Name: isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00
Duration: 6 min 35 s
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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Israel Science Foundation (MSC personal grant) e pelo programa conjunto entre a Israel Science Foundation e a National Natural Science Foundation of China.

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Hebraica de Jerusalém.
1. Preparação de reagentes e tampões
<ol><li>Pré-aqueça em banho-maria a 37 °C.</li>
	<li>Prepare todas as soluções da Tabela 1.</li>
</ol>2. Isolamento do mesênquima intestinal
<ol><li>Eutanásia do camundongo por inalação de CO2 , imediatamente seguida de luxação cervical.</li>
	<li>Coloque o rato em decúbito dorsal e borrife o abdómen com EtOH a 70%. Levantar a pele abdominal e cortar longitudinalmente ao longo da linha média para expor a cavidade peritoneal (ver Figura 1 I,II).</li>
	<li>Localize o estômago, corte do esôfago e puxe lentamente o intestino para fora da cavidade peritoneal. Limpe o excesso de gordura e tecido conjuntivo usando pinças. Excisar o intestino delgado do duodeno a aproximadamente 0,5 cm do ceco (Figura 1 III,IV).</li>
	<li>Lave o intestino em uma placa de Petri contendo PBS estéril frio. Com tesoura esférica, abrir longitudinalmente o tubo intestinal e lavar as fezes (Figura 1 V). Transfira o intestino para um novo prato contendo PBS fresco e frio e lave novamente.</li>
	<li>Cortar o intestino delgado em segmentos de 1 cm de comprimento e transferir para um tubo cônico de 15 mL preenchido com 8 mL de PBS. Agite o tubo manualmente a um ou dois ciclos/s durante 1 min.</li>
	<li>Transfira os segmentos com pinça para um tubo cônico de 50 mL preenchido com 20 mL de solução recém-fabricada A (ver Tabela 1). Colocar os tubos numa incubadora de agitação orbital a 37 °C durante 20 minutos. Após a incubação, agitar vigorosamente o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos/s por 1 min para dissociar o epitélio.</li>
	<li>Repita a etapa 2.6 uma vez.</li>
	<li>Transfira os segmentos para um novo tubo de 50 mL preenchido com 10 mL de PBS estéril e inverta o tubo em um ou dois ciclos/s por 1 min.</li>
	<li>Transfira os segmentos para um novo tubo de 15 mL preenchido com 10 mL de PBS estéril e incline suavemente para cima e para baixo em um ou dois ciclos/s por 2 min.</li>
	<li>Sob um armário de biossegurança, use pinças para colocar os segmentos em um lenço de laboratório estéril para secá-los. Depois de secos, corte os segmentos em pedaços de 0,5 cm.</li>
	<li>Transfira os pequenos segmentos usando pinça para uma placa de 6 poços preenchida com 4 mL de solução de digestão pré-aquecida por poço. Incubar a 37 °C durante 50 min. Agite suavemente o prato com a mão a cada 20 min.</li>
	<li>Transfira os segmentos usando uma pipeta de Pasteur para um tubo cônico de 15 mL preenchido com 4 mL de DMEM. Agite o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos/s durante 1 min para obter uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Filtrar a suspensão através de um filtro de 100 μm para um tubo cónico de 50 ml. Centrifugar o filtrado a 700 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet celular em 5 mL de SFB/PBS a 2%. Centrifugar a suspensão a 700 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante por aspiração, ressuspender o pellet de células com 12 mL de meio de cultura e semear 1 mL por poço em duas placas de 6 poços. No dia seguinte, lave e aspirar as células moribundas e substitua o meio gasto por meio fresco. OBS: Para uma ótima manutenção da cultura, recomenda-se a troca do meio a cada 2 dias. Dependendo da cepa do camundongo, do background genético e da idade, são necessários de 4 dias a 2 semanas para que o mesênquima esteja pronto para experimentos de co-cultura. Para experimentos posteriores de co-cultura, o mesênquima deve atingir confluência, exibindo morfologia celular plana e totalmente esticada, como mostrado na Figura 2. Em geral, células com morfologia arredondada não são viáveis ou funcionais.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg"> Figura 1: Dissecção em camundongo. (I) Coloque o camundongo em decúbito dorsal horizontal e borrife o abdome com EtOH 70%. Levante a pele abdominal. (II) Abrir a cavidade peritoneal longitudinalmente ao longo da linha média. (III) Ao puxar suavemente o estômago, corte o esôfago. (IV) Aperte o estômago e puxe lentamente o intestino. (V) Inserir a ponta da tesoura esferográfica no lúmen e abrir longitudinalmente o tubo intestinal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Ressuspensão de mesênquima por passagem ou co-cultura
<ol><li>Ressuspender o mesênquima com 2 mL de tripsina a 0,25% - EDTA 0,5 mM/poço em placa de 6 poços. Incubar durante 5 min a 37 °C. Após a incubação, se várias células ainda não tiverem começado a se desprender do prato, incube por mais 2 min.</li>
	<li>Usando um raspador de células, raspe suavemente a superfície do poço. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar 2 mL de DMEM-F12/poço e pipetar suavemente a suspensão para cima e para baixo. NOTA: É importante não encher demais o tubo com mais de 50% do volume do tubo. Portanto, recomenda-se o uso de um tubo cônico de 15 mL preenchido com 8 mL de suspensão para cada dois poços.</li>
	<li>Conte as células. NOTA: Um poço totalmente confluente produz entre 2 × 10 6 células e 2,5 × 106 células.</li>
	<li>Diluir a suspensão celular para atingir uma densidade de semeadura de 3-5 × 105 células/mL. Centrifugar durante 5 min a 500 × g a 4 °C e eliminar o sobrenadante por aspiração cuidadosa. NOTA: É importante remover o máximo de líquido possível.</li>
	<li>Ressuspender o pellet celular em meio de cultura pré-aquecido e placa.</li>
</ol>4. Análise por citometria de fluxo para purificação de telocitos
<ol><li>Obter o pellet de células mesenquimais (passo 2.14). Ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão FACS e filtrar através de um filtro de 40 μm.</li>
	<li>Incubar a suspensão celular com anticorpos aloficocianina (APC) conjugados CD326 (1:100), CD45 (1:400) e CD31 (1:250) em 400 μL de tampão FACS por 15 min à temperatura ambiente para excluir células epiteliais, imunes e endoteliais, respectivamente, do tipo.</li>
	<li>Lavar as células adicionando 1 ml de tampão FACS e girar para baixo a 700 × g durante 5 minutos a 4 °C. Ressuspender em 400 μL de tampão FACS e adicionar 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 5 mg/mL, 1:1.000) para análise por citometria de fluxo. Portar as células individuais de acordo com a altura do CSC por área do CSC. Portar as células vivas DAPI- e retirar CD45+/CD31+/CD326+ para classificar os telócitos GFP+, como mostrado na Figura 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., N&#228;thke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase.">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li><li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease.">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li><li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity:+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+(ICC),+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+(ICLC)+to+TELOCYTES.">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li><li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+endocardium:+electron+microscope+evidence.">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li><li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+skin&#8212;are+they+involved+in+skin+regeneration.">Telocytes in human skin&#8212;are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li><li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+pleura:+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy.">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li><li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telocytes+in+human+epicardium.">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li><li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts.">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett&#8217;s+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#8217;s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+application,+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids.">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche.">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li><li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5++are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip.">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).</li><li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+in+colon+cancer.">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Aqui, desenvolvemos um protocolo para isolar o mesênquima do intestino delgado de camundongos usando o modelo de camundongo FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, que permite aos pesquisadores distinguir telócitos de outras células mesenquimais. Existem alguns passos críticos a seguir neste protocolo. Primeiro, é importante agitar vigorosamente o tubo em quatro ou cinco ciclos/s, para descartar a maioria das células epiteliais durante o isolamento do mesênquima. O tempo de incubação para digestão enzimática deve ser otimizado com base na eficiência da digestão. Durante a incubação, as placas devem ser agitadas suavemente horizontalmente por alguns segundos a cada 20 min. Uma vez que o tecido se torna filamentoso, a incubação deve ser interrompida procedendo-se ao protocolo passo 2.12. A exposição do tecido por longos tempos de digestão pode resultar em baixa taxa de viabilidade celular e rendimento. Após a digestão enzimática, o tubo deve ser agitado mecanicamente para liberar mais células individuais em suspensão; Idealmente, a solução deve parecer turva e nenhum fragmento de tecido deve ser visível. Se este não for o caso, prolongue a digestão enzimática para 60 min.
Manter condições estéreis e evitar possíveis contaminações bacterianas é uma das etapas críticas quando se trabalha com cultura de tecidos primários. Devem ser utilizados ferramentas de dissecação estéreis, reagentes e tampões; as luvas devem ser trocadas e a área de trabalho deve ser limpa quando o trabalho com animais é feito. Uma vez obtida a suspensão celular, o trabalho deve ser realizado sob capuz biológico laminar. Após o plaqueamento, as células devem ser incubadas durante a noite sem distúrbios, pois isso pode afetar a adesão. Além disso, é importante substituir o meio de cultura um dia após a semeadura, uma vez que células não aderentes podem afetar a viabilidade da cultura.
Os marcadores de superfície utilizados neste protocolo reagiram fortemente com seus epítopos; no entanto, é possível que a digestão enzimática possa afetar a reatividade de ligação e, portanto, os resultados da análise FACS. Outra limitação desse protocolo é a sub-representação da camada muscular. Para melhorar a eficiência do isolamento celular da camada muscular, recomendamos a separação mecânica do músculo das camadas mucosas e a digestão enzimática separada para cada uma das camadas. Para dissociar o epitélio do estroma, pode-se utilizar separação mecânica ou agentes quelantes (EDTA ou TDT); no entanto, a digestão enzimática para a obtenção de células isoladas foi otimizada neste protocolo.
O isolamento do mesênquima intestinal já foi descritopreviamente8; raspar as vilosidades com um lamínulo causaria a perda de alguns mesênquimas ao lado das vilosidades, especialmente células mesenquimais da ponta das vilosidades, como os telócitos da ponta das vilosidades Lgr5+ 13. Neste protocolo, utilizamos colagenase tipo VIII em vez de dispase II e tripsina em combinação com DNase I, pois a colagenase libera mais eficientemente células mesenquimais da matriz. Embora prolongue o tempo de processamento (>90 min vs. 35 min), os dois protocolos produziram taxas de viabilidade celular semelhantes; O protocolo atual melhorou o rendimento das células mesenquimais em geral e, mais especificamente, da fração telocita. O protocolo atual produziu aproximadamente 10% de telócitos GFP+, confirmados tanto pela visualização quanto pela análise FACS, enquanto o protocolo anterior produziu telócitos GFP+ a 2%. As principais diferenças entre o protocolo atual e os dois protocolos de referência estão listadas na Tabela Suplementar S1.
A identificação de células FOXL1+GFP+ como telócitos subepiteliais é baseada em estudos in vivo . A necessidade de desenvolver e modificar os protocolos de isolamento de mesênquima disponíveis para produzir maiores rendimentos de telócitos, e o conhecimento de como conseguir isso foi baseado em nossa compreensão da estrutura e função dos telócitos FOXL1+ in vivo, como grandes células com longas projeções celulares intimamente ligadas às células epiteliais.
Curiosamente, os telócitos ex vivo da GFP+ exibem características celulares semelhantes às suas características in vivo no intestino e, portanto, são sugeridos para servir como um suporte ideal para o crescimento de organoides. Embora este protocolo discuta principalmente o isolamento de telocitos do intestino delgado, um protocolo semelhante com pequenas modificações pode ser usado e facilmente aplicado para células mesenquimais do cólon, como o recentemente descrito MAP3K2-regulated intestinal stromal cell (MRISC)12.
Uma vez que as células mesenquimais tenham se esticado e atingido a confluência, elas podem ser usadas para várias aplicações adicionais, como co-cultivo 3D com organoides derivados de camundongos ou humanos, usando Matrigel livre de fator de crescimento. O mesênquima tipicamente forma uma rede que suporta totalmente a formação e o crescimento de organoides sem suplementação de fator de crescimento exógeno. O estroma intestinal possui características 3D intrínsecas que podem fornecer suporte mecânico aoepitélio14. Portanto, este protocolo também pode ser usado para isolar o mesênquima para ser integrado em um arcabouço bioimpresso 3D e utilizado para experimentos posteriores com xenoenxerto.

Tanto o intestino delgado quanto o cólon são tecidos altamente regenerativos devido à presença de células-tronco, que proliferam e favorecem aregeneração1. O mesênquima que envolve o epitélio fornece suporte estrutural e funcional por meio da secreção de proteínas da matriz extracelular e moléculas sinalizadoras2, que modulam a resposta das células epiteliais. Os telócitos são células mesenquimais de grande porte, descritas principalmente pela microscopia eletrônica como células com processos citoplasmáticos longos denominados telópodes, que se sobrepõem para criar uma rede labiríntica3,4,5,6,7. Recentemente, telócitos intestinais expressando o fator de transcrição FOXL1 emergiram como um importante componente de nicho de células-tronco fornecendo proteínas Wnt, que são cruciais para a função das células-tronco e progenitoras. Os telócitos intestinais expressam altos níveis de proteínas-chave da via de sinalização, como Wnt, Bmp, Tgfb e Shh, bem como muitos fatores de crescimento8.
Dado que os telócitos são um componente crítico do nicho de células-tronco in vivo, o desenvolvimento de protocolos para isolá-los e cultivá-los ex vivo permitirá seu uso como fonte de sinalização de moléculas e fatores de crescimento, para apoiar o crescimento e diferenciação ex vivo. Utilizando protocolos bem estabelecidos, criptas epiteliais do cólon ou intestino podem ser isoladas e formar estruturas 3D conhecidas como organoides9,10,11. Os organoides tridimensionais representam uma poderosa ferramenta para investigar tanto a fisiologia quanto a patologia do epitélio intestinal ex vivo. Em um sistema ex vivo, os organoides dependem da suplementação exógena de fatores de sobrevivência e crescimento10. O mesênquima isolado pode ser cultivado com organoides derivados de camundongos e humanos e usado como fonte de fatores de crescimento, em vez de suplementação exógena, para melhor refletir a situação no tecido original. O estudo ex vivo dos telócitos traz inúmeros benefícios na investigação de comportamentos celulares normais ou patológicos, mecanismos de homeostase tecidual e interações célula-célula com maior detalhe.
Embora protocolos descrevendo como isolar o mesênquima do intestino de camundongos estejam disponíveis, não está claro se esses procedimentos resultam no isolamento eficiente de telócitos. O sucesso do isolamento dos telócitos requer ajustes especiais de protocolo que permitam dissociar o forte contato célula-célula entre os telócitos e as células vizinhas, sem afetar sua viabilidade. Para superar essas limitações, este trabalho apresenta um protocolo modificado que consistentemente produz uma suspensão unicelular altamente viável contendo uma quantidade relativamente alta de telócitos com propriedades antigênicas e funcionais suficientemente conservadas. Esses telócitos podem ser usados para várias aplicações, incluindo co-cultivo com organoides derivados de camundongos ou humanos, para apoiar o crescimento sem suplementação de fator de crescimento. Isso, por sua vez, reflete melhor a situação no tecido original.
Utilizou-se o camundongo FOXL1-Cre: Rosa-mTmG modelo8, no qual os telócitos são marcados com uma versão ligada à membrana da proteína fluorescente verde (GFP) em verde, o que permite ao investigador acompanhar os telócitos em sua totalidade; todas as outras células mesenquimais são marcadas com um tdTomato ligado à membrana em vermelho. O protocolo atual foi modificado a partir de um protocolo de isolamento do mesênquima intestinal12 para melhorar o rendimento e a viabilidade do telocita.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD326</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m Nylon Yellow</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-170-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-862-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-017-5A</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine intestinal mesenchyme resulting in a high yield of telocytes

O intestino delgado murino, ou mesênquima do cólon, é altamente heterogêneo, contendo tipos celulares distintos, incluindo endotélio sanguíneo e linfático, nervos, fibroblastos, miofibroblastos, células musculares lisas, células imunes e o tipo celular recentemente identificado, telócitos. Os telócitos são células mesenquimais únicas com processos citoplasmáticos longos, atingindo uma distância de dezenas a centenas de mícrons do corpo celular. Recentemente, os telócitos emergiram como um importante componente de nicho de células-tronco intestinais, fornecendo proteínas Wnt essenciais para a proliferação de células-tronco e progenitoras.
Embora protocolos sobre como isolar o mesênquima do intestino de camundongos estejam disponíveis, não está claro se esses procedimentos permitem o isolamento eficiente dos telócitos. Isolar telócitos eficientemente requer ajustes especiais de protocolo que permitam dissociar o forte contato célula-célula entre telócitos e células vizinhas sem afetar sua viabilidade. Aqui, os protocolos de isolamento de mesênquima intestinal disponíveis foram ajustados para apoiar o isolamento e a cultura bem-sucedidos de mesênquima contendo um rendimento relativamente alto de telócitos unicelulares viáveis.
A suspensão unicelular obtida pode ser analisada por diversas técnicas, como imunomarcação, triagem celular, exames de imagem e experimentos de RNAm. Este protocolo produz mesênquima com propriedades antigênicas e funcionais dos telócitos suficientemente conservadas, podendo ser utilizado para diversas aplicações. Por exemplo, eles podem ser usados para co-cultura com organoides derivados de camundongos ou humanos para apoiar o crescimento de organoides sem suplementação de fator de crescimento, para refletir melhor a situação no tecido original.

O protocolo de isolamento do mesênquima intestinal acima foi modificado a partir dos protocolos descritos tanto em Wu et al.12 quanto em Shoshkes-Carmel et al.8. O protocolo descrito em Wu et al., é para o cólon, e o de Shoshkes-Carmel et al., é para o intestino delgado, portanto, a condição de digestão é diferente na combinação enzimática, concentração de trabalho e tempo de incubação entre esses dois protocolos. Aqui, o protocolo descrito tem sido usado com sucesso para isolar e cultivar células mesenquimais intestinais, incluindo telócitos. Resumidamente, dissecamos o intestino delgado do duodeno ao íleo usando um camundongo FOXL1-Cre: Rosa-mTmG modelo8, no qual os telócitos foram marcados com membrana-GFP (verde), enquanto outras células mesenquimais foram marcadas com membrana-tdTomato (vermelho). Dissociamos o tecido usando enzimas digestoras e semeamos o mesênquima em uma placa de 6 poços. Após a dissociação, os telócitos perdem suas características celulares, apresentando morfologia celular arredondada (Figura 2A), o que se reflete na subquantificação das células GFP+ no dia 1 em comparação com os dias seguintes (Figura 2F). Após alguns dias, os telócitos exibem uma pequena morfologia celular esticada com processos celulares curtos (Figura 2B,C). No entanto, 7-10 dias após a semeadura, os telócitos recuperam suas características celulares, apresentando grande morfologia celular esticada com processos citoplasmáticos longos (Figura 2D,E), e estão prontos para serem usados em co-cultivo com organoides e apoiar seu crescimento.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg"> Figura 2: Cultivo de mesênquima isolado de FOXL1Cre: Rosa-mTmG intestino de camundongo. Os telócitos FOXL1+ são marcados com GFP, enquanto outras células mesenquimais são tdTomato+. (A-E) Imagens representativas de mesênquima cultivado isolado usando o protocolo atual, plaqueadas em uma placa de 6 poços e imageadas após 1 (A), 4 (B,C) e 7 (D,E) dias de cultura. Barras de escala = 100 μm. (F) Quantificação da razão GFP/tdCélulas de tomate por campo de visão (porcentagens) nos dias 1, 4 e 7 de cultura. Abreviações: FOXL1 = Forkhead box L1 protein; GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para avaliar este protocolo de isolamento e revelar a composição celular, analisamos a suspensão celular obtida por citometria de fluxo (Figura 3). No geral, 69% das células isoladas foram viáveis com base na coloração DAPI (Figura 3 III); das células vivas, 60,9% representaram contaminação epitelial e células imunes e endoteliais (CD326+, CD45+ e CD31+; Figura 3 IV). A fração telocita (GFP+) dispersou acima de 100k e 70k FSC e SSC, respectivamente (Figura 3 VI), e representou quase 10% do mesênquima fechado (CD45-, CD326-, CD31-) (Figura 3 V).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg"> Figura 3: Estratégia de sincronização por citometria de fluxo para triagem de telócitos do mesênquima intestinal isolado de camundongos adultos. (I) Eventos de dispersão lateral de baixo nível foram excluídos. (II) Células isoladas foram agrupadas de acordo com a altura do CSC pela área do CSC. (III) Os eventos DAPI+ foram fechados para excluir células mortas do tipo. (IV) Os eventos DAPI-CD45+/CD326+/CD31+ foram agrupados para excluir células imunológicas, epiteliais e endoteliais, respectivamente. (V) Os telócitos GFP+ representaram 10,3% das células DAPI- CD45-/CD326-/CD31-. (VI) A análise de back-gating revelou as coordenadas dos telócitos GFP+ em um gráfico FSC-A/SSC-A. Abreviações: SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão anterior; SSC-H = altura do pico de dispersão lateral; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFP = proteína fluorescente verde; APC = aloficocianina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em paralelo, também isolamos o mesênquima de um intestino selvagem de camundongo C57Bl6 selvagem, no qual a fração telocítica foi avaliada usando uma combinação de marcadores de superfície previamente analisados em mesênquima isolado de um modelo de camundongo FOXL1Cre: Rosa-mTmG, no qual a fração telocita foi marcada com GFP. Observamos que um subgrupo dos telócitos pode ser definido por uma coloração positiva para CD201 e podoplanina (GP38) (Figura 4). Além disso, a utilização desses marcadores na imunomarcação 1 dia após o isolamento e cultura confirmou que, embora as células ainda não apresentassem suas características celulares, obtiveram a expressão desses marcadores moleculares, mostrando coloração em 70%-80% dos telócitos GFP+ (Figura 5).
A fração de telocitos definida pelos marcadores de superfície não é idêntica àquela obtida usando o mouse repórter acionado por FOXL1; O telocíto é altamente heterogêneo e contém vários subconjuntos. É necessário combinar o marcador de superfície com a marcação FOXL1 para definição de telocíto. No intestino delgado do camundongo FOXL1Cre: Rosa-mTmG, 60%-70% das células GFP+ são CD201 positivas e 65%-80% são positivas para GP38. Ao usar marcadores de superfície, é importante notar que o armazenamento inadequado e ciclos repetitivos de congelamento-descongelamento de anticorpos diminuem a eficiência de ligação. Além disso, a digestão enzimática pode interromper a expressão de marcadores de superfície. Observamos que a expressão de CD138, um proteoglicano transmembrana expresso nas células mesenquimais, foi interrompida e diminuiu muito com a dissociação.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg"> Figura 4: Análise FACS de suspensão de mesênquima unicelular isolada de FOXL1Cre: Rosa-mTmG intestino delgado de camundongos usando o protocolo atual. A análise FACS em células (I-II) monocelulares, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+, mostrando que (VII) 65,3% das GFP+ e 31,2% das Tomato+ são positivas para GP38, enquanto (VIII) 60,5% das GFP+ e 22,6% das Tomato+ são positivas para CD201. Abreviações: SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão anterior; SSC-H = altura do pico de dispersão lateral; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFP = proteína fluorescente verde; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg"> Figura 5: Mesenquima cultivado no primeiro dia, fixado e corado para marcadores mesenquimais. (A-D) Imagens representativas do mesênquima cultivado corado para GP38. (F-I) Imagens representativas do mesênquima cultivado corado para CD201. Barras de escala = 100 μm. (E) Quantificação de Tomate+ GP38+ e Tomate+ CD201+ duplo-positivo do total de Tomate+. (J) Quantificação de GFP+ GP38+ e GFP+ CD201+ duplamente positiva do total GFP+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solução A:</td>
			<td colspan="4">HBSS suplementado com 2% FBS, 1 mM DL-ditiotreitol (TDT), 2 mM EDTA (pH 8,0).</td>
		</tr><tr><td>Meio complementado 1640 (CM1640):</td>
			<td colspan="4">Meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, Pen/Strep (100 unidades penicilina/mL, 100 μg estreptomicina/mL).</td>
		</tr><tr><td>Solução de digestão:</td>
			<td colspan="4">100 U/mL de colagenase tipo VIII, 75 mg/mL de DNase I em 4 mL de CM1640 pré-aquecido. Nota: Adicione colagenase e DNase I pouco antes do início do procedimento de digestão.</td>
		</tr><tr><td>Meios de cultura:</td>
			<td colspan="4">DMEM-F12 suplementado com 10 μg/mL de gentamicina, 10 mM HEPES, glutamina, Pen/Strep (100 unidades de penicilina/mL, 100 μg de estreptomicina/mL).</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS:</td>
			<td colspan="4">PBS suplementado com 5% de SFB e 1 mM de EDTA.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Composição de todas as soluções utilizadas no protocolo. 
Tabela Suplementar S1: As principais diferenças entre o protocolo atual e os dois protocolos de referência estão listadas aqui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Nosso protocolo de isolamento do mesênquima intestinal resulta em alto rendimento de telócitos. Este método oferece uma plataforma inicial para estudar a interação célula-célula envolvendo telócitos na homeostase e doença. Os telócitos são células únicas sensíveis aos protocolos de dissociação tecidual disponíveis.Portanto, a principal vantagem desta técnica é o isolamento do mesênquima, incluindo telócitos viáveis enriquecidos. Mesenquima, incluindo telocíto, pode servir como uma fonte para moléculas de sinalização e fatores de crescimento necessários para o crescimento organizado ex vivo. Para começar, lave o intestino, separado de um rato eutanasiado, em uma placa de Petri contendo PBS frio e estéril.Coloque o intestino em uma placa de Petri. E usando uma tesoura de ponta de bola, abra o tubo intestinal longitudinalmente e lave as fezes. Transfira o intestino para um novo prato contendo PBS fresco e frio.Depois de lavar o intestino mais uma vez, corte o intestino delgado em segmentos de um centímetro de comprimento e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com oito mililitros de PBS. Agite o tubo manualmente a um ou dois ciclos por segundo durante um minuto. Despeje a solução em uma placa de Petri.E usando pinças, transfira o segmento para um tubo cônico de 50 mililitros preenchido com 20 mililitros de Solução A.Coloque os tubos em uma incubadora de agitador orbital a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, agitar vigorosamente o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos por segundo durante um minuto para dissociar o epitélio. Repita esta etapa mais uma vez.Depois de cortar e lavar os fragmentos, como demonstrado anteriormente, transfira-os para um novo tubo de 50 mililitros preenchido com 10 mililitros de PBS estéril e inverta o tubo em um ou dois ciclos por segundo durante um minuto. Despeje a solução em uma placa de Petri. Transfira os segmentos para um novo tubo de 15 mililitros preenchido com 10 mililitros de PBS estéril e incline suavemente para cima e para baixo em um ou dois ciclos por segundo durante dois minutos.Sob um armário de biossegurança, use pinças para colocar os segmentos em um lenço de laboratório estéril para secá-los. Depois de secos, corte os segmentos em pedaços. Transfira as peças cortadas usando pinças para uma placa de seis poços preenchida com quatro mililitros de solução de digestão pré-aquecida por poço.Incube a placa a 37 graus Celsius por 50 minutos e agite suavemente a placa manualmente a cada 20 minutos. Em seguida, transfira as peças usando uma pipeta de Pasteur para um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com quatro mililitros de DMEM. Agite o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos por segundo durante um minuto para obter uma suspensão de célula única.Filtre a suspensão através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 700 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Eliminar o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet de células em cinco mililitros de SFB/PBS a 2%.Após centrifugar a suspensão mais uma vez a 700 g por cinco minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 12 mililitros de meio de cultura. Por fim, semeie a suspensão celular em placas de seis poços. Após a dissociação do mesênquima, os telócitos perdem suas características celulares, apresentando morfologia celular arredondada, e refletem menor número de células positivas para GFP no primeiro dia em comparação com os dias seguintes.Alguns dias depois, os telócitos exibem uma morfologia celular pequena e esticada com processos celulares curtos. Após sete a 10 dias de semeadura, os telócitos recuperam suas características celulares, apresentando morfologia celular grande e esticada com processos citoplasmáticos longos. A citometria de fluxo revela a composição celular.No geral, 69% das células isoladas foram viáveis com base na coloração DAPI. Destes, 60,9% representaram contaminação epitelial e células imunes e endoteliais. A fração telocita dispersou-se acima de 100k e 70k FSC e SSC, respectivamente, e representou quase 10% do mesênquima fechado.A análise da FACS revelou que o subgrupo de telócitos pode ser definido pela coloração positiva para CD201 e GP38. A imunomarcação de mesênquima cultivado em um dia usando esses marcadores mostrou expressão desses marcadores moleculares, apesar de as células não exibirem suas características celulares. Este procedimento resulta em uma suspensão unicelular viável de células estromais, que pode ser usada não apenas para cultura 2D, mas para qualquer outra aplicação, como co-cultura 3D com organoides ou bioimpressão.

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