasjonen i det opprinnelige vevet.

Isolering av murine intestinal mesenkym som resulterer i et høyt utbytte av telocytter

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Vår protokoll for isolering av intestinal mesenkym resulterer i et høyt utbytte av telocytter. Denne metoden gir en første plattform for å studere celle-celle-interaksjon som involverer telocytter i homeostase og sykdom. Telocytter er unike celler som er følsomme for tilgjengelige vevsdissosiasjonsprotokoller.Derfor er den største fordelen med denne teknikken isoleringen av mesenkym, inkludert berikede levedyktige telocytter. Mesenkym, inkludert telocytter, kan tjene som en kilde for signalmolekyler og vekstfaktorer som kreves for organisert vekst ex vivo. For å begynne, vask tarmen, skilt fra en euthanized mus, i en petriskål som inneholder kald, steril PBS.Legg tarmen i en petriskål. Og bruk kulespisssaks, åpne tarmrøret i lengderetningen og vask ut avføringen. Overfør tarmen til en ny tallerken som inneholder fersk, kald PBS.Etter å ha vasket tarmen en gang til, kutt tynntarmen i en centimeter lange segmenter, og overfør dem til et 15 milliliter konisk rør fylt med åtte milliliter PBS. Rist røret manuelt ved en eller to sykluser per sekund i ett minutt. Hell løsningen i en petriskål.Og ved hjelp av tang, overfør segmentet til et 50 milliliter konisk rør fylt med 20 ml løsning A.Plasser rørene i en orbital shaker-inkubator ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Etter inkubering, rist røret kraftig for hånd ved fire eller fem sykluser per sekund i ett minutt for å dissociere epitelet. Gjenta dette trinnet en gang til.Etter å ha kuttet og vasket fragmentene som vist tidligere, overfør dem til et nytt 50 milliliter rør fylt med 10 ml steril PBS, og inverter røret ved en eller to sykluser per sekund i ett minutt. Hell løsningen i en petriskål. Overfør segmentene til et nytt 15 milliliter rør fylt med 10 milliliter steril PBS, og vipp forsiktig opp og ned ved en eller to sykluser per sekund i to minutter.Under et biosikkerhetsskap, bruk tang for å plassere segmentene på en steril laboratorieserviett for å tørke dem. Når de er tørket, kutt segmentene ytterligere i stykker. Overfør de kuttede stykkene med tang til en seksbrønnsplate fylt med fire milliliter forvarmet fordøyelsesløsning per brønn.Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 50 minutter, og rist forsiktig platen manuelt hvert 20. minutt. Overfør deretter bitene ved hjelp av en Pasteur-pipette til et 15 milliliter konisk rør fylt med fire milliliter DMEM. Rist røret manuelt ved fire eller fem sykluser per sekund i ett minutt for å få en enkelt celle suspensjon.Filtrer suspensjonen gjennom en 100 mikrometer sil i et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuge filtratet ved 700 g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten ved aspirasjon, og resuspender cellepelleten i fem milliliter 2% FBS / PBS.Etter sentrifugering av suspensjonen en gang til ved 700 g i fem minutter, kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 12 ml kulturmedium. Til slutt frø cellesuspensjonen i seksbrønnsplater. Etter mesenkymedosiasjon mister telocytter sine cellulære egenskaper, viser rund cellulær morfologi, og reflekterer mindre antall GFP-positive celler på dag én sammenlignet med de følgende dagene.Noen dager senere utviser telocytter en liten, strukket cellemorfologi med korte cellulære prosesser. Etter syv til 10 dager med såing, gjenvinner telocytter sine cellulære egenskaper, og viser stor, strukket cellemorfologi med lange cytoplasmatiske prosesser. Flowcytometri avslører cellesammensetning.Totalt sett var 69% av de isolerte cellene levedyktige basert på DAPI-farging. Og av disse representerte 60,9% epitelforurensning og immun- og endotelceller. Telocytfraksjonen spredt over henholdsvis 100k og 70k FSC og SSC, og representerte nesten 10% av gated mesenkymet.FACS-analyse viste at undergruppen av telocytter kan defineres ved positiv farging til CD201 og GP38. Immunfarging av endagsdyrket mesenkym ved bruk av disse markørene viste uttrykk for disse molekylære markørene, til tross for at cellene ikke viste sine cellulære egenskaper. Denne prosedyren resulterer i en levedyktig enkeltcellesuspensjon av stromale celler, som ikke bare kan brukes til 2D-kultur, men til alle andre applikasjoner, for eksempel 3D-samkultur med organoider eller bioprinting.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Funksjonell Vurdering av intestinal motilitet og tarmveggen Betennelse i Gnagere: Analyser i en standardisert modell for Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for forskning; Innhenting Tilstrekkelig Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoskopi for<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging av Carcinogenesis og vurdering av Intestinal sårheling og Betennelse

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Isolasjon og Eksisjon av murine Aorta; En allsidig teknikk i Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murine modell av intestinal iskemi-reperfusjon Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-mediert tomografi av kvantifisering av Macrophage-relaterte Murine intestinale betennelsen

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Elektrofysiologiske vurdering av Murine Atria med høyoppløselige optiske kartlegging

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal stamcelleforskningen isolasjon og kultur i en Porcine modell av Segmentinformasjon liten Intestinal Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolering og rensing av murine CARDIAC Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...